洋蔥Ms位點多重PCR標(biāo)記的開發(fā)與優(yōu)化

王振寶+霍雨猛+劉冰江+繆軍+楊妍妍+高莉敏+孔素萍+程斐+陳寧+吳雄

摘要：以本課題組已獲得的洋蔥Ms位點側(cè)翼序列為基礎(chǔ)，設(shè)計、篩選引物獲得了一個兼容的多重PCR分子標(biāo)記，并對其反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的擴(kuò)增體系：10×PCR buffer （Mg2+ free） 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L dNTP 6 μL、DNA模板1 μL （約50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL、用滅菌雙蒸水補齊至25 μL；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。優(yōu)化后的體系和程序可以檢測到清晰的目的條帶，通過一次PCR反應(yīng)即可鑒定Ms位點的3種基因型（MsMs、Msms、msms），操作簡單，穩(wěn)定性好。

關(guān)鍵詞：洋蔥；雄性不育；Ms位點；多重PCR標(biāo)記

中圖分類號：S633.203.6文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）09-0007-05

洋蔥（Allium cepa L.）為兩年生二倍體（2n=2x=16）蔬菜植物，廣泛種植于世界各地。于近代傳入我國，適應(yīng)性強(qiáng)，耐貯藏和運輸，具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值[1]，發(fā)展迅速。

洋蔥是世界上最早利用雄性不育選育雜交種的蔬菜作物之一，其雄性不育根據(jù)細(xì)胞質(zhì)的類型可分為S型和T型。在S型雄性不育系統(tǒng)中，不育性是由單個核基因和細(xì)胞質(zhì)基因共同控制，并且不育性狀可被顯性核基因（Ms）恢復(fù)。在洋蔥細(xì)胞質(zhì)育性鑒定上，國內(nèi)外多個研究團(tuán)隊已成功開發(fā)出了幾種鑒定細(xì)胞質(zhì)類型的分子標(biāo)記[2～6]，這些分子標(biāo)記能夠使育種者在幾小時內(nèi)鑒定洋蔥細(xì)胞質(zhì)的類型，不需要進(jìn)行4～8年的測交驗證。在洋蔥育性恢復(fù)基因研究上，由于洋蔥基因組DNA巨大（17.9 pg，15 290 Mbp/C）[7]，是玉米基因組的6倍、番茄的16倍、擬南芥的107倍[8]，國內(nèi)外研究進(jìn)展緩慢，所開發(fā)的分子標(biāo)記均具有各自的優(yōu)缺點[9～12]，很難應(yīng)用于多樣性遺傳背景親本材料基因型的鑒定，也無法滿足育種過程高通量篩選的需要。

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔥姜蒜研究中心于2013年開發(fā)了兩個分別與顯性Ms和隱性ms等位基因共分離的SCAR標(biāo)記，分別為DNF-566和RNS-357[13]。這兩個標(biāo)記已通過2個BC1群體、29個育種系和7個雜交種的驗證，所鑒定的基因型與表型完全一致。但這兩個標(biāo)記需要兩次PCR檢測，才可確定Ms位點的基因型。

本試驗在前期研究的基礎(chǔ)上[13]，擬篩選出洋蔥Ms位點兼容的多重PCR分子標(biāo)記，然后進(jìn)行擴(kuò)增體系和程序的優(yōu)化，開發(fā)通過一次PCR試驗即可鑒定洋蔥Ms位點基因型（MsMs、Msms、msms）的PCR檢測系統(tǒng)，進(jìn)而用于洋蔥雄性不育系及保持系的選育，加速洋蔥育種系及雜交種選育進(jìn)程，提高選育效率。

1材料與方法

1.1供試材料

洋蔥新鮮葉片采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆?。驗證標(biāo)記所用群體為回交群體[118 ×（118×12-12）]，118為雄性不育系，12-12為對應(yīng)恢復(fù)系。

1.2基因組總DNA的提取

洋蔥基因組總DNA的提取采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生物，北京），方法參照操作說明書。

1.3引物設(shè)計

本研究所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。UM1、DM1、UM2、DM2為根據(jù)Ms側(cè)翼序列設(shè)計的引物，Um1、Dm1、Um2、Dm2為根據(jù)ms側(cè)翼序列設(shè)計的引物（表1）。設(shè)計引物時確保引物的3′端為多態(tài)性位點。

