超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中的檸檬苦素

汪建紅，廖立敏，王 碧，劉 騰

1內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院;2 四川省高等學(xué)?！肮悘U棄物資源化”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川內(nèi)江 641112

四川安岳是中國(guó)主要檸檬生產(chǎn)基地之一，被稱為“中國(guó)檸檬之鄉(xiāng)”，現(xiàn)有檸檬種植面積20 萬畝以上，年產(chǎn)鮮果25 萬噸以上，產(chǎn)量占全國(guó)檸檬總產(chǎn)量的70%［1］。但由于缺乏相應(yīng)的后處理手段，大量的檸檬皮等被作為垃圾直接丟棄，既造成了資源的浪費(fèi)，又污染了環(huán)境。檸檬皮中含有大量的檸檬苦素等活性成分，檸檬苦素具有抗炎、殺蟲、抗癌、抗HIV等作用［2，3］。將檸檬苦素用于食品等領(lǐng)域，可充分發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也可緩解對(duì)環(huán)境的壓力，引起人們極大關(guān)注。

常用的檸檬苦素的提取方法有水提法［4］、有機(jī)溶劑法［5］、微波輔助法［6］、超聲波法［7］、超臨界流體萃取法［8］、雙水相萃取法［9-11］等。水提法提取時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低;有機(jī)溶劑法操作過程中會(huì)用到部分的有毒有害的有機(jī)溶劑，污染提取物;微波輔助法用到的微波會(huì)對(duì)人體構(gòu)成較大的危害;超臨界流體萃取法，提取效率高，但設(shè)備較復(fù)雜，能耗大，成本高;超聲波法提取時(shí)間短，提取效率高;雙水相萃取法憑借雙水相體系的分相特性，一方面可在較低有機(jī)溶劑濃度的條件下獲得和較高相同有機(jī)溶劑濃度時(shí)一樣的提取效果，一方面還可實(shí)現(xiàn)易溶于該有機(jī)溶劑的成分和易溶于水的成分的同時(shí)溶解，使提取體系固液易于分離，也便于下一步的水溶性和油溶性成分的分離，并且該方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，幾乎不存在有機(jī)溶劑殘留問題。

本文就結(jié)合了超聲波和雙水相萃取法兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，利用超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中的檸檬苦素，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)低溶劑用量、較好的提取效果、容易分離固液兩相及水溶性和油溶性成分的目的。傳統(tǒng)的聚合物-聚合物、聚合物-無機(jī)鹽等雙水相體系粘度大、難處理，且需反萃取，而乙醇-硫酸銨雙水相體系分相穩(wěn)定，粘度小，操作簡(jiǎn)便，條件溫和，選用試劑無毒，且處理簡(jiǎn)便［12，13］。因此本實(shí)驗(yàn)選擇此體系提取檸檬皮中的檸檬苦素，并通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)考察了超聲波處理溫度、處理時(shí)間、乙醇濃度、料液比、硫酸銨用量、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，確定了超聲波輔助雙水相提取檸檬皮中檸檬苦素的最佳工藝條件，并與相同條件下不使用雙水相體系和單純只使用雙水相體系時(shí)的提取情況進(jìn)行了比較，為天然產(chǎn)物中有效成分提取探索了一條新的途徑。

1 材料與設(shè)備

1.1 試劑與材料

檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)級(jí)純;硫酸銨、乙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛、硫酸、三氯化鐵，均為分析純;檸檬，購自四川安岳。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BT-224S 電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);TDL-5-A 型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);T-6 新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)方法［10］，配制顯色劑溶液及濃度為0.20 mg/mL 的檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為500 nm。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出其線性回歸方程為A=7.20C-0.0025，R2=0.9962。

