楊紅蓮 張 麗 段玉紅

（陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000）

越鞠丸對(duì)代謝綜合征模型大鼠的治療作用及其對(duì)肝臟AMPK-α表達(dá)的影響

楊紅蓮 張 麗 段玉紅

（陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，陜西咸陽712000）

目的：研究越鞠丸對(duì)代謝綜合征大鼠肝臟-磷酸腺苷激活的蛋白激酶-α（AMPK-α）表達(dá)的影響。方法：大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、越鞠丸大劑量組、越鞠丸小劑量組、二甲雙胍組，除正常對(duì)照組以外，其余各組用高脂飼料誘導(dǎo)代謝綜合征大鼠模型，8周后各藥物組分別灌胃相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃4周。觀察并比較各組大鼠體重、血壓與空腹血糖、血脂水平和肝臟AMPK表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、血壓、空腹血糖、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）水平明顯升高（P＜0.05），肝臟磷酸化AMPK-α（P-AMPK-α）表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，越鞠丸組大鼠血壓、空腹血糖、TG、TC、LDL-C明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），P-AMPK-α蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：越鞠丸能改善代謝綜合征大鼠代謝紊亂癥候群，其上調(diào)P-AMPK-α蛋白的表達(dá)是其可能的作用機(jī)制。

越鞠丸 代謝綜合征 肝AMPK-α 血脂 SD大鼠

代謝綜合征（MS）是多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)，是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群。本病病因病機(jī)尚不明確，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為能量代謝失衡是MS的主要病因[1]。磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)全身能量平衡的關(guān)鍵因素，不僅可以在細(xì)胞水平作為能量感受器，還可以通過激素和細(xì)胞因子來參與調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝[2-4]，提示AMPK有可能在預(yù)防機(jī)體發(fā)生代謝性疾病中起重要作用[5]。中醫(yī)認(rèn)為，“郁”是MS的核心病機(jī)，并且貫穿其病理變化的始終，對(duì)其發(fā)生發(fā)展均有影響。越鞠丸能行氣解郁，主治各種因素導(dǎo)致的郁，其所治病癥與MS十分吻合。目前臨床已將越鞠丸廣泛應(yīng)用于治療肥胖、高血壓病、糖尿病等疾病，均取得了較好的療效[6-9]。本研究試圖以AMPK為切入點(diǎn)研究越鞠丸治療MS的機(jī)理，從而為臨床上提供藥效機(jī)理明確的治療藥物。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠，體重（160±8）g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK軍2013-009號(hào)。

1.2 試劑 GLU檢測(cè)試劑盒（批號(hào)512051），TG檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)506051），TC檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)0707031），HDL-C和 LDL-C試 劑 盒 （批 號(hào)0707041、0707042），均為北京利德曼生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PVDF膜（MilliPore，USA），Rabbit Anti-AMPK Polyelonal Antibody（Cell Signaling，USA），Rabbit Anti-PhosPhor-AMPK Polyclonal Antibody（Cell Signaling，USA）。

1.3 儀器 貝克曼CX4型全自動(dòng)生化分析儀，電子天平，沈陽龍騰電子有限公司生產(chǎn)。TDL-5型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。大鼠動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x，正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.4 藥物 越鞠丸 （北京同仁堂制藥有限公司，批號(hào):131016），用萬能粉碎機(jī)粉碎，每次稱取110g用生理鹽水配置成0.42g/mL，置于冰箱4℃保存，用時(shí)溫水加熱至常溫，小劑量稀釋成0.21g/mL。鹽酸二甲雙胍片，深圳市中聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào): 1201060。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組、給藥 隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照組及造模組，正常對(duì)照組給予飼料+自來水喂養(yǎng)，造模組給予高鹽高脂飼料（普通飼料63%，豬油20%，蛋黃5%，食用鹽10%，膽固醇2%）+30%的果糖水喂養(yǎng)，造模共8周。8周后以大鼠體重、尾動(dòng)脈收縮壓、空腹血糖、血脂水平（TG、TC、LDL-C和HDL-C）為觀察指標(biāo)，確定造模成功。造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組（0.15g/kg）和越鞠丸大、小劑量組（4.2g/kg和2.1g/kg），每組10只。分組后，正常對(duì)照組繼續(xù)給予大鼠飼料+自來水，其余各組大鼠給予高鹽高脂飼料+30%果糖水。同時(shí)各藥物組按照1mL/100g灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)灌胃4周。

