祝洪艷，張力娜，林海成，王月珍，王國(guó)麗，趙 巖，郜玉鋼，張連學(xué)

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

酸棗仁皂苷回流提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

祝洪艷1，張力娜1，林海成1，王月珍2，王國(guó)麗1，趙 巖1，郜玉鋼1，張連學(xué)1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

【目的】 采用中心組合試驗(yàn)-響應(yīng)面法優(yōu)選酸棗仁皂苷的最佳回流提取工藝，為酸棗仁皂苷提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)?！痉椒ā?采用HPLC-UV檢測(cè)酸棗仁皂苷A和B的含量，用乙醇回流提取法，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(0，30%，50%，70%，80%，95%)、液固比(8∶1，10∶1，12∶1，15∶1，20∶1)、提取時(shí)間(1，1.5，2，2.5，3 h)和提取次數(shù)(1，2，3，4)為考察因素，篩選各因素對(duì)酸棗仁皂苷提取影響的取值范圍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，用SAS(9.2)軟件建立預(yù)測(cè)模型，響應(yīng)面分析最佳提取條件?！窘Y(jié)果】 響應(yīng)面分析優(yōu)選得到的酸棗仁皂苷最佳提取工藝為：體積分?jǐn)?shù)66%乙醇，液固比12.5∶1，回流提取3次，每次1.8 h。在此條件下，酸棗仁皂苷A和B含量之和平均為 1.21 mg/g，與模型預(yù)測(cè)值(1.30 mg/g)接近?！窘Y(jié)論】 用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選的酸棗仁皂苷A和B提取工藝可信度高，皂苷含量驗(yàn)證值與模型預(yù)測(cè)值接近，模型預(yù)測(cè)效果好，工藝穩(wěn)定，可用于指導(dǎo)酸棗仁皂苷的工業(yè)化提取生產(chǎn)。

酸棗仁皂苷A；酸棗仁皂苷B；提取工藝；中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

酸棗仁(Ziziphi spinosae semen)為我國(guó)傳統(tǒng)安神中藥，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗生津之功效[1]。酸棗仁皂苷和黃酮類化合物為其主要安神作用藥效成分[2-5]，其中酸棗仁皂苷A、B和斯皮諾素分別是皂苷和黃酮類的代表性單體成分。前人對(duì)酸棗仁提取工藝的研究不多，主要采取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以比色法檢測(cè)酸棗仁總皂苷或總黃酮的含量[6-8]，也有以HPLC檢測(cè)酸棗仁皂苷A的含量[9-11]為指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選。而工藝優(yōu)選中常用的響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸方程分析最優(yōu)工藝參數(shù)，試驗(yàn)次數(shù)多，預(yù)測(cè)性較正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)好。國(guó)內(nèi)學(xué)者分別采用響應(yīng)面法優(yōu)選了酸棗仁總黃酮[12]和蛋白[13]的提取工藝，葉振梅[14]以皂苷提取物質(zhì)量為檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面法分析了酸棗仁皂苷的提取工藝。本試驗(yàn)采用中心組合設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)選酸棗仁皂苷的最佳提取工藝，采用HPLC法檢測(cè)酸棗仁皂苷A和B的含量，以兩者之和為指標(biāo)，優(yōu)選提取工藝參數(shù)，考察提取工藝的可行性，以期為酸棗仁皂苷提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料 酸棗仁購(gòu)于當(dāng)?shù)厮幍辏a(chǎn)地河北省，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥學(xué)院張連學(xué)教授鑒定為鼠李科植物酸棗[ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟種子，研磨成粉備用；酸棗仁皂苷A和酸棗仁皂苷B對(duì)照品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20120423，20120522。

