當(dāng)歸補血湯預(yù)處理對缺氧損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制研究

周春剛 李 卿 湯 加 徐 辰 張志斌

（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室，江蘇無錫214062）

當(dāng)歸補血湯預(yù)處理對缺氧損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制研究

周春剛 李 卿 湯 加 徐 辰 張志斌

（無錫市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室，江蘇無錫214062）

目的：觀察當(dāng)歸補血湯抗心肌細(xì)胞缺氧損傷的作用，并探討其作用機制。方法：建立大鼠H9C2心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，以正常培養(yǎng)條件下的心肌細(xì)胞為正常對照組，將預(yù)先加入當(dāng)歸補血湯的細(xì)胞（當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組）在正常條件下培養(yǎng)24h，隨后與未處理細(xì)胞 （缺氧組）同時進行缺氧培養(yǎng)，Annexin V/PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）水平，RT-PCR熒光相對定量檢測缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和p53的mRNA表達水平，Western blot檢測Cyt C蛋白表達水平。結(jié)果：缺氧組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、Cyt C蛋白表達水平，p53 mRNA表達水平均明顯高于正常對照組（P＜0.05）。經(jīng)當(dāng)歸補血湯預(yù)處理的缺氧損傷心肌細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)ROS水平、Cyt C蛋白表達水平、p53 mRNA表達水平均明顯低于缺氧組（P＜0.05），HIF-1α mRNA水平明顯高于缺氧組（P＜0.05）。結(jié)論：H9C2心肌細(xì)胞缺氧損傷后細(xì)胞凋亡顯著增加。當(dāng)歸補血湯能夠抑制缺氧損傷心肌細(xì)胞凋亡，其可能通過降低p53 mRNA表達，促進HIF-1α mRNA表達等機制來減輕缺氧對心肌細(xì)胞的損傷作用。

當(dāng)歸補血湯 H9C2心肌細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 缺氧誘導(dǎo)因子 腫瘤抑制基因 體外實驗

目前研究表明，持續(xù)穩(wěn)定的缺氧刺激可使機體建立缺氧適應(yīng)，維護自身平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但是過強或長期的缺氧應(yīng)激則會導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，細(xì)胞功能嚴(yán)重受損，引發(fā)細(xì)胞凋亡，進而導(dǎo)致不可逆的中樞神經(jīng)損傷，微循環(huán)障礙，心功能下降。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補血湯能夠減輕腦缺血再灌注對大鼠神經(jīng)元的損傷，促進細(xì)胞功能恢復(fù)[1-2]。孫艷等[3]研究認(rèn)為，當(dāng)歸補血湯能夠穩(wěn)定心肌細(xì)胞線粒體膜電位，下調(diào)凋亡基因蛋白p53表達，有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，可見當(dāng)歸補血湯在不同病理條件下對組織損傷的保護作用表現(xiàn)出多靶點、多環(huán)節(jié)的特點。本研究通過建立H9C2心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，觀察缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵分子HIF-1α和p53mRNA的表達，探討當(dāng)歸補血湯抗缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的可能分子機制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞（H9C2），購自上海拜力生物技術(shù)有限公司（ATCC CRL1446）。

1.2 當(dāng)歸補血湯煎劑制備 當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅，批號101027），黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號101109），按重量5∶1組方。采用水提醇沉法，將上述精制中藥加生理鹽水溶解，以稀鹽酸調(diào)pH值至7.2～7.4，采用DMEM高糖培養(yǎng)基定容后生藥量為50mg/mL（原液），再以孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 DMEM高糖（GIBCO 11995065），胎牛血清 （GIBCO 6010159），3S柱式細(xì)胞總RNA抽提試劑盒 （上海博彩生物科技有限公司 K362），MTT［3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍，江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司 C0009］，Annexin V/PI雙染凋亡檢測試劑盒 （美國 BD 556547），SYBR Prime Script RT-PCR KitⅡ試劑盒（TAKARA RR820A），BCA蛋白定量試劑盒 （江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司 P0010），GAPDH單克隆抗體 （聯(lián)科生物 Mab 5465），Cyt C多克隆抗體（bioss bs-0013R），羊抗兔二抗（bioworlde BS13278）。

