趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

43份菊芋種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

趙孟良，孫雪梅，王麗慧，李 莉

(青海省農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心 青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

【目的】 探明國(guó)內(nèi)外菊芋(HelianthustuberosusL.)資源間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及遺傳多樣性。【方法】 以40份國(guó)外菊芋資源與3個(gè)國(guó)內(nèi)栽培品種為材料，選用14條引物進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記分析，分析他們的遺傳多樣性，利用POPGENE32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比率(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。采用NTSYS 2.10軟件計(jì)算品種間的相似系數(shù)，進(jìn)行聚類分析，并對(duì)不同類群的形態(tài)學(xué)主要特點(diǎn)進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】 采用14條引物對(duì)43份菊芋資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得203個(gè)標(biāo)記，其中多態(tài)性標(biāo)記199個(gè)，多態(tài)性比率為98.0%。采用POPGENE32軟件分析，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)為1.894 8，平均 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均 Shannon’s 信息指數(shù)為0.659 0。43份菊芋資源間的相似系數(shù)為0.443～0.955。聚類結(jié)果顯示，供試的43個(gè)菊芋資源可聚為2個(gè)類群，能很好地將國(guó)外菊芋資源與國(guó)內(nèi)品種區(qū)分開來(lái)。不同類群菊芋的塊莖形態(tài)及顏色有明顯差異?！窘Y(jié)論】 國(guó)內(nèi)外菊芋資源間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且國(guó)外資源間存在豐富的遺傳多樣性。

菊芋；種質(zhì)資源；ISSR；遺傳多樣性

菊芋(HelianthustuberosusL.)又名洋姜、鬼子姜，為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)多年生草本植物，18世紀(jì)末從歐洲傳入中國(guó)，之后被人們當(dāng)作蔬菜栽培食用。菊芋具有極強(qiáng)的抗旱、抗寒、耐鹽堿能力，能夠適應(yīng)惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境。菊芋還具有極大的利用價(jià)值，國(guó)內(nèi)眾多單位已經(jīng)開展了關(guān)于菊芋的生物質(zhì)能源利用[1]、果聚糖代謝調(diào)控機(jī)理[2]、菊芋秸稈造紙[3]及飼草料加工應(yīng)用[4]等方面的研究。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于菊芋品種的選育主要是采用人工定向的方式，因此豐富的種質(zhì)資源必將是菊芋育種的先決條件。青海省農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心歷經(jīng)十余年的育種研究，已經(jīng)審定通過(guò)了青芋1號(hào)、青芋2號(hào)、青芋3號(hào)3個(gè)菊芋品種[5-7]，是目前國(guó)內(nèi)審定品種最多的菊芋研發(fā)單位，已收集、保存國(guó)內(nèi)外菊芋資源400余份。

ISSR(Inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來(lái)的一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于居群遺傳多樣性分析[8-9]、雜交后代鑒定[10-11]及分子生態(tài)學(xué)[12]研究中。在菊芋方面，本課題組已成功建立了菊芋ISSR-PCR擴(kuò)增條件及程序,并篩選出了特異性好的引物，同時(shí)利用該技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)青芋1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)3個(gè)菊芋品種進(jìn)行了快速鑒定[13-14]。因此，ISSR分子標(biāo)記在菊芋方面的應(yīng)用已較為成熟，可以利用該技術(shù)研究不同來(lái)源的菊芋資源遺傳多樣性。

本研究從青海省農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心種質(zhì)資源庫(kù)中挑選了40份國(guó)外菊芋種質(zhì)資源及國(guó)內(nèi)3個(gè)審定菊芋品種為供試材料，利用ISSR技術(shù)，對(duì)國(guó)外與國(guó)內(nèi)菊芋品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性進(jìn)行了分析，旨在為菊芋種質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為40份國(guó)外菊芋資源與3個(gè)國(guó)內(nèi)審定菊芋品種(表1)，均種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院菊芋研發(fā)中心資源圃內(nèi)。于2012-04選取幼嫩菊芋葉片,硅膠干燥后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?3份菊芋資源分別于2012-10及2013-10采收時(shí)按照菊芋觀察記載標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表1 43份菊芋種質(zhì)資源及來(lái)源Table 1 43 Helianthus tuberosus L.and their exporting countries

1.2 方 法

試驗(yàn)于2012-04-2013-09在青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.2.1 DNA提取與檢測(cè) 菊芋葉片DNA提取及檢測(cè)參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

