大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸藥代動(dòng)力學(xué)研究

吳 磊陸 超居文政

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029）

大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸藥代動(dòng)力學(xué)研究

吳 磊1，2陸 超1居文政1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029）

目的：建立大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后血漿中咖啡酸、綠原酸的UPLC-MS/MS測(cè)定方法，并用于其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究。方法：SD大鼠6只，灌胃清熱養(yǎng)心顆粒2g/kg，以阿魏酸為內(nèi)標(biāo)，用UPLC-MS/MS法測(cè)定給藥后血漿中的藥物濃度，并用DAS1.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：咖啡酸、綠原酸的線性范圍分別為25～800ng/mL（r=0.9965）、11.25～1440ng/mL（r=0.9949）。方法學(xué)考察均符合要求。日內(nèi)、日間變異系數(shù)（RSD）均小于9.8%，精密度和準(zhǔn)確度等均符合生物樣品分析的要求。大鼠體內(nèi)咖啡酸藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：T1/2β為（180.42±25.54）min，AUC0-t為（155397.53±3059.14）ng·min·mL-1，Cmax為（729.43±24.56）ng/mL；綠原酸藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：T1/2β為（115.94±16.12）min，AUC0-t為（191710.99±7263.26）ng·min·mL-1，Cmax為（1110.32±115.33）ng/mL。結(jié)論：建立的UPLC-MS/MS分析方法準(zhǔn)確靈敏，適于咖啡酸、綠原酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

清熱養(yǎng)心顆粒 綠原酸 咖啡酸 藥代動(dòng)力學(xué) UPLC-MS/MS SD大鼠

清熱養(yǎng)心顆粒是江蘇省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有清熱解毒、養(yǎng)心安神的功效。此方由金銀花、黃連、酒黃精、百合、山豆根、甘草等組成，臨床可用于治療邪毒侵心型、心氣虛弱型和氣陰兩虛型病毒性心肌炎[1-3]。酚酸類(lèi)成分為清熱養(yǎng)心顆粒中主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，清熱養(yǎng)心顆粒中咖啡酸、綠原酸等酚酸類(lèi)成分有顯著的抗炎、抗氧化、抗凝血等多種生物活性[4-6]，且綠原酸也是該制劑的指標(biāo)性成分[7]。但有關(guān)清熱養(yǎng)心顆粒有效成分藥代特性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為深入了解清熱養(yǎng)心顆粒藥代動(dòng)力學(xué)行為，本研究建立了清熱養(yǎng)心顆粒中酚酸類(lèi)成分綠原酸和咖啡酸血藥濃度檢測(cè)方法，方法穩(wěn)定、可靠，成功應(yīng)用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥 清熱養(yǎng)心顆粒 （江蘇省中醫(yī)院醫(yī)院制劑，批號(hào):201203001、201207002、201307001）；對(duì)照品咖啡酸（批號(hào):110885-200102）、綠原酸（批號(hào): 110753-200413）和阿魏酸（批號(hào):110773-201313）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。水為超純水，甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀；Agilent G6430 LC-MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI）；色譜工作站:MassHunter；AE240電子天平 （上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；WH-2微型旋渦混合儀 （上海滬西分析儀器廠）；Drict-Q5超純水機(jī)（法國(guó)Millipore公司）。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，6只，體質(zhì)量250～270g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK（浙）2008-0033。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件 Agilent ZOBAX SB C18色譜柱 （2.1mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相:甲醇（2mmol/L）-醋酸銨水溶液（80∶20）；流速:200μL/min；柱溫:35℃。離子源:ESI；離子化模式:負(fù)離子；定量模式:多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓:3500V；干燥氣溫度:400℃；綠原酸的Fragmentor及CE值分別為90V、10V；咖啡酸的Fragmentor及CE值分別為90V、10V；阿魏酸的 Fragmentor及 CE值分別為80V、10V；檢測(cè)對(duì)象:綠原酸m/z 353→m/z 191；咖啡酸m/z 179→m/z 135；阿魏酸m/z 193.1→m/z 134.0。2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取適量綠原酸對(duì)照品，用甲醇定容，配制成濃度為1.40mg/mL的儲(chǔ)備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成112.5、450、900、3600、14400ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱(chēng)取適量咖啡酸對(duì)照品，用甲醇配制成濃度為1.60mg/mL的儲(chǔ)備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成250、500、2000、4000、8000ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以上溶液于4℃保存，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制 精密稱(chēng)取適量阿魏酸對(duì)照品，用甲醇定容并稀釋成550ng/mL，于4℃保存，備用。