1.4 儀器 流式細(xì)胞儀（美國BD），Light Cycler480熒光定量PCR儀（德國Roche），二氧化碳三氣培養(yǎng)箱（美國 Thermo 3131），二氧化碳普通培養(yǎng)箱（美國Thermo 371），Smart Spec Plus分光光度計 （美國BIO-RAD）。

2 實驗方法

2.1 缺氧模型的建立 取對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔接種10×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24h，棄去細(xì)胞上清液，更換DMEM無糖無血清培養(yǎng)基，然后置入37℃，含94%N2、5%CO2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h即為缺氧。實驗設(shè)正常對照組:細(xì)胞始終在正常培養(yǎng)條件下，37℃、5%CO2的普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺氧組:正常培養(yǎng)條件下，37℃、5% CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后缺氧條件下培養(yǎng)；當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組:正常培養(yǎng)條件預(yù)先加入當(dāng)歸補血湯500μg/mL，37℃、5%CO2的普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，與缺氧組同時進行缺氧培養(yǎng)。

2.2 AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡Annexin V/PI染色的試劑準(zhǔn)備、染色及分析過程嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

2.3 DCFH-DA熒光探針流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇 （ROS）水平 細(xì)胞收集后懸浮于熒光探針DCFH-DA（無血清DMEM 1∶1000稀釋）中，終濃度為10μmol/L。細(xì)胞濃度為1×106/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min,每隔3～5min顛倒混勻一次，用無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。Rosup（50mg/mL）作為活性氧陽性對照。

2.4 RT-PCR實時熒光相對定量分析 H9C2細(xì)胞總RNA采用3S柱式細(xì)胞總RNA抽提試劑盒，按照試劑盒上操作步驟完成總RNA的提取。在吸光度260nm處測定RNA濃度，樣本RNA濃度范圍10～30ng/μL，260/280nm OD比值范圍在1.2～1.9之間。RNA提取物-80℃保存。管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因引物序列見表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。采用溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物的特異性，相對定量分析采用△△CT法[4]。

2.5 Western blot檢測 H9C2心肌細(xì)胞Cyt C蛋白水平 細(xì)胞蛋白定量采用碧云天BCA蛋白定量試劑盒，取細(xì)胞蛋白提取液上清，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉1.5h后分別將膜放入雜交袋中加入一抗 （1∶300稀釋），封口，室溫下孵育1h，4℃過夜。用1×TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的二抗孵育1.5h，并以GAPDH（1∶500稀釋）單克隆抗體作為內(nèi)參對照。采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以靶蛋白/GAPDH吸光度比值反映靶蛋白水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5軟件，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析進行組間差異顯著性分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組H9C2細(xì)胞凋亡率比較 H9C2心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h，心肌細(xì)胞凋亡率為（14.24± 2.74）%，而缺氧培養(yǎng)24h后細(xì)胞凋亡率為（61.12± 17.07）%，2組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)當(dāng)歸補血湯預(yù)處理后再行缺氧培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡率為（28.13±4.82）%，明顯低于缺氧組（P＜0.05）。

3.2 各組H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較 正常對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平為 （0.71±0.15）%，缺氧組為（19.45±4.11）%，明顯高于正常對照組（P＜0.05）；當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組ROS水平（9.36±1.84）%，明顯低于缺氧組（P＜0.05）；活性氧陽性對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平為（40.62±8.60）%。

3.3 各組H9C2心肌細(xì)胞Cyt C蛋白表達水平比較 結(jié)果見圖1。缺氧組Cyt C/GAPDH吸光度比值為 （0.74±0.11），明顯高于正常對照組的 （0.20± 0.06），表明缺氧組Cyt C蛋白表達水平明顯高于正常對照組 （P＜0.05）；當(dāng)歸補血湯組Cyt C/GAPDH吸光度比值為（0.47±0.05），表明Cyt C蛋白表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）。

3.4 各組H9C2心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、p53 mRNA表達水平比較 見表2。