1.2.2 引物篩選及PCR擴(kuò)增 參照韓睿等[14]的菊芋 ISSR 引物篩選結(jié)果，從中選擇擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的14條引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物名稱及序列已在表2中列出。ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照趙孟良等[13]的報(bào)道進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：1.5 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，0.5 μmol/L引物，1.0 UTaqDNA 聚合酶和50 ng模板DNA；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸75 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

凝膠圖像用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行分析，電泳圖譜的每條帶(DNA片段)均為1個(gè)分子標(biāo)記(Marker)，代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無(wú)統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)，有帶(顯性)記作1，無(wú)帶(隱性)記為0，強(qiáng)帶和弱帶均賦值，根據(jù)0，1矩陣建立43個(gè)菊芋資源的DNA指紋圖譜。利用POPGENE32軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比率(PPB)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。用NTSYS 2.10版軟件計(jì)算樣品間的相似系數(shù)，然后利用SAHN Clustering軟件的算術(shù)平均法(Unweighted pair-group method arithmetie average，UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊芋資源的ISSR分子標(biāo)記的多態(tài)性

由表2可知，14條引物對(duì)43份菊芋模板共擴(kuò)增出位點(diǎn)203個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)199個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率(PPB)達(dá)到98.0%，引物847的多態(tài)位點(diǎn)比率最低，為91.7%；14條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為9～18條，平均為14.5條，其中擴(kuò)增條帶數(shù)最少的為引物844，只有9條。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大多為300～2 000 bp。引物844的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表2 基于14條引物的43份菊芋PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 2 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on 14 primers

注：*Y 代表簡(jiǎn)并堿基C 或者 T，R 代表簡(jiǎn)并堿基A 或者 G。

Note：Y represents degenerate base C or T，and R represents degenerate base A or G.

由表3可知，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.894 8，平均Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均 Shannon’s信息指數(shù)為0.659 0。各位點(diǎn)遺傳多樣性程度也存在較大差異，Nei’s基因多樣性指數(shù)最大值為0.499，最小值為0.430 8。Shannon’s 信息指數(shù)最大值為0.693，最小值為0.308。

圖1 引物844對(duì)43份菊芋的PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DNA Marker DS5000；1～43.分別為表1中的43份菊芋資源；箭頭所示為多態(tài)性位點(diǎn)位置Fig.1 PCR amplification of 43 Jerusalem artichoke varieties based on primer 844 M.DNA Marker DS5000；1-43.the 43 of Helianthus tuberosus L.as in Table 1；The position indicated by arrows are polymorphism loci

表3 供試43份菊芋資源的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)Table 3 Nei’s gene diversity index and Shannon’s index of the tested 43 Jerusalem artichoke resources

續(xù)表3 Continued table 3

2.2 基于相似系數(shù)的供試菊芋資源ISSR聚類分析

以供試的43份菊芋資源擴(kuò)增出的203個(gè)位點(diǎn)數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得903個(gè)兩兩不同的遺傳相似系數(shù)，其中FA25與FA26的相似系數(shù)最大，為0.955，說(shuō)明這2個(gè)菊芋資源親緣關(guān)系很近；FA2與青芋2號(hào)的相似系數(shù)最小，為0.443，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從聚類圖(圖2)可以看出，以0.64為閾值可以將供試菊芋資源分為2大類群。第Ⅰ類群：40份資源，均為國(guó)外資源(占所有資源的93.02%)，對(duì)其進(jìn)一步分析，又可將第Ⅰ大類在閾值為0.784處分為7個(gè)亞類。第1亞類有30個(gè)資源，占第Ⅰ類群的75.0%；第2亞類有3個(gè)資源，分別是FA4、FA6和FA12，占第Ⅰ類群的7.5%；第3亞類有2個(gè)菊芋資源，分別是FA15和FA20，占第Ⅰ類群的5.0%；第4亞類有2個(gè)菊芋資源，分別是FD2和FD5，占第Ⅰ類群的的5.0%；第5亞類有1個(gè)菊芋資源，即FA5，占第Ⅰ類群的2.5%；第6亞類有1個(gè)菊芋資源，即FA7，占第Ⅰ類群的2.5%；第7亞類有1個(gè)菊芋資源，即FA9，占第Ⅰ類群的2.5%。第Ⅱ類群有3個(gè)菊芋品種，均為國(guó)內(nèi)審定品種，包括青芋1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)3個(gè)菊芋品種。