2.4 血漿樣品處理 取血漿樣品100μL，加入550ng/mL阿魏酸溶液（內(nèi)標(biāo)）20μL，1mol/L鹽酸溶液50μL，渦旋30s，再加入乙酸乙酯800μL，渦旋振搖3min，12000r/min離心5min。取上清液750μL，40℃氮?dú)饬鞔蹈?，?00μL50%甲醇復(fù)溶，12000r/min離心5min，取上清液2μL進(jìn)樣分析。

2.5 給藥劑量的確定 清熱養(yǎng)心顆粒臨床給藥劑量為每次10～20g，2次/d。人的平均體重按60kg計(jì)算，則其臨床給藥劑量為0.33～0.67g/kg。按大鼠每千克體重的臨床等效量是人的6倍計(jì)算，則清熱養(yǎng)心顆粒大鼠灌胃劑量為2～4g/kg，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大鼠給藥劑量為2g/kg。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究 SD大鼠6只，給藥前12h禁食不禁水，分別口服清熱養(yǎng)心顆粒2g/kg。于給藥前及給藥后 10min、20min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、10h和 12h經(jīng)眼眶后靜脈叢取血約0.3mL，置于肝素化試管中，以 4000r/min離心10min，取上層血漿于-40℃保存待測(cè)。

2.7 數(shù)據(jù)處理 大鼠靜脈給藥后測(cè)得的血藥濃度（C）-時(shí)間（T）數(shù)據(jù)應(yīng)用DAS 1.0軟件進(jìn)行處理。選擇適宜的數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)所采用的UPLC-MS/ MS條件下，咖啡酸、綠原酸和阿魏酸的保留時(shí)間分別為1.14min、1.06min、1.16min?？Х人?、綠原酸和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)，見(jiàn)圖1。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血漿100μL，分別加入綠原酸、咖啡酸對(duì)照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL，配制成相當(dāng)于綠原酸及咖啡酸血漿質(zhì)量濃度分別為11.25、45、90、360、1440ng/mL和25、50、200、400、800ng/mL的血漿樣品。按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，取2μL進(jìn)樣分析。以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對(duì)血漿質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸回歸方程: Y=2.3419X+0.0442（r=0.9949），定量下限為10.9ng/mL?？Х人峄貧w方程:Y=4.5936X+0.3382（r=0.9965），定量下限為25ng/mL。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度 取空白血漿100μL，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下制備綠原酸和咖啡酸低、中、高3個(gè)濃度（綠原酸血漿質(zhì)量濃度為45、90、360ng/mL；咖啡酸血漿質(zhì)量濃度為50、200、400ng/mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個(gè)濃度平行做5份，連續(xù)測(cè)定3d。根據(jù)隨性標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度。實(shí)測(cè)濃度的RSD即為精密度，加入濃度和實(shí)測(cè)濃度的比值即為準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，綠原酸日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為95.2%～103.7%（RSD≤7.4%，n= 5）和92.5%～105.7%（RSD≤9.4%，n=15）；咖啡酸日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為94.5%～107.2%（RSD≤7.9%，n=5）和98.2%～108.1%（RSD≤9.8%，n=15）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品分析方法的要求。

3.4 提取回收率 取空白血漿100μL，配制“準(zhǔn)確度和精密度”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)不同濃度含藥血漿質(zhì)控樣品，按上述“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析，以血漿中綠原酸、咖啡酸的峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液中綠原酸、咖啡酸峰面積的比值計(jì)算出上述3種質(zhì)量濃度的提取回收率，每個(gè)濃度平行做5份。經(jīng)UPLC-MS/MS測(cè)定后，低、中、高3種濃度下的提取回收率分別為:綠原酸，（86.1± 3.9）%、（87.2±5.2）%和 （90.8±8.4）%；咖啡酸，（84.4±4.4）%、（87.9±5.0）%和（85.6±5.3）%。采用同樣的方法考察了內(nèi)標(biāo)的提取回收率為 （84.3± 4.6）%。

