牛 芳，謝 菲，張 健，吳韶平，李小鵬，王志英，曹傳旺*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江西省林業(yè)有害生物防治檢疫局，江西南昌 330038)

2種取代苯對花翅搖蚊毒性和細(xì)胞色素P450酶活性的影響

牛 芳1，謝 菲2，張 健1，吳韶平1，李小鵬1，王志英1，曹傳旺1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.江西省林業(yè)有害生物防治檢疫局，江西南昌 330038)

[目的]明確取代苯類污染物對水生昆蟲毒性及細(xì)胞色素P450酶活性的影響。[方法]運(yùn)用藥液培養(yǎng)法和酶活性測定法分析了對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲毒性及細(xì)胞色素P450酶活體和離體活性的影響效應(yīng)。[結(jié)果]對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲的24 h半數(shù)致死濃度(LC50)分別為38.65和78.43 mg/L。對氯苯酚對花翅搖蚊4齡幼蟲體內(nèi)P450酶活性作用主要表現(xiàn)為隨作用時間增加抑制作用減小；而對苯二胺則主要表現(xiàn)為隨作用濃度增加誘導(dǎo)作用增強(qiáng)。對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲離體P450酶活性的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為466.15和594.43 mg/L。[結(jié)論]花翅搖蚊細(xì)胞色素P450可作為監(jiān)測對氯苯酚和對苯二胺水體污染的參考生物化學(xué)標(biāo)志物。

花翅搖蚊；對氯苯酚；對苯二胺；細(xì)胞色素P450；毒性；活性

取代苯作為一類環(huán)境有機(jī)污染物，主要以工業(yè)廢液等形式排放到江、河、湖、海等水體生態(tài)系統(tǒng)中[1]，一方面對水生生物造成直接危害，另一方面通過污染水生態(tài)環(huán)境對水生生物的生長發(fā)育造成不可逆的影響，從而進(jìn)一步通過食物鏈傳遞和遷移危及到人和牲畜的健康[2-3]。對氯苯酚廣泛用于化學(xué)工業(yè)，是我國優(yōu)先控制污染物[4]。對苯二胺是目前使用最廣泛的氧化型染發(fā)劑的重要成分之一，與雙氧水混合氧化后形成大分子色素使頭發(fā)永久性著色[5]。探討對氯苯酚和對苯二胺在生物體內(nèi)的代謝途徑和生物的應(yīng)激解毒機(jī)制，尋找生物標(biāo)志物監(jiān)測該類污染物間接為保證人類健康提供參考。

細(xì)胞色素P450酶系作為生物標(biāo)志物，因其可催化體內(nèi)多種反應(yīng)(環(huán)氧化作用、O-脫羥基作用、N-脫羥基作用)，可代謝包括殺蟲劑、多環(huán)芳烴、鹵化烴等約25萬種外源性化合物[6]，尤其是生物體內(nèi)P450酶系活性變化常用于環(huán)境污染物的監(jiān)測[7]。搖蚊是一種水生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在且數(shù)量眾多的底棲生物，具有容易飼養(yǎng)、生命周期短、對外界環(huán)境污染物暴露敏感等特點(diǎn)，被廣泛用于水體污染物致毒機(jī)理和污染監(jiān)測的靶標(biāo)生物[8]?；ǔ釗u蚊(Chironomuskiinensis)隸屬于雙翅目(Diptera)搖蚊科(Tendipedidea)，為完全變態(tài)昆蟲，是搖蚊中的優(yōu)勢種。國內(nèi)外對紅裸須搖蚊(Propsilocerusakamusi)生物標(biāo)記物的研究報道較多，而有關(guān)花翅搖蚊生物標(biāo)記物以及解毒酶系的研究鮮有報道。筆者以花翅搖蚊為對象，在測定了對氯苯酚和對苯二胺對搖蚊幼蟲急性毒性基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了2種取代苯對細(xì)胞色素P450酶活性的影響，旨在探討細(xì)胞色素P450作為監(jiān)測取代苯污染物的生物化學(xué)標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試?yán)ハx?；ǔ釗u蚊初始種群來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理與毒理實(shí)驗(yàn)室，在室內(nèi)用暴曬除氯3 d以上的自來水進(jìn)行飼養(yǎng)，每7 d換一次水和投喂1～3 g金魚幼蟲飼料(產(chǎn)品成分：進(jìn)口魚粉、南極蝦粉、植物蛋白、維生素、礦物質(zhì)以及氨基酸)，采用50目紗網(wǎng)罩住以防止成蟲飛出，自然光照飼養(yǎng)。挑選健壯、顏色、大小一致的4齡幼蟲用于試驗(yàn)。

