丑佳文 趙立宏 董 佳 王希勤

(南華大學(xué)電氣工程學(xué)院,湖南 衡陽(yáng) 421001)

金標(biāo)免疫層析測(cè)定是一種快速診斷技術(shù)，是利用抗原、抗體特異性規(guī)律和膠體金顯色原理工作的[1]。因其具有簡(jiǎn)單、快速、可靠及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品安全檢測(cè)及環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域。但在其應(yīng)用過(guò)程中也暴露出了一些不足，如待測(cè)樣品抗原與試條測(cè)試線上抗體的特異性結(jié)合和膠體金顯色屬動(dòng)態(tài)過(guò)程，終止反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且背景易受水、膠體金及滲透不均勻等的干擾，這些因素均制約了膠體金免疫層析試條的進(jìn)一步發(fā)展。近幾年，隨著電子信息技術(shù)和生物技術(shù)的發(fā)展，可用于對(duì)金標(biāo)試條進(jìn)行半定量、全定量檢測(cè)的定量檢測(cè)儀引起了國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究人員的重視，并且一些定量檢測(cè)儀也相應(yīng)出現(xiàn)。

目前，定量檢測(cè)儀主要采用的方法有光纖掃描法、線陣CCD掃描法和圖像測(cè)量法。光纖掃描法需要有機(jī)械掃描裝置帶動(dòng)光纖傳感器掃描，缺點(diǎn)是儀器體積大而笨重；且在較低濃度下，由于反射光強(qiáng)度變化很弱，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果穩(wěn)定性差。線陣CCD掃描法只是用冷陰極熒光燈和線陣CCD傳感器代替光纖掃描法中的發(fā)光二極管和光纖傳感器，沒(méi)有去掉機(jī)械掃描裝置，體積仍然大且笨重?；趫D像測(cè)量法設(shè)計(jì)的金標(biāo)試條檢測(cè)儀能夠利用圖像處理技術(shù)直接處理掉采集圖像中的瑕疵和毛刺，并且不會(huì)受到水分引起的動(dòng)態(tài)干擾的影響，不需要步進(jìn)電機(jī)，可以通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)高速處理，能夠短時(shí)間、高質(zhì)量地完成大量試條的定量測(cè)量。圖像測(cè)量法信號(hào)檢測(cè)速度快，圖像處理效果好，對(duì)外界環(huán)境因素依賴(lài)小，可搭配微處理器設(shè)計(jì)，適合便攜式金標(biāo)試條分析儀的設(shè)計(jì)。目前出現(xiàn)的便攜式金標(biāo)試條檢測(cè)儀主要基于FPGA、ARM、單片機(jī)及DSP等嵌入式系統(tǒng)[2～4]，雖然體積小，但還沒(méi)有達(dá)到方便手持的程度，而且軟件開(kāi)發(fā)依賴(lài)于硬件。

綜合考慮成本、體積、重量及硬件依賴(lài)度等方面，筆者提出了一種基于Android系統(tǒng)和圖像處理相結(jié)合的手持式金標(biāo)試條定量分析儀，該分析儀既不受硬件更新?lián)Q代過(guò)快的影響，又使體積和重量得以減小、減輕，還能節(jié)約成本，縮短研發(fā)周期，為金標(biāo)試條定量檢測(cè)儀的廣泛應(yīng)用提供了可能。

1 金標(biāo)試條定量分析思路①

1.1 特征值的選取

圖像特征值的選取需要滿(mǎn)足如下要求[5]：精確地描述試條顏色特征；對(duì)條紋出現(xiàn)位置不敏感；能減少或消除不同試條的圖像條紋強(qiáng)度差異等。

當(dāng)光源采用純綠色平行光照射試條的檢測(cè)區(qū)時(shí)，根據(jù)朗伯-比爾定律A=α·L·C，可推導(dǎo)出試條控制線和測(cè)試線積分光密度(IOD)[6]：

(1)

式中I(i)和G(i)——像素i的輸出電流和灰度級(jí)；

I0和G0——背景的輸出電流和灰度級(jí)；

N——像素總數(shù)；

OD——光密度；

Φ——反射光強(qiáng)度。

IOD的絕對(duì)值依賴(lài)于試條的物理特性和用于檢測(cè)的圖像采集系統(tǒng)，由不同實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)不能通過(guò)其來(lái)進(jìn)行比較。不同的試條在相同濃度下會(huì)由于纖維特性差異、濕度影響及存儲(chǔ)條件不同等因素而表現(xiàn)出顯色差別。而且在實(shí)際測(cè)量中，由于直線傳播和散射的存在會(huì)降低反射光密度，再加上水、血液及膠體金的非均勻滲透等都會(huì)使試條上白色區(qū)域只能夠反射部分入射光。然而，所有這些影響控制線和測(cè)試線的因素是相同的[7]，因此可以采用控制線積分光密度與測(cè)試線積分光密度的相對(duì)值作為特征值，即有：