2.2 檸檬苦素的提取與測(cè)定

檸檬苦素的提取:取低溫烘干的檸檬皮粉末2.00 g 于250 mL 圓底燒瓶中，按照設(shè)定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液和一定量的硫酸銨;先在設(shè)定的溫度下在確定的超聲波功率下處理一定時(shí)間，然后移去超聲波清洗器，在設(shè)定的提取溫度下繼續(xù)回流提取一定時(shí)間，抽濾，對(duì)濾液進(jìn)行減壓濃縮至干，用無水乙醇溶解并定容到25 mL 容量瓶中。

檸檬苦素的測(cè)定:準(zhǔn)確移取上述提取液2.00 mL 于50 mL 帶刻度比色管中，用無水乙醇稀釋至25.00 mL，加入5 mL 顯色劑混合溶液，顯色30 min后，在500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到提取液濃度。檸檬苦素得率按照下式計(jì)算:

式中，Et 為得率(%);C 為測(cè)得的提取液濃度(g/mL);V 為提取液體積(mL);n 為稀釋倍數(shù)，m為原料的質(zhì)量(g)。

2.3 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

由于所使用的超聲波發(fā)生器的功率無法調(diào)節(jié)，所以功率是固定的400 W。在硫酸銨用量、乙醇用量、超聲波處理溫度、處理時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間分別為8 g，30 mL，30 ℃，40 min，40 ℃，1 h 的條件下，選擇不同體積濃度(20%、30%、40%、50%、60%)，重復(fù)上述操作。

2.4 超聲波處理溫度對(duì)提取效果的影響

在超聲波功率400 W，超聲波處理時(shí)間40 min，提取溫度40 ℃，硫酸銨用量8 g，乙醇用量30 mL，提取時(shí)間1 h 及上一步確定的乙醇濃度的條件下，選擇不同超聲波處理溫度(30、45、60、75 ℃)，重復(fù)上述操作。

2.5 超聲波處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響

在超聲波功率400 W，恒定的乙醇濃度和超聲波處理溫度，提取溫度40 ℃，硫酸銨用量8 g，乙醇用量30 mL，提取時(shí)間1 h 的條件下，選擇不同超聲波處理時(shí)間(20、30、40、50 min)，重復(fù)上述操作。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

方法［10］，在確定的乙醇體積濃度、超聲波處理溫度、超聲波處理時(shí)間的情況下，以硫酸銨用量、提取溫度、料液比(m檸檬皮∶V乙醇)、提取時(shí)間為考察因素設(shè)計(jì)L16(44)正交表，并按照此正交表安排實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)3 次平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)上述操作。

3 結(jié)果與討論

3.1 乙醇濃度、超聲波處理溫度和處理時(shí)間對(duì)提取效果的影響

乙醇濃度、超聲波處理溫度和時(shí)間對(duì)檸檬苦素的提取效果影響較大，如圖1 所示。

圖1 乙醇體積濃度(A)、超聲波處理溫度(B)及超聲波處理時(shí)間(C)對(duì)檸檬苦素提取的影響Fig.1 Effects of ethanol volume concentration (A)，ultrasonic treatment temperature (B)and ultrasonic treatment time (C)on the extraction yield of limonin

從圖1 的折線(A)可知，檸檬苦素得率隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加，這是由于乙醇體積濃度增加，也增加了雙水相體系上層的乙醇濃度，檸檬苦素在乙醇中的溶解度遠(yuǎn)大于在水中［10］。當(dāng)乙醇體積濃度達(dá)到60%后，若繼續(xù)增加乙醇濃度，則會(huì)有大量晶體從雙水相體系析出，并且也難以形成穩(wěn)定的雙水相體系，影響檸檬苦素的提取。綜合考慮這些因素，選擇最佳乙醇體積濃度60%。