1.1.2 儀 器 Agilent1260型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)，BS210S萬(wàn)分之一天平(德國(guó)SARTORIUS科學(xué)儀器有限公司)，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 HPLC-UV色譜條件 Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-水(體積比34∶66)[15]；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)204 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取酸棗仁皂苷A 2.4 mg、酸棗仁皂苷B 1.2 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為0.24 mg/mL和0.12 mg/mL的對(duì)照品貯備液。分別精密量取5.0 mL對(duì)照品貯備液置同一10 mL量瓶中混合，加甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為0.12和0.06 mg/mL的酸棗仁皂苷A、B的混合對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取酸棗仁粗粉(篩網(wǎng)孔徑為0.425 mm)5.0 g，加石油醚連續(xù)回流脫脂6 h，揮干石油醚，藥渣加梯度乙醇(體積分?jǐn)?shù)為0，30%，50%，70%，80%，95%)回流提取，提取物加50 mL水溶解，再用50 mL水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，回收溶劑即得酸棗仁皂苷提取物。提取物加甲醇溶解，定容至10 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取混合對(duì)照品溶液2，4，6，10，16，20 μL，按1.2.1中色譜條件進(jìn)樣。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，酸棗仁皂苷A和B的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算酸棗仁皂苷A和B的回歸方程為：YA=324.96XA+18.229，rA=0.999 3；YB=295.68XB+2.509 7，rB=0.999 0。酸棗仁皂苷A和B分別在進(jìn)樣量為0.48～4.80 μg和 0.24～2.40 μg時(shí)與其對(duì)應(yīng)的峰面積有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 樣品含量的測(cè)定 分別精密吸取酸棗仁皂苷A、B對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL，按1.2.1中色譜條件進(jìn)樣，分別計(jì)算供試品溶液中酸棗仁皂苷A和B的含量。

1.3 酸棗仁皂苷回流提取的單因素試驗(yàn)

1.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 精密稱取已脫脂的酸棗仁粗粉5.0 g，分別用體積分?jǐn)?shù)為0，30%，50%，70%，80%和95%的乙醇為溶劑，液(mL)固(g)比10∶1，回流提取1 h，提取1次，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)酸棗仁皂苷A和B總含量的影響。

1.3.2 液固比的影響 精密稱取已脫脂的酸棗仁粗粉5.0 g，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為溶劑，液固比分別為8∶1，10∶1，12∶1，15∶1和20∶1，回流提取1 h，提取1次，考察不同液固比對(duì)酸棗仁皂苷A和B總含量的影響。

1.3.3 提取時(shí)間的影響 精密稱取已脫脂的酸棗仁粗粉5.0 g，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為溶劑，液固比10∶1，分別回流提取1，1.5，2，2.5和3 h，提取1次，考察不同提取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷A和B總含量的影響。

1.3.4 提取次數(shù)的影響 精密稱取已脫脂的酸棗仁粗粉5.0 g，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為溶劑，液固比10∶1，回流提取1 h，分別回流提取1，2，3，4次，考察不同回流提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A和B總含量的影響。

1.4 酸棗仁皂苷提取工藝的中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以酸棗仁皂苷A和B含量之和為指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液固比(X2)和提取時(shí)間(X3)為3個(gè)因素，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)方案(表1)。采用SAS(9.2)軟件結(jié)合響應(yīng)面法分析，建立數(shù)學(xué)模型，通過(guò)嶺脊回歸分析優(yōu)選酸棗仁皂苷的提取工藝，同時(shí)采用Origin(9.0)軟件制圖，確定最佳提取工藝。以得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算酸棗仁皂苷A和B的平均含量，并與模擬結(jié)果比較，驗(yàn)證所建立的酸棗仁皂苷提取工藝的可行性。

表1 酸棗仁皂苷提取工藝的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of CCD design for jujuboside

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS(9.2)軟件進(jìn)行多元線性回歸、二次多項(xiàng)式擬合及方差分析和嶺脊分析，同時(shí)采用Origin(9.0)軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁皂苷回流提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 由圖1可見(jiàn)，用70%乙醇作為提取溶劑時(shí)，酸棗仁皂苷A和B的總含量最高；乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%時(shí)，皂苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈緩慢上升趨勢(shì)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時(shí)，皂苷含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而減少。因此，中心組合試驗(yàn)中將乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)在50%～80%。

2.1.2 液固比的影響 由圖2可見(jiàn)，酸棗仁皂苷含量隨乙醇用量增大而增加，當(dāng)液固比達(dá)到12∶1時(shí)，皂苷含量最高；液固比增加至15∶1時(shí)，皂苷含量反而有所減少；當(dāng)液固比由15∶1增加至20∶1時(shí)，皂苷含量又略有增加。分析原因可能是其他非皂苷類雜質(zhì)隨乙醇用量的增多而溶出，致使皂苷含量相對(duì)減少。同時(shí)為節(jié)約乙醇用量，中心組合試驗(yàn)將液固比設(shè)在10∶1～15∶1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酸棗仁皂苷含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on contents of jujuboside A and jujuboside B