1.4引物組合

顯性Ms位點側(cè)翼序列2對引物（UM1、DM1和UM2、DM2）與隱性ms位點側(cè)翼序列2對引物（Um1、Dm1和Um2、Dm2）分別組合（表2），先在標(biāo)準(zhǔn)體系下對MsMs、Msms、msms 3種基因型單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇能擴(kuò)增出目的單倍型的引物組合進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化。

1.5試驗設(shè)計

1.5.1標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系及程序PCR反應(yīng)總體積為25 μL，其中基因組DNA 1 μL（約50 ng），10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL（終濃度為1.5 mmol/L），2.5 mmol/L dNTP 3 μL（終濃度為0.3 mmol/L），4條10 μmol/L引物均為1 μL（終濃度為0.4 μmol/L），5 U/μL rTaq 0.2 μL（終用量為1 U），用滅菌雙蒸水補齊至25 μL。擴(kuò)增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃保溫10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照記錄。

1.5.2多重PCR反應(yīng)體系及程序的優(yōu)化在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系及程序的基礎(chǔ)上，先后對Mg2+濃度、dNTP濃度及凍融次數(shù)、最佳退火溫度、DNA聚合酶及模板DNA的用量進(jìn)行了優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1不同引物組合的篩選

兩對顯性Ms等位基因特異性引物與兩對隱性ms等位基因特異性引物分別組合，共獲得4個組合（表2）。4個引物組合在標(biāo)準(zhǔn)體系下，擴(kuò)增MsMs、Msms、msms 3種基因型的洋蔥，結(jié)果（圖1）表明，只有引物UM2、DM2與Um2、Dm2的組合（即多重PCR標(biāo)記MK4）在3種不同基因型材料中都擴(kuò)增出了特征帶（Ms：905 bp，ms：661 bp），MK1和MK2幾乎沒有Ms的特征條帶，MK3在Msms基因型材料中Ms特征條帶擴(kuò)增效率低。因此，選擇MK4進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化。endprint

2.2Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

Mg2+是Taq酶活性所必需的，濃度過低時，Taq酶活性顯著下降，無特異條帶或特異條帶擴(kuò)增不明顯，濃度升高時，Taq酶活性增強(qiáng)，擴(kuò)增效率提高。隨著Mg2+濃度的增加，在接近一定數(shù)值時，由于出現(xiàn)高鹽抑制現(xiàn)象，擴(kuò)增條帶亮度減弱。本研究設(shè)計了8個Mg2+終濃度梯度，分別為1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L，由圖2可以看出，Mg2+濃度在3～6 mmol/L時，擴(kuò)增的目的條帶均較清晰，因此后續(xù)試驗采用4 mmol/L MgCl2。

2.3dNTP濃度及凍融次數(shù)對PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的原料，其濃度是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的重要因素，并且其凍融次數(shù)對多重PCR的擴(kuò)增有較明顯的影響。在優(yōu)化得到4 mmol/L Mg2+濃度下，設(shè)置兩個dNTP終濃度（0.3、0.6 mmol/L），同時對dNTP母液的凍融次數(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果（圖3）表明，在1～2次凍融次數(shù)（1T～2T）下，均可檢測到清晰明亮的擴(kuò)增產(chǎn)物，隨著凍融次數(shù)的增加（3～4次，3T～4T），擴(kuò)增效率逐漸降低。在較低的dNTP濃度下，這種現(xiàn)象更加明顯。高濃度的dNTP在一定程度上可以彌補因凍融次數(shù)增加而造成的PCR擴(kuò)增效率降低的現(xiàn)象。為確保檢測體系的穩(wěn)定性，選用0.6 mmol/L dNTP用于后續(xù)試驗。

2.4退火溫度對多重PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

退火溫度是影響PCR反應(yīng)的重要條件之一，同時它也具有相對的靈活性。在優(yōu)化得到的4 mmol/L Mg2+和0.6 mmol/L dNTP濃度條件下，對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在55℃到68℃之間共設(shè)了8個溫度梯度。結(jié)果（圖4）表明，較低的退火溫度不會影響PCR反應(yīng)，當(dāng)溫度超過65.4℃，隱性ms等位基因擴(kuò)增效率逐漸降低，當(dāng)溫度達(dá)到68.0℃時，無擴(kuò)增，而顯性Ms等位基因仍存在有效擴(kuò)增。為確保顯性和隱性等位基因都能夠產(chǎn)生高特異性的有效擴(kuò)增，退火溫度選擇65.4℃。