據(jù)圖1 的折線(B)可知，檸檬苦素得率隨超聲波處理溫度的上升而上升，60 ℃時(shí)達(dá)到最大，此后繼續(xù)提高處理溫度，檸檬苦素得率出現(xiàn)了一定程度的下降。這是由于處理溫度上升，使超聲波破壞檸檬皮組織的破壁能力增強(qiáng)，檸檬苦素更易浸出;但在超聲波的作用下，過高的處理溫度會(huì)導(dǎo)致檸檬苦素因氧化或被超聲波破壞等因素變質(zhì)的量增加，也會(huì)增加乙醇揮發(fā)量。綜合考慮節(jié)約能源和檸檬苦素得率這些因素，選擇最佳超聲波處理溫度為60 ℃。

從圖1 的折線(C)可知，檸檬苦素得率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，30 min 時(shí)達(dá)最大值，此后繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，檸檬苦素得率出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。這是由于時(shí)間越長(zhǎng)，超聲波對(duì)檸檬皮細(xì)胞壁組織的破壞程度就越大，更有利于檸檬苦素的釋放和進(jìn)入溶液;過長(zhǎng)的處理時(shí)間也會(huì)增加被超聲波破壞和被氧化變質(zhì)的檸檬苦素的量。綜合考慮這些因素，選擇最佳處理時(shí)間為30 min。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

在乙醇體積濃度為60%、超聲波處理溫度60℃，超聲波處理時(shí)間30 min 的條件下，設(shè)計(jì)L16(44)正交表，并按照此正交表安排實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 L16(44)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 L16(44)orthogonal experimental design and results

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

從表1 可看出，檸檬皮中檸檬苦素的得率受到了溫度、提取時(shí)間、料液比和硫酸銨用量這4 個(gè)因素的交叉影響，各因素影響的主次次序?yàn)榱蛩徜@用量＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。最佳水平組合為A4B3C2D2，即采用硫酸銨用量12 g，檸檬皮和乙醇的料液比1 ∶20 g/mL，提取時(shí)間3 h，提取溫度50℃。

為了進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)因子的可信度，對(duì)檸檬皮中檸檬苦素得率的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析見表2。從表2 可看到，在檸檬皮所選擇提取工藝正交實(shí)驗(yàn)所選取的因素和水平范圍內(nèi)，因素A、B、C、D 的影響均未達(dá)到顯著水平，即硫酸銨用量、檸檬皮和乙醇的料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)檸檬皮中檸檬苦素的提取影響不顯著。而F 值結(jié)果表明，方差分析結(jié)果與直觀的極差分析結(jié)果一致。

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果檸檬皮中檸檬苦素得率分別為 0.3092%、0.2941%、0.3634%，平均值0.3222%，這與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3.3 幾種提取方法的比較

表3 幾種提取方法下的檸檬苦素提取情況對(duì)比Table 3 Comparison of extraction results of limonin using different methods

從表3 可知，使用雙水相體系提取檸檬苦素時(shí)提取體系固液分離容易，不使用雙水相體系時(shí)分離較困難;使用超聲波輔助提取時(shí)檸檬苦素得率較高;而超聲波輔助雙水相體系提取時(shí)，既具有提取體系固液分離容易的優(yōu)點(diǎn)，檸檬苦素得率也較高，因此超聲波輔助雙水相提取檸檬苦素確實(shí)是一種很有發(fā)展前途的提取方法。

4 結(jié)論

本文通過設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得出了超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系的實(shí)驗(yàn)中，影響檸檬皮中檸檬苦素得率指標(biāo)的因素大小順序?yàn)?硫酸銨用量＞料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度;提取的最佳工藝條件為:乙醇體積濃度60%，超聲波處理溫度60 ℃，超聲波處理時(shí)間30 min，硫酸銨用量12 g，檸檬皮和乙醇的料液比1∶20 g/mL，提取溫度50℃，提取時(shí)間3 h。通過平行實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證可知，該方法不但得率較高，而且實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，也說明正交實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論是正確的。同其他方法相比，超聲波輔助雙水相提取法具有操作簡(jiǎn)便，得率高，分離容易等優(yōu)點(diǎn)。該研究結(jié)果對(duì)于天然產(chǎn)物中有效成分的提取研究具有一定的參考價(jià)值。

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