圖2 液(mL)固(g)比對(duì)酸棗仁皂苷含量的影響Fig.2 Effect of solvent-to-solid ratio on contents of jujuboside A and jujuboside B

2.1.3 提取時(shí)間的影響 由圖3可見(jiàn)，酸棗仁皂苷含量開(kāi)始隨回流時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提取時(shí)間為2 h時(shí)含量最高，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)而略呈下降趨勢(shì)，可能是由于皂苷隨提取時(shí)間延長(zhǎng)而受熱分解，導(dǎo)致含量減少。因此，中心組合試驗(yàn)將提取時(shí)間設(shè)在1～2 h。

2.1.4 提取次數(shù)的影響 由圖4可見(jiàn)，酸棗仁回流提取3次時(shí)，酸棗仁皂苷含量最高，當(dāng)提取4次時(shí)，皂苷含量反而略有減少，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間受熱導(dǎo)致結(jié)構(gòu)破壞，從而含量下降。因此，中心組合試驗(yàn)酸棗仁皂苷提取次數(shù)設(shè)定為3次。

圖3 提取時(shí)間對(duì)酸棗仁皂苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on contents of jujuboside A and jujuboside B

圖4 提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷含量的影響Fig.4 Effect of extraction times on contents of jujuboside A and jujuboside B

2.2 酸棗仁皂苷提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表2 酸棗仁皂苷提取的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 CCD matrix and results of jujuboside A and jujuboside B

由表4可知，總模型和線性項(xiàng)對(duì)皂苷含量具有極顯著性影響，二次項(xiàng)對(duì)皂苷含量具有顯著性影響?？偰Ｐ拖嚓P(guān)系數(shù)R2=0.901 3，失擬項(xiàng)P>0.05，表明回歸方程與實(shí)測(cè)值擬合較好。

由表5可知，由回歸方程預(yù)測(cè)得到的酸棗仁皂苷最佳提取工藝為：液固比13.2∶1，體積分?jǐn)?shù)70.9%乙醇回流提取3次，每次1.9 h，在此工藝條件下，酸棗仁皂苷A和B含量之和(1.296 151)約為1.30 mg/g。

表3 酸棗仁皂苷提取工藝回歸模型參數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of coefficients in the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

注：**差異顯著，(P<0.05)； **差異極顯著，(P<0.01)。下表同。

Note:*significant difference,(P<0.05);**extremely significant difference,(P<0.01).The same below.

表4 酸棗仁皂苷提取工藝回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

表5 酸棗仁皂苷提取工藝模型的嶺脊回歸分析 Table 5 Ridge analysis for the developed regression model on the extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen

2.3 酸棗仁皂苷提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)酸棗仁皂苷A和B含量的二次回歸模型，采用Origin(9.0)軟件繪制響應(yīng)面三維空間圖和等高線圖(圖5)，以其中一個(gè)影響因素為中心值(編碼水平為0)，觀察其他兩個(gè)因素對(duì)酸棗仁皂苷A和B含量的影響。

圖5 兩兩因素交互作用對(duì)酸棗仁皂苷含量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖5可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液固比(X2)和提取時(shí)間(X3)3個(gè)因素對(duì)酸棗仁皂苷A和B總含量具有一定的影響，且兩兩因素之間均呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。當(dāng)皂苷含量達(dá)到最高時(shí)，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)抑制皂苷A和B的溶出；加大液固比也表現(xiàn)出皂苷A和B總含量有所降低的趨勢(shì)。3個(gè)響應(yīng)面圖重疊可得酸棗仁皂苷A和B的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)65.8%～77.5%，液固比(X2)12.5∶1～14.8∶1，提取時(shí)間(X3)1.8～2 h。為降低能耗，節(jié)約成本，最終確定酸棗仁皂苷的最佳提取工藝為：體積分?jǐn)?shù)66%乙醇，液固比12.5∶1回流提取3次，每次1.8 h。