(2)

其中，下標(biāo)t、c分別代表測(cè)試線和控制線；Gt(i)和Gc(i)分別為測(cè)試線和控制線上像素i的灰度級(jí)；G0為背景的灰度級(jí)(由背景的平均灰度值表示)。

由式(1)、(2)可知，要得到積分光密度值，需要提取的直接量就是控制線、測(cè)試線和白色區(qū)域的灰度值。

1.2 圖像處理

由于獲取的圖像除了試條以外還包括大量無(wú)關(guān)部分，為了剔除無(wú)關(guān)信息、減少運(yùn)算量，必須對(duì)圖像進(jìn)行縮放，并初步提取檢測(cè)窗口。同時(shí)由于受光線及圖像采集設(shè)備等的影響，圖像中會(huì)存在一些毛刺和瑕疵，需要對(duì)圖像進(jìn)行濾波。為了獲得試條各部分的灰度信息，除了將圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖外，還需要對(duì)圖像進(jìn)行分割處理。

目前，用于金標(biāo)試條圖像分割的算法主要有模糊C均值聚類(lèi)算法、遺傳算法、基于遺傳算法的快速模糊C均值聚類(lèi)算法(FCM)、細(xì)胞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法及其優(yōu)化算法[8]等。其中C均值聚類(lèi)算法及其優(yōu)化算法的應(yīng)用比較廣泛，而筆者采用的是圖像分割效果較好的基于遺傳算法的FCM聚類(lèi)算法。

FCM聚類(lèi)算法的目標(biāo)函數(shù)、聚類(lèi)中心和隸屬度函數(shù)分別如下：

(3)

(4)

(5)

其中，uik∈[0,1]，為向量xj對(duì)聚類(lèi)i的隸屬度；c為聚類(lèi)數(shù)；‖k-vi‖為第i個(gè)聚類(lèi)中心到第j個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的距離，通常為歐氏距離；U=[uij]c×n為模糊C分割矩陣；V={vi}為聚類(lèi)中心矩陣；k的取值為0,1，…，Lmax-1；Lmax為k的級(jí)數(shù)；h(k)為k的直方圖。

遺傳算法作為一種演化計(jì)算，能有效地搜索到全局最優(yōu)解，彌補(bǔ)了FCM算法容易陷入局部最優(yōu)的缺陷。

遺傳FCM分割算法流程如下：

a. 設(shè)定種群數(shù)，初始化種群。初始化的值包括種群大小、突變概率、交叉概率和遺傳代數(shù)，再加上每個(gè)個(gè)體(染色體)的基因編碼在設(shè)定區(qū)間內(nèi)的隨機(jī)初始化；適應(yīng)度設(shè)為零。

b. 用式(5)計(jì)算每個(gè)個(gè)體的分割矩陣，并對(duì)每個(gè)個(gè)體做適應(yīng)性評(píng)價(jià)，即用公式fm=1/(1+fm)計(jì)算每個(gè)個(gè)體的適應(yīng)度。

c. 由父代種群進(jìn)化出子代種群，對(duì)當(dāng)前代(父代)進(jìn)行選擇、交叉和突變操作得到子代種群。

d. 用式(5)計(jì)算每個(gè)個(gè)體的新分割矩陣；再將新分割矩陣代入式(4)中，計(jì)算新的聚類(lèi)中心(即染色體)；計(jì)算新、舊聚類(lèi)中心的距離。

e. 如果滿(mǎn)足結(jié)束條件，即聚類(lèi)中心距離小于設(shè)定值或循環(huán)次數(shù)達(dá)到更新代數(shù)值，則停止循環(huán)并計(jì)算適應(yīng)度和選擇最佳個(gè)體，返回分割矩陣；如果不滿(mǎn)足，重復(fù)步驟b～d，直到滿(mǎn)足結(jié)束條件為止。

算法中的聚類(lèi)數(shù)選為3，遺傳代數(shù)100，種群大小30，突變概率和交叉概率分別選為0.02和0.60，選擇操作采用的是輪盤(pán)賭選擇算法。

2 檢測(cè)儀的設(shè)計(jì)

2.1 硬件部分

考慮到檢測(cè)儀的性?xún)r(jià)比和體積，筆者采用U880F1手機(jī)和自制外殼搭建硬件平臺(tái)，用手機(jī)自帶的CMOS攝像頭和微距攝像頭采集圖像(縮小空間)。自制外殼是以實(shí)際測(cè)量尺寸為依據(jù)，利用CAD軟件構(gòu)建外殼模型，然后用3D打印技術(shù)進(jìn)行打印而得到的。頂部到中間的區(qū)域放置微距攝像頭，中間到底部之間的距離在焦距范圍內(nèi)，底部有一個(gè)用于放置試條的槽，由于不同試條的寬度有差別，所以槽的寬度設(shè)有一定的余量。用于照明的兩個(gè)LED光源放在試條槽上方一定距離處，且位置相對(duì)。