由以上分類可知，國(guó)外40份菊芋資源與國(guó)內(nèi)3個(gè)菊芋品種之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí)，聚類圖顯示同一地區(qū)的種質(zhì)資源優(yōu)先聚在一起，如來(lái)自中國(guó)的青芋1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)聚為一類，體現(xiàn)出一定的地域性。

2.3 不同類群菊芋種質(zhì)資源的形態(tài)學(xué)主要特點(diǎn)

在實(shí)際生產(chǎn)中，通常是通過(guò)觀察對(duì)比菊芋全生育期內(nèi)的植物學(xué)性狀，如株高、莖粗、葉形、塊莖形狀、塊莖顏色等來(lái)區(qū)分不同的菊芋資源，但最常用的最直觀的方法是通過(guò)塊莖的形狀及顏色來(lái)進(jìn)行區(qū)分。因此本研究主要從塊莖形狀及顏色對(duì)菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行分析。

第1亞類30份菊芋種質(zhì)資源中塊莖形狀主要有紡錘形、球形、瘤狀3種，其中紡錘形的包括FA1、FA23、FD3、FD6、FD9、FD10、FD13 等7種，球形的包括FA2、FA3、FA8、FA11、FA14、FA17、FA18、FA19、FA25、FA26、FD1、FD4等12種，瘤狀的包括FA10、FA13、FA16、FA21、FA22、FA24、FA27、FD7、FD8、FD11、FD12等 11種；塊莖顏色主要有白色、紅色、紫色、褐色、白褐色5種，其中白色的包括FA1、FA3、FA8、FA10、FA13、FA16、FA17、FA18、FA21、FA22、FA23、FA24、FA25、FA26、FA27、FD4、FD7、FD8、FD12等19種，紅色的包括FA2、FA11、FA14、FD1 等4種，紫色的包括FD3、FD6 2種，褐色的包括FD13 1種，白褐色的包括FA19、FD9、FD10、FD11等 4種。第2亞類3份菊芋資源塊莖形狀：FA4與FA12為紡錘形，F(xiàn)A6為球形；塊莖顏色：FA4為紫紅色，F(xiàn)A6為白褐色，F(xiàn)A12為紅色。第3亞類的2份菊芋資源塊莖形狀：FA15為紡錘形，F(xiàn)A20為球形；塊莖顏色：FA15為白褐色，F(xiàn)A20為紅色。第4亞類中的2份菊芋資源塊莖形狀均為瘤狀，塊莖顏色均為白色。第5亞類中FA5塊莖為紡錘形，顏色為白色。第6亞類中FA7塊莖為棒狀，顏色為紅色。第7亞類中FA9塊莖為紡錘形，顏色為白褐色。

圖2 基于相似系數(shù)的43份菊芋資源的UPGMA聚類結(jié)果
Fig.2 Similarity coefficient based UPGMA clustering of the 43HelianthustuberosusL.resources

3 討 論

3.1 國(guó)外菊芋資源遺傳多樣性分析

豐富的菊芋種質(zhì)資源是菊芋育種的基礎(chǔ)，而探明親本材料的遺傳多樣性程度和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近是育種的關(guān)鍵[16]。目前，ISSR標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到種質(zhì)遺傳多樣性和遺傳差異檢測(cè)的研究中[17-18]。本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了國(guó)外40份菊芋資源與國(guó)內(nèi)3個(gè)菊芋品種之間的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。結(jié)果表明，供試的43份菊芋資源平均有效等位基因數(shù)為1.894 8，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.467 7，平均Shannon’s 信息指數(shù)為0.659 0；43份菊芋資源間的相似系數(shù)為0.443～0.955，說(shuō)明ISSR標(biāo)記技術(shù)完全能夠應(yīng)用于菊芋資源遺傳多樣性分析研究。

因此，根據(jù)本研究的結(jié)果，在今后菊芋育種過(guò)程中可以利用遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)的資源進(jìn)行雜交，創(chuàng)制新的菊芋種質(zhì)。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，來(lái)源相同的菊芋資源如FA5、FA7和FA9單獨(dú)聚為一類，下一步可以通過(guò)增加ISSR引物、優(yōu)化試驗(yàn)條件來(lái)深入探討這些菊芋資源間的遺傳多樣性[19]。