2.5DNA聚合酶的量對PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

在上述優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行rTaq DNA聚合酶加入量的優(yōu)化，共設(shè)置了8個rTaq梯度，分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 U。結(jié)果表明，在設(shè)定的范圍內(nèi)，均可以擴(kuò)增出目的條帶，隨著rTaq DNA聚合酶加入量的增加，PCR擴(kuò)增效率逐漸增強(qiáng)（圖5）。為了兼顧擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性和試驗成本，選擇3.0 U rTaq聚合酶進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.6模板DNA的加入量對PCR結(jié)果的影響

對于一個穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增體系，DNA模板的濃度在一定范圍內(nèi)并不是影響擴(kuò)增條帶強(qiáng)弱的主要因素，因此本研究在1 μL DNA模板（約50 ng）濃度下，先確定主要影響因素，然后設(shè)計了7個模板梯度，分別為：0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL，同時以水為陰性對照（CK）。結(jié)果表明，模板濃度較低時，擴(kuò)增效率較低，隨著模板濃度的增加，擴(kuò)增效率越來越高，在設(shè)定的模板濃度梯度范圍內(nèi)，未對PCR反應(yīng)造成抑制（圖6）。因此，選擇1.0 μL模板DNA加入量進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.7優(yōu)化后的體系和程序

通過對擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序的優(yōu)化建立了顯性Ms和隱性ms等位基因的多重PCR分子標(biāo)記（MK4）檢測系統(tǒng)。25 μL PCR擴(kuò)增體系包括2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ free），4 μL 25 mmol/L的MgCl2 （終濃度為4 mmol/L）、6 μL 2.5 mmol/L的dNTP（終濃度為0.6 mmol/L）、DNA模板1 μL （約50 ng）、10 μmol/L的引物各1 μL（終濃度為0.4 μmol/L）、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL（終用量為3 U），用滅菌雙蒸水補齊至25 μL，退火溫度為65.4℃，35個循環(huán)。對MsMs、Msms、msms 3種基因型洋蔥育種系進(jìn)行擴(kuò)增（圖7），結(jié)果表明，3種基因型的材料，均得到了清晰可見的目的條帶，擴(kuò)增結(jié)果與基因型完全相符。

為了驗證開發(fā)優(yōu)化的MK4標(biāo)記，對239株BC1分離群體進(jìn)行單株檢測。結(jié)果表明，所有的可育單株均可擴(kuò)增出905、661 bp兩條帶，而所有不育單株均只擴(kuò)增出661 bp條帶（圖8），標(biāo)記檢測結(jié)果與表型完全相符。因此，確定開發(fā)的MK4標(biāo)記能夠用于田間材料的鑒定。

3結(jié)論與討論

本研究通過引物篩選、體系和程序優(yōu)化獲得了一個可同時檢測顯性Ms和隱性ms等位基因的多重PCR分子標(biāo)記MK4（UM2、DM2、Um2、Dm2）；PCR擴(kuò)增體系為10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL、2.5 mmol/L的dNTP 6 μL、模板DNA 1 μL（約50 ng）、10 μmol/L引物各1 μL、5 U/μL rTaq聚合酶0.6 μL，用滅菌雙蒸水補齊至25 μL；擴(kuò)增程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65.4℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。該分子標(biāo)記系統(tǒng)可以通過一次PCR試驗鑒定3種Ms座位基因型（MsMs、Msms、msms）的洋蔥材料，擴(kuò)增結(jié)果與基因型完全相符。

多重PCR反應(yīng)體系和程序與普通PCR極為類似，除了考慮各組分間的比例及退火溫度外，還應(yīng)首先考慮多重PCR引物間的兼容性，引物的兼容性不好，就會造成擴(kuò)增效率極低甚至無擴(kuò)增，無法檢出相關(guān)的等位基因；第二，應(yīng)該特別注意dNTP的凍融次數(shù)，隨著凍融次數(shù)的增加，擴(kuò)增效率降低，然而高濃度dNTP可以部分抵消因凍融次數(shù)造成的擴(kuò)增效率降低的現(xiàn)象；第三，本研究未對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，原因為終濃度為0.4 μmol/L時，兩個等位基因在表觀上的檢測亮度基本相似，未出現(xiàn)擴(kuò)增嚴(yán)重不平衡的現(xiàn)象。但在其它多重PCR的開發(fā)和應(yīng)用中，可以通過調(diào)整待檢測位點的引物濃度，調(diào)節(jié)擴(kuò)增條帶的亮度，進(jìn)而達(dá)到便于鑒定識別的目的。endprint

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