3.5 穩(wěn)定性考察 取空白血漿100μL，配制“準(zhǔn)確度和精密度”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)不同濃度含藥血漿質(zhì)控樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作方法處理樣品?？疾旌幯獫{樣品處理好后溶液中分析物在室溫放置24h、含藥血漿樣品-20℃反復(fù)凍融3次、含藥血漿樣品-40℃長(zhǎng)期冷凍28d的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度平行3份。結(jié)果表明，經(jīng)處理后的血漿樣品室溫放置24h后綠原酸及咖啡酸血藥濃度的RSD均小于9.7%，-40℃保存 28d血藥濃度的 RSD均小于10.9%，經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融周期后兩個(gè)分析物的血藥濃度RSD均小于8.7%。

圖1 樣品的液-質(zhì)聯(lián)用離子流圖（A.空白血漿樣品；B.混合對(duì)照品；C.血漿樣品；1.綠原酸；2.阿魏酸；3.咖啡酸）

3.6 介質(zhì)效應(yīng)考察 取離心管數(shù)只，分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度綠原酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液（450，900，3600ng/mL）及咖啡酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液（500，2000，4000ng/mL）各10μL，再分別加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液20μL，水60μL，旋渦1min，于12000r/min離心5min，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣量2μL，記錄峰面積A1。除不加內(nèi)標(biāo)外，另按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作提取空白血漿數(shù)管，揮干后同上操作，記錄峰面積A2。A1和A2的比值（A2/A1×100%）即為介質(zhì)效應(yīng)ME（%）。綠原酸及咖啡酸血漿樣品低、中、高3種濃度LC-MS/MS介質(zhì)效應(yīng) （n=3）分別為88.43% 、83.93% 、90.76% 和 91.36% 、93.22% 、89.46%，內(nèi)標(biāo)阿魏酸介質(zhì)效應(yīng)（n=9）為84.17%。

3.7 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué) 大鼠單劑量（2g/kg）灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后綠原酸和咖啡酸的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。所測(cè)數(shù)據(jù)使用DAS 1.0軟件進(jìn)行處理，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。由結(jié)果分析可知，綠原酸和咖啡酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)符合二室開(kāi)放模型。

表1 大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后咖啡酸和綠原酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

表1 大鼠灌胃清熱養(yǎng)心顆粒后咖啡酸和綠原酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 咖啡酸 綠原酸Cmax（ng/mL）729.43±24.561110.32±115.33 Tmax（min） 30.00±0.00 60.00±0.00 T1/2β（min） 180.42±25.54 115.94±16.12 AUC0-t（ng·min·mL-1） 155397.53±3059.14 191710.99±7263.26 AUC0-∞（ng·min·mL-1） 164351.80±3952.5731 195154.86±7437.44 MRT0-t（min） 213.67±3.35 194.24±4.84 MRT0-∞（min） 247.39±5.37 206.56±4.38 V/F/L 0.63±0.08 3.77±0.22

圖2 大鼠體內(nèi)綠原酸和咖啡酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=6）

4 討論

4.1 本文對(duì)血樣中酚酸類(lèi)成分的提取方法進(jìn)行了考察:甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯/乙醚（3∶1）提取，每個(gè)提取或沉淀?xiàng)l件考察了不同的酸化條件 （加不同量的 1mol/L鹽酸:10、20、30、50、100μL），結(jié)果發(fā)現(xiàn)50μL，1mol/L鹽酸酸化后乙酸乙酯的提取回收率高，無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，重現(xiàn)性好。

4.2 在綠原酸和咖啡酸的測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究中，目前文獻(xiàn)多數(shù)使用HPLC和LC-MS/MS方法[8-12]，但分析時(shí)間多數(shù)在5～20min之間。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠血漿中咖啡酸、綠原酸的UPLC-MS/MS測(cè)定方法，并用于其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，分析時(shí)間為2min。實(shí)驗(yàn)表明所建立的方法迅速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)研究，獲得主要成分比較全面的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了參考。

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編輯：吳 寧

R289.5

A

1672-397X（2015）05-0074-03

吳磊（1983—），男，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥臨床藥代動(dòng)力學(xué)。

居文政，主任中藥師，博士，博士生導(dǎo)師。wzhju333@163.com

2015-02-07