2.2 血清、肝組織收集 各組大鼠于末次給藥后，禁食不禁水 12h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.1mL/100g），腹主動(dòng)脈取血，取血后迅速摘取肝臟，動(dòng)脈血液室溫靜置20min，4℃，3500r/min離心10min，分離血清，分裝凍存于-80℃冰箱以備檢測(cè)生化指標(biāo)。收集肝臟，濾紙吸干，分裝于凍存管中，做好標(biāo)記迅速置于液氮罐中以備提取蛋白質(zhì)。

2.3 大鼠MS相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 麻醉取血前，稱量各組動(dòng)物體重，測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓。用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清空腹血糖、血脂水平。

2.4 肝臟組織AMPK-α、磷酸化 AMPK-α（PAMPK-α）蛋白測(cè)定 從液氮中取出約100mg肝臟組織，充分裂解，4℃、12000g×5min離心，吸取上清，采用BCA法測(cè)定肝臟組織的蛋白含量。制備8%SDSPAGE凝膠，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，染色，封閉。用抗AMPK-α抗體（1∶1000）、抗P-AMPK（Thr172）抗體、抗GAPDH抗體 （1∶3000）4℃孵育過夜；TBS-T洗滌PVDF膜3次×5min，分別用對(duì)應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗 （1∶5000），室溫孵育lh；TBS-T洗滌PVDF膜3次×5min，濾紙吸干水分，加上發(fā)光液，于暗室曝光，在X光片上顯影。Western blot結(jié)果使用光密度測(cè)量?jī)x掃描，使用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度值比較。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 治療后各組大鼠體重、血壓及血糖比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、血壓、空腹血糖均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，越鞠丸大劑量組大鼠血壓明顯降低（P＜0.05）；越鞠丸大、小劑量組及二甲雙胍組空腹血糖水平明顯降低（P＜0.05）。越鞠丸大、小劑量組大鼠體重、血壓、空腹血糖與二甲雙胍組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體重、血壓及空腹血糖比較（±s）

表1 各組大鼠體重、血壓及空腹血糖比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）體重（g）血壓（mmHg）空腹血糖（mmol/L）正常對(duì)照組10306.7±22.85100.1±8.19 5.49±0.71模型組 10 328.4±21.42△109.5±9.08△6.31±0.78△二甲雙胍組 10 312.6±17.20 105.2±7.77 5.43±0.87*越鞠丸大劑量組 10 309.7±20.67 100.6±9.49*5.48±0.77*越鞠丸小劑量組 10 315.0±24.17 106.5±12.5 5.51±0.88*

3.2 治療后各組大鼠血脂指標(biāo)比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白-膽固醇 （LDL-C）水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，越鞠丸大劑量組大鼠TG、TC、LDL-C水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），越鞠丸小劑量組TG、TC水平明顯降低（P＜0.05），二甲雙胍組TC、LDL-C水平明顯降低（P＜0.05）。越鞠丸大、小劑量組各血脂指標(biāo)與二甲雙胍組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s） mmol/L

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)比較（±s） mmol/L

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別TC HDL-C正常對(duì)照組動(dòng)物數(shù)（只） TG LDL-C 1.49±0.29 1.03±0.17 10 1.32±0.50 0.6±0.14 1.82±0.28△0.95±0.19二甲雙胍組 10 1.36±0.51 1.51±0.30*0.85±0.12 0.62±0.12*越鞠丸大劑量組 10 1.31±0.56*1.29±0.39**0.91±0.18 0.63±0.09*越鞠丸小劑量組 10 1.26±0.52*1.45±0.33*0.86±0.16 0.68±0.11模型組 10 1.80±0.43△0.73±0.11△

3.3 治療后各組大鼠肝臟AMPK-α和P-AMPK-α蛋白水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠PAMPK-α表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，越鞠丸大、小劑量組P-AMPK-α表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。越鞠丸大、小劑量組AMPK-α、PAMPK-α表達(dá)水平與二甲雙胍組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠肝臟AMPK-α和P-AMPK-α表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肝臟AMPK-α和P-AMPK-α表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） AMPK-α P-AMPK-α正常對(duì)照組10 0.92±0.17 0.94±0.22模型組 10 0.82±0.19 0.73±0.15△二甲雙胍組 10 1.00±0.25 0.88±0.18越鞠丸大劑量組 10 0.93±0.14 0.92±0.16*越鞠丸小劑量組 10 0.99±0.24 0.89±0.16*