1.1.2主要試劑?？捡R斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(BSA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、丙基硫氧嘧啶(PTU)、還原性輔酶Ⅱ(NADPH)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；磷酸二氫鈉、濃鹽酸、氯仿、乙醇、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。對硝基苯甲醚、對硝基苯酚和對氯苯酚(含量99%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對苯二胺(含量98.5%)購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 方法

1.2.1搖蚊急性毒性測定。采用藥液培養(yǎng)法。將對氯苯酚和對苯二胺用DMSO配制成10 000 mg/L母液，再用蒸餾水配成6～7個濃度梯度，以蒸餾水為空白對照，將供試搖蚊4齡幼蟲放入盛有50 ml藥液的透明塑料杯中，每處理20頭，每濃度3次重復(fù)，觀察搖蚊的中毒癥狀并及時挑出死亡個體，分別于6、12、24、48 和96 h統(tǒng)計死亡數(shù)，以探針觸動搖蚊尾部對機(jī)械刺激無反應(yīng)者視為死亡。

1.2.2致毒處理。將對氯苯酚和對苯二胺用DMSO配制成10 000 mg/L母液，再用蒸餾水稀釋成1、10和100 μmol/L 的應(yīng)用液。隨機(jī)挑取25頭健康、顏色、大小一致的花翅搖蚊4齡幼蟲放入50 ml應(yīng)用液中，不含取代苯蒸餾水作為對照，每個濃度14個處理，處理24和72 h各更換一次藥液，分別于6、12、24、48、72、96 h隨機(jī)挑取40頭花翅搖蚊4齡幼蟲，濾紙吸收蟲體表面藥液后，液氮迅速冷凍，立即或放入-80 ℃冰箱內(nèi)用于P450酶活性測定。

1.2.3細(xì)胞色素P450酶活性測定。取花翅搖蚊4齡幼蟲40頭置于5 ml玻璃勻漿器中，加入4 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L DTT、1.0 mmol/L EDTA、1.0 mmol/L PTU、1.0 mmol/L PMSF, pH 7.5)，冰上研磨充分，6 907 r/min離心15 min，上清液即為原酶液。將1 ml原酶液、800 μl 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)、100 μl 4.8 mmol/L NADPH、100 μl 20.0 mmol/L對硝基苯甲醚底物放入10 ml離心管中充分振蕩混勻，30 ℃水浴溫育30 min，加入40 μl濃鹽酸終止反應(yīng)，再加入5 ml氯仿，劇烈振蕩20 min，靜置3～5 min，1 938 r/min、4 ℃離心15 min，吸取下層清液3 ml并轉(zhuǎn)移至10 ml離心管中，加入3 ml 0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液，劇烈振蕩15 min，靜置5 min，吸取上層萃取液，于412 nm波長下測定生成對硝基苯酚OD值，空白對照組采用3 ml氫氧化鈉溶液，每個處理3次重復(fù)。測定不同濃度對硝基苯酚在412 nm波長下的OD值，根據(jù)OD值和對硝基苯酚含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品體系中對硝基苯酚的含量。根據(jù)反應(yīng)時間、對硝基苯酚的生成量和蛋白質(zhì)含量計算細(xì)胞色素P450酶比活力。蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]。