2.2 軟件部分

2.2.1人機(jī)交互程序

人機(jī)交互程序模塊主要在Android系統(tǒng)中設(shè)計(jì)用戶(hù)界面、接收用戶(hù)操作指令并做出相應(yīng)的動(dòng)作。Java程序調(diào)用手機(jī)攝像頭，獲取并存儲(chǔ)試條圖像，然后提取圖像通過(guò)jni進(jìn)行本地調(diào)用傳給OpenCV的C/C++程序進(jìn)行分析處理，處理結(jié)果回傳至Java主程序進(jìn)行顯示。主要實(shí)現(xiàn)內(nèi)容為：調(diào)用攝像頭拍攝試條圖像并保存，調(diào)用所采集的圖片傳給圖像處理程序進(jìn)行處理，接收處理結(jié)果并進(jìn)行顯示。此部分用Java語(yǔ)言在Eclipse中編寫(xiě)實(shí)現(xiàn)。人機(jī)交互程序流程如圖1所示。

圖1 人機(jī)交互程序流程

2.2.2圖像處理程序

圖像處理程序使用C++編寫(xiě)OpenCV程序，編譯環(huán)境為Visual Studio，圖像處理程序流程如圖2所示。載入所得試條圖像后對(duì)其進(jìn)行縮放，提取感興趣區(qū)域。然后對(duì)所得圖像進(jìn)行濾波，將其轉(zhuǎn)換為灰度圖。對(duì)所得灰度圖進(jìn)行閾值化、形態(tài)學(xué)操作，提取輪廓。再次提取感興趣區(qū)域生成新圖片，然后用遺傳FCM聚類(lèi)算法進(jìn)行聚類(lèi)，得到控制線、測(cè)試線和背景區(qū)的灰度值(特征值)，計(jì)算RIOD，代入設(shè)計(jì)好的關(guān)系函數(shù)中得到相應(yīng)的濃度值。

圖2 圖像處理程序流程

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與分析

為了得到相對(duì)積分光密度-濃度關(guān)系曲線，以人絨毛膜促性腺激素HCG試條為例。將HCG溶液分別稀釋成10、35、75、100、150、200、300、400、500mIU/mL不同等級(jí)濃度的試液。然后將等量的以上試液分別滴定到相同數(shù)量、相同批次的HCG試條上，并嚴(yán)格控制試液用量。反應(yīng)5min后，用自制檢測(cè)儀測(cè)量它們的積分光密度值，測(cè)試數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 HCG試條的測(cè)試數(shù)據(jù)

用曲線擬合方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，可得到相對(duì)積分光密度值與濃度之間的關(guān)系式為：

RIOD=0.0023C+0.1165

(6)

以濃度為橫坐標(biāo)，以RIOD為縱坐標(biāo)繪制關(guān)系曲線如圖3所示。

圖3 RIOD與HCG濃度之間的關(guān)系曲線

由圖3可以看出，檢測(cè)結(jié)果對(duì)HCG濃度有較好的區(qū)分等級(jí)。將RIOD與濃度的關(guān)系模型存入程序中，實(shí)際測(cè)試時(shí)，程序自動(dòng)將RIOD值轉(zhuǎn)換成濃度值并顯示在儀器界面上。

4 結(jié)束語(yǔ)

以手機(jī)及其自帶攝像頭搭建了金標(biāo)試條定量檢測(cè)儀，該儀器外觀小巧，方便手持的同時(shí)操作簡(jiǎn)單、成本低廉。采用基于遺傳算法的快速模糊C均值聚類(lèi)算法對(duì)預(yù)處理后的金標(biāo)試條圖像進(jìn)行分割，能夠精確提取試條的測(cè)試線和控制線，通過(guò)計(jì)算試條測(cè)試線和控制線的相對(duì)積分光密度值來(lái)確定待測(cè)液樣本的濃度值，從而實(shí)現(xiàn)金標(biāo)免疫層析試條的定量檢測(cè)。實(shí)際HCG檢測(cè)結(jié)果表明，采用該檢測(cè)儀得出的RIOD與濃度之間的關(guān)系是一一對(duì)應(yīng)的，對(duì)被測(cè)液濃度有較好的區(qū)分等級(jí)。該檢測(cè)儀用于定量檢測(cè)金標(biāo)試條具有可行性。

[1] 陳曦,馮璐,劉帥,等.膠體金層析試條測(cè)試儀的設(shè)計(jì)研究[J].河北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,38(4)：66～69.

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