2.4 酸棗仁皂苷提取最佳工藝的驗(yàn)證

以上述確定的最佳提取條件(體積分?jǐn)?shù)66%乙醇、液固比12.5∶1、回流提取3次、每次1.8 h)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到酸棗仁皂苷A和B含量之和分別為1.21，1.17，1.26 mg/g，平均含量為1.21 mg/g，與預(yù)測(cè)值(1.30 mg/g)接近，說(shuō)明所建立模型可信度高。

3 結(jié)論與討論

在本研究預(yù)試驗(yàn)中，分別采用了超聲法、滲漉法、浸漬法、復(fù)合酶提取，以及回流提取和連續(xù)回流提取等方法，結(jié)果以乙醇回流提取酸棗仁皂苷含量最高，因此，本試驗(yàn)以乙醇回流提取酸棗仁皂苷。

在單因素試驗(yàn)中，分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)酸棗仁皂苷A和B含量的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)的因素和水平，試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SAS(9.2)軟件分析得到的回歸方程與實(shí)測(cè)值擬合良好，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)效果好，經(jīng)響應(yīng)面制圖分析后，得到酸棗仁皂苷的最佳提取工藝為體積分?jǐn)?shù)66%乙醇、液固比12.5∶1、回流提取3次、每次1.8 h，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)測(cè)值略低于嶺脊分析預(yù)測(cè)值，模型預(yù)測(cè)效果好，可用于指導(dǎo)酸棗仁皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

本課題組同時(shí)還通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了酸棗仁皂苷A和B的提取工藝[16]，結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝條件為體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、液固比12∶1、回流提取2次、每次1.5 h，此條件下酸棗仁皂苷A和B的含量之和(0.834 mg/g)明顯低于本試驗(yàn)提取工藝中A和B的含量(1.21 mg/g)。且本試驗(yàn)中酸棗仁皂苷A和B的含量高于以往文獻(xiàn)報(bào)道的采用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝結(jié)果(0.774 4 mg/g)[9]。因此，運(yùn)用中心組合-響應(yīng)面法分析多因素影響的酸棗仁皂苷提取工藝，能建立更準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)模型。

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Optimization of reflux extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen by central composite design-response surface methodology

ZHU Hong-yan1,ZHANG Li-na1,LIN Hai-cheng1,WANG Yue-zhen2, WANG Guo-li1,ZHAO Yan1,GAO Yu-gang1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China; 2ChangchunMedicalCollege,Changchun,Jilin130031,China)

【Objective】 The reflux extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen was optimized by central composite design-response surface methodology to provide basis for industrial extraction of jujuboside from Ziziphi spinosae semen.【Method】 The contents of jujuboside A and B were detected by HPLC-UV,using ethanol extraction.Different ethanol concentrations (0,30%,50%,70%,80%,and 95%),solvent-to-solid ratios (8∶1,10∶1,12∶1,15∶1,and 20∶1),extraction times (1,1.5,2,2.5,and 3 h) and extraction frequencies (1,2,3,and 4) were tested to screen value ranges.Then,central composite design (CCD)-response surface methodology was used and a predictive model was developed by SAS(9.2) software to determine the optimum extraction conditions.【Result】 The optimum reflux extraction conditions were:66% ethanol,solvent-to-solid ratio 12.5∶1,and extracted for 1.8 h and 3 times.The average content of jujuboside A and B was 1.21 mg/g,which was close to the model prediction (1.30 mg/g).【Conclusion】 CCD-response surface methodology for optimizing the reflux extraction of jujuboside A and B was reliable,and the detected content of jujuboside was close to the predicted value. The predicted extraction process was also stabled and could be used to direct the industrialized extraction of jujuboside.

jujuboside A;jujuboside B;extraction;CCD-response surface methodology

時(shí)間:2015-10-13 08:46DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.031

2014-08-28

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303111)；科技部科技支撐項(xiàng)目(2011BAI03B01)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20126046)；吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2011-Z25)；吉林省教育廳“十二五”項(xiàng)目(2014第60號(hào))

祝洪艷(1982-)，女，吉林長(zhǎng)春人，講師，博士，主要從事中藥研究與開(kāi)發(fā)。E-mail:popzhy@163.com

張連學(xué)(1955-)，男，吉林長(zhǎng)春人，教授，博士，主要從事藥用植物栽培研究。E-mail:zlxbooksea@163.com

S665.109.9；R284.2

A

1671-9387(2015)11-0207-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.062.html