1.2.4取代苯對離體細(xì)胞色素P450酶活性的抑制。將對氯苯酚配制成濃度為10、50、100、300、500 mg/L的溶液，對苯二胺配制成濃度為10、50、100、500、900、1 000 mg/L的溶液，以蒸餾水為對照組，每個處理隨機(jī)選取40頭花翅搖蚊4齡幼蟲用于細(xì)胞色素P450酶液制備。反應(yīng)體系為1 ml原酶液、760 μl 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.5)和40 μl不同濃度的對氯苯酚或?qū)Ρ蕉啡芤?，充分混勻?0 ℃水浴5 min，再加入100 μl 4.8 mmol/L NADPH、100 μl 20.0 mmol/L對硝基苯甲醚，充分混勻后迅速放入30 ℃溫浴25 min，每個濃度3次重復(fù)，其余測定方法同“1.2.3”。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用POLO軟件計算取代苯對搖蚊幼蟲的LC50及95%置信區(qū)間。運(yùn)用GraphPad InStat軟件對同一時間不同濃度間差異采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析(P=0.05)。酶活性抑制率=(對照活性-殘留活性)/對照活性×100%。以取代苯濃度的對數(shù)值(LogM)和酶活性抑制率(%)得出濃度對數(shù)-抑制率線性回歸方程，根據(jù)方程求出抑制率為50%的取代苯濃度，即為IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲的毒性對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲半數(shù)致死濃度隨著作用時間的延長而減小，24 h半數(shù)致死濃度分別為38.65和78.43 mg/L，表明對氯苯酚對花翅搖蚊毒性大于對苯二胺(表1)。

表1 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲的急性毒性

取代苯處理時間hLC50(95%置信區(qū)間)mg/L斜率χ2(自由度)對氯苯酚671．09(61．80～82．49)4．02±0．4812．21(16)1257．60(50．30～64．78)6．97±1．173．83(16)2438．65(31．07～44．30)6．18±1．294．67(13)4819．92(15．95～23．56)6．60±1．428．24(13)9611．49(10．28～12．63)5．92±1．008．99(19)對苯二胺6316．39(260．00～374．51)4．60±0．918．35(16)1297．82(77．44～118．15)3．93±0．5812．63(18)2478．43(58．08～94．56)5．68±1．404．66(16)4838．78(27．69～47．04)7．32±1．931．37(16)9618．12(15．04～20．29)5．69±1．3311．96(22)

2.2 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲細(xì)胞色素P450酶體內(nèi)活性的影響從圖1可知，對氯苯酚處理花翅搖蚊4齡幼蟲6 h，10和100 μmol/L處理組體內(nèi)P450酶活性均低于對照，分別為對照組的0.67和0.38倍，表現(xiàn)為顯著抑制作用(P<0.05)。暴露12和24 h，搖蚊體內(nèi)P450酶活性變化相似，均低于對照組，最大抑制率分別為40.88%和70.68%。然而，處理72 h，搖蚊體內(nèi)P450酶活性均顯著高于對照(P<0.05)，表現(xiàn)為誘導(dǎo)增強(qiáng)；其中100 μmol/L對氯苯酚最大誘導(dǎo)率為54.01%。暴露96 h，搖蚊體內(nèi)P450酶活性隨濃度增加而降低，100 μmol/L對氯苯酚對P450酶活性抑制率為32.43%。對氯苯酚對花翅搖蚊幼蟲體內(nèi)P450酶活性的影響主要表現(xiàn)為隨著作用時間的增加而抑制作用減小。

由圖2可知，與對照組相比，暴露對苯二胺6～24 h，搖蚊體內(nèi)P450酶活性均顯著低于對照，表現(xiàn)為顯著抑制作用(P<0.05)，最大抑制率分別為64.94%、62.31%和55.88%。暴露48 h，1和10 μmol/L處理組P450酶活性顯著低于對照組(P<0.05)，而100 μmol/L處理組P450酶活性高于對照，表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，誘導(dǎo)率為15.80%。暴露72和96 h，搖蚊體內(nèi)P450酶活性變化相似，表現(xiàn)為低濃度抑制高濃度誘導(dǎo)作用，其中100 μmol/L對苯二胺誘導(dǎo)率分別為59.47%和29.12%。對苯二胺對搖蚊體內(nèi)P450酶活性的影響主要表現(xiàn)為隨著作用濃度和時間的增加誘導(dǎo)作用增強(qiáng)。