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為素體肥胖，或飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚味，損傷脾胃，釀生痰濕，阻滯氣機(jī)，化瘀阻絡(luò)，致使MS成為以痰、瘀、熱為標(biāo)，脾腎虧虛、肝陽偏亢為本的頑證，故認(rèn)為氣郁、血郁、痰郁、火郁、濕郁、食郁是導(dǎo)致MS的主要病機(jī)。上述論述恰恰與朱丹溪“六郁”理論相一致。越鞠丸是朱丹溪根據(jù)“六郁”之說創(chuàng)立的方劑，方名“越鞠”具發(fā)越鞠郁之氣的涵義，主治氣、血、痰、火、濕、食等郁，由蒼術(shù)、香附、川芎、神曲、梔子五藥組成。香附行氣解郁，以治氣郁，為君藥；蒼術(shù)燥濕運(yùn)脾，以治濕郁；川芎活血化瘀，以治血郁；梔子清熱瀉火，以治火郁；神曲消食導(dǎo)滯，以治食郁。五味中藥可分別針對(duì)MS早期諸邪進(jìn)行協(xié)同干預(yù)。我們選用二甲雙胍作為陽性對(duì)照藥，主要因?yàn)槟壳把芯勘砻鞫纂p胍對(duì)MS具有全面的調(diào)節(jié)作用，除了具有降糖、增強(qiáng)胰島素敏感性、改善脂代謝紊亂、降低血壓等作用外[10-11]，還可以增加大鼠AMPK-α的表達(dá)及活性[12-13]。

2005年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）頒布的人MS診斷標(biāo)準(zhǔn)，即在中心型肥胖基礎(chǔ)上，伴有胰島素抵抗或空腹血糖受損/糖耐量異常、高血壓、低HDL和高LDL血癥等其中兩項(xiàng)者，判定為MS。動(dòng)物MS成模與否亦參考上述標(biāo)準(zhǔn)，其中是否符合中心型肥胖指標(biāo)主要通過測(cè)量大鼠體重和腹圍判定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、血壓、空腹血糖及血清TG、TC、LDL-C水平均顯著升高，且估測(cè)模型組大鼠腹圍大于正常對(duì)照組，提示造模成功。與模型組比較，越鞠丸大、小劑量可不同程度降低上述指標(biāo)，表明越鞠丸對(duì)MS具有一定的治療作用。

AMPK是近年發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)機(jī)體糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的重要蛋白分子。研究表明，當(dāng)AMP/ATP的比值升高時(shí)，AMPK可磷酸化激活大量的下游靶分子，從而減少ATP的利用，增加ATP的產(chǎn)生，使細(xì)胞的分解代謝增加，反之則細(xì)胞合成代謝增加。在哺乳動(dòng)物中，AMPK的組成包括α、β、γ三個(gè)亞單位，是一個(gè)三聚體結(jié)構(gòu)。其中α亞單位起催化作用，而β和γ亞單位起調(diào)節(jié)作用。α亞單位的數(shù)個(gè)位點(diǎn)均可被磷酸化，其中蘇氨酸172位點(diǎn)及其磷酸化對(duì)AMPK活性的調(diào)節(jié)起重要作用[14]。研究中所檢測(cè)的總AMPK及活性AMPK蛋白通常是指其α亞單位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織P-AMPK-α蛋白表達(dá)水平明顯下降；與模型組比較，越鞠丸大、小劑量組P-AMPK-α表達(dá)水平均明顯升高，表明越鞠丸對(duì)P-AMPK-α蛋白表達(dá)水平具有一定的干預(yù)作用。

近年來，諸多醫(yī)者雖有使用越鞠丸治療MS并取得比較滿意的臨床效果，然而至今尚未有學(xué)者能夠闡明越鞠丸治療MS的作用機(jī)制。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，越鞠丸各劑量組可不同程度降低MS大鼠血壓、空腹血糖、血脂水平，增加MS大鼠肝臟組織P-AMPK-α蛋白表達(dá)，故初步推測(cè)越鞠丸通過激活A(yù)MPK防治MS的發(fā)生發(fā)展。課題組下一步將圍繞AMPK及其信號(hào)通路深入研究越鞠丸治療MS的作用機(jī)理，從而為臨床防治MS提供藥效顯著、作用機(jī)理明確的有效中藥。

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R589.905

A

1672-397X（2015）05-0077-03

楊紅蓮（1980—），女，藥學(xué)博士，副主任藥師，研究方向：防治代謝性疾病的中藥研究。465134440@qq.com

2014-12-12

編輯：吳 寧

陜西省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目計(jì)劃（12JK1030）