4 討論

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征

圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞Cyt C蛋白表達水平比較

表2 各組H9C2心肌細(xì)胞HIF-1α和p53的mRNA表達水平比較

通過缺氧誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，缺氧24h后心肌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加，Cyt C蛋白水平顯著升高。研究表明，細(xì)胞缺氧條件下，線粒體是ROS產(chǎn)生的主要來源，二者互為因果，ROS異常增多就會影響線粒體的氧化磷酸化而降低細(xì)胞內(nèi)ATP的合成，引起線粒體膜通透性的改變，誘導(dǎo)Cyt C釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。當(dāng)歸補血湯預(yù)處理細(xì)胞缺氧損傷后，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，細(xì)胞內(nèi)ROS及Cyt C蛋白水平亦顯著降低，表明當(dāng)歸補血湯能夠減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞內(nèi)ROS生成，提高心肌細(xì)胞耐缺氧能力，抑制細(xì)胞凋亡。

研究認(rèn)為，缺氧誘導(dǎo)凋亡與依賴HIF-1信號途徑相關(guān)，但是在缺氧過程中是促凋亡還是抗凋亡作用可能是HIF-1和p53相互作用的結(jié)果[5]。p53和HIF-1都是調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)的主要分子。p53作為腫瘤抑制基因，在維護染色體基因組的穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用，是DNA損傷和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達參與細(xì)胞缺氧的應(yīng)答反應(yīng)。正常條件下，p53蛋白半衰期短，維持低水平狀態(tài)，缺氧狀態(tài)下p53蛋白穩(wěn)定性增加，活性增強，促進促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄[6]。HIF-1是氧代謝的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，缺氧條件下誘導(dǎo)包括糖代謝、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)等多種信號通路相關(guān)蛋白的表達，使機體產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答。HIF-1α亞基的活化和表達是HIF-1生物活性決定因子，正常氧含量條件下，HIF-1α蛋白不斷合成并降解，始終維持低水平的動態(tài)平衡狀態(tài)，缺氧狀態(tài)下，HIF-1α與HIF-1β形成穩(wěn)定的二聚體誘導(dǎo)靶基因的活化表達[7]。

通過檢測HIF-1α和p53 mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，在缺氧模型中，p53 mRNA表達顯著上調(diào)，而HIF-1α mRNA并沒有出現(xiàn)明顯升高，甚至出現(xiàn)一定程度的降低。研究表明，低氧或缺氧條件下，線粒體DNA是受ROS和Cyt C攻擊破壞的重要靶分子，線粒體DNA氧化損傷亦導(dǎo)致p53基因高表達[8]，p53在調(diào)節(jié)HIF-1活性方面起關(guān)鍵作用，p53表達增高，抑制HIF-1活性，降解HIF-1α[9]。而通過對死亡受體和線粒體等凋亡途徑的關(guān)鍵基因表達研究發(fā)現(xiàn)，Bax基因、Fas/Fas L基因及caspase蛋白酶家族基因mRNA表達水平均沒有明顯改變 （另文報道），而p53 mRNA上調(diào)和Bcl-2 mRNA下調(diào)表達最明顯，我們推測，p53在缺氧誘導(dǎo)凋亡中發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用，而HIF-1可能通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生等機制在H9C2細(xì)胞缺氧模型中發(fā)揮保護性作用。當(dāng)歸補血湯預(yù)處理后，p53 mRNA表達顯著下調(diào)，HIF-1α mRNA表達則顯著上調(diào)。中藥研究亦證實黃芪、黃芪多糖和當(dāng)歸多糖在不同條件下均能下調(diào)p53表達，從而抑制細(xì)胞凋亡[10-12]。以上結(jié)果表明當(dāng)歸補血湯能夠通過調(diào)節(jié)HIF-1α mRNA和p53 mRNA表達等機制，提高缺氧損傷心肌細(xì)胞存活能力，下一步將對缺氧損傷藥物干預(yù)后HIF-1α及p53蛋白下游調(diào)節(jié)ROS相關(guān)的靶基因做深入研究，進一步明確當(dāng)歸補血湯抗缺氧應(yīng)激損傷的機制。

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R289.5

A

1672-397X（2015）07-0083-03

周春剛（1974—），免疫學(xué)碩士，副主任技師，主要從事心血管病診斷技術(shù)研究。

張志斌，生物化學(xué)碩士，主任技師。491073429@qq.com

2015-04-18

編輯：吳 寧

江蘇省無錫市科技局科技支撐發(fā)展項目（CSE01N1224）