3.2 菊芋遺傳距離與地理距離的相關(guān)性

國(guó)外40份菊芋資源與國(guó)內(nèi)的3個(gè)菊芋資源間的遺傳距離較國(guó)內(nèi)品種間的遺傳距離大，具有較高的遺傳多樣性，其中部分資源可以作為新的育種材料加以利用。另外，各供試材料在種質(zhì)遺傳距離與來(lái)源地的關(guān)系上表現(xiàn)出了很強(qiáng)的相關(guān)性，聚類結(jié)果顯示，國(guó)內(nèi)與國(guó)外菊芋種質(zhì)資源未聚為一類，說(shuō)明國(guó)外菊芋資源與國(guó)內(nèi)菊芋品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.3 菊芋聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果的差異

對(duì)40份國(guó)外菊芋資源的聚類分析結(jié)果與根據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行分類的結(jié)果部分吻合，說(shuō)明二者具有一定的相關(guān)性[20]。供試的一部分菊芋資源從形態(tài)學(xué)上分類不屬于一類，但是在基于ISSR 標(biāo)記的聚類分析中被劃分到同一類中，例如第Ⅰ大類中的第2亞類FA6與FA12，二者塊莖形狀一致但顏色不同，在基于ISSR標(biāo)記分析的聚類樹狀圖中二者親緣關(guān)系較近并聚在一起，在第1亞類中同樣有類似的情況出現(xiàn)。這一方面說(shuō)明傳統(tǒng)的形態(tài)分類方法不能完全反映出菊芋資源間的親緣關(guān)系，必須結(jié)合分子標(biāo)記等其他生物學(xué)方法進(jìn)行完善；另一方面說(shuō)明可以適當(dāng)增加ISSR引物做進(jìn)一步的篩選分析。

本研究首次利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來(lái)自國(guó)外的菊芋群體資源與國(guó)內(nèi)審定的3個(gè)菊芋品種進(jìn)行了親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)與國(guó)外菊芋資源間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，且國(guó)外資源間存在豐富的遺傳多樣性。因此，在今后的育種工作中可以依據(jù)遺傳多樣性分析和聚類結(jié)果進(jìn)行親本選擇，避免人力物力資源的浪費(fèi)，為后續(xù)菊芋資源的可持續(xù)性開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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ISSR based genetic diversity of 43HelianthustuberosusL.

ZHAO Meng-liang,SUN Xue-mei,WANG Li-hui，LI Li

(ResearchandDevelopmentCenterofJerusalemArtichoke,QinghaiKeyLaboratoryofVegetableGeneticsandPhysiology,QinghaiAcademyofAgricultureandForestry,Xining,Qinghai810016,China)

【Objective】 This study aimed to clarify genetic relationship and genetic diversity of Jerusalem artichoke resources at home and abroad. 【Method】 A total of 40 foreignHelianthustuberosusL. resources and 3 domestic varieties were used as experimental material,and 14 primers were adopted for ISSR molecular marker analysis to analyze their genetic diversity.POPGENE32 software was used to calculate ratio of polymorphic loci (PPB),effective number of alleles (Ne),Nei’s genetic diversity index (H),and Shannon’s information index (I) while NTSYS 2.10 software was used to calculate similarity coefficient between varieties,conduct clustering analysis,and analyze the morphological characteristics of different groups.【Result】 A total of 203 marks were obtained when using 14 primers to amplify the 43 Jerusalem artichoke resources by PCR amplification.199 polymorphism markers were polymorphic markers with the polymorphism rate of 98.0%.POPGENE32 software analysis showed that averaged effective number of alleles,Nei’s genetic diversity index,and Shannon’s information index,of the 43HelianthustuberosusL.resources were 1.894 8,0.467 7,and 0.659 0,respectively,while NTSYS showed that and the similarity coefficient was 0.443 to 0.955.Clustering analysis showed that 43HelianthustuberosusL.【Conclusion】 The genetic relationship ofHelianthustuberosusL.resources between domestic and abroad was far,and the foreign resources had abundant genetic diversity.

HelianthustuberosusL.;germplasm resources;ISSR;genetic diversity

時(shí)間:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.021

2014-03-05

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2013-Z72)；青海省科技廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2012-H-809)

趙孟良(1986-)，男，河南商丘人，碩士，助理研究員，主要從事菊芋遺傳育種及生理生化研究。 E-mail：zhaomengliang@qhu.edn.cn

李 莉(1959-)，女，江蘇豐縣人，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜遺傳育種及栽培生理研究。 E-mail：yyslili@163.com

S330

A

1671-9387(2015)09-0150-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.042.html