2.3 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊幼蟲細(xì)胞色素P450酶離體活性的影響由表2可知，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲P450酶離體活性均有抑制作用，且隨濃度的增加而增大。對氯苯酚對P450酶活性半數(shù)抑制濃度為466.15 mg/L，而對苯二胺對P450酶活性半數(shù)抑制濃度為594.43 mg/L，表明離體P450酶對對氯苯酚敏感性高于對苯二胺。

表2 對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲P450酶半數(shù)抑制濃度

取代苯半數(shù)抑制濃度mg/L方程相關(guān)系數(shù)對氯苯酚466．15y=12．58x+16．400．95對苯二胺594．43y=21．18x-8．740．94

3 討論

具有苯環(huán)的芳香烴類取代物因其良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，不易被分解或生物降解，對水體的污染毒性大且具有“三致”效應(yīng)和遺傳毒性，長期的沉積與污染會對人類健康與水生生物生長發(fā)育造成不可逆的危害[10]。環(huán)境污染物對水生生物毒性的評價一般以LC50作為評價依據(jù)。該研究結(jié)果表明，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲96 h半數(shù)致死濃度分別為11.49和18.12 mg/L。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則》[11]中對魚類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)可知，對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊屬于低毒性的污染物。對苯二胺對泥鰍(Misgurnusangullicaudatus)LC50范圍為10～100 mg/L，根據(jù)有毒物質(zhì)對魚類的急性毒性標(biāo)準(zhǔn)也屬于低毒[5]。苯環(huán)上的-H被不同取代基取代后表現(xiàn)出對生物的不同毒性差異，該研究表明6～96 h對氯苯酚的LC50均低于對苯二胺，其對氯苯酚對花翅搖蚊4齡幼蟲的急性毒性高于對苯二胺。大量研究也表明，苯酚、苯胺、氯苯和硝基苯對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的急性毒性大小為硝基苯>苯酚>氯苯>苯胺，基團(tuán)毒性大小為-NO2>-OH>-Cl>-NH2[12]。取代苯化合物對發(fā)光菌的急性毒性研究也表明不同取代基間的化合物毒性大小為對二氯苯>對苯二胺，基團(tuán)毒性大小為-Cl>-NH2[13]；同樣，6種取代芳烴化合物對發(fā)光菌的急性毒性大小為氯苯>對苯二胺>苯酚[14]，由此可見，對二氯苯與氯苯對生物的急性毒性均高于對苯二胺，當(dāng)芳香族化合物氯苯引入-OH后形成氯酚類化合物，使其極性增強(qiáng)，易與蛋白質(zhì)中的堿基作用, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的親和力, 從而提高其毒性[15]。同時，由于氯酚中含有-OH會與受體靶分子發(fā)生相互作用, 還可以通過氫鍵結(jié)合增加與細(xì)胞的脂溶性而增強(qiáng)其毒性，這與該研究結(jié)果“對氯苯酚毒性大于對苯二胺”相一致[12]。從元素的電負(fù)性角度分析，O、Cl、N電負(fù)性大小為O>Cl>N，O、Cl、N隨電負(fù)性的減小，其得到電子的能力逐漸減弱，與生物分子間的作用力也逐漸變?nèi)鮗16]，而除H元素外，對氯苯酚的取代基含有O和Cl元素，而對苯二胺取代基僅含N元素，從基團(tuán)的電負(fù)性比較，-OH的電負(fù)性也要高于-NH2[17]。對氯苯酚毒性高于對苯二胺與元素和基團(tuán)電負(fù)性的大小呈現(xiàn)相一致的結(jié)果。

LC50常作為最可信的毒性效應(yīng)指標(biāo)，而環(huán)境有機(jī)污染物對水生生物體內(nèi)生物標(biāo)志物系統(tǒng)也產(chǎn)生不同致毒效應(yīng)。生物標(biāo)志物能夠?qū)?種或多種化學(xué)污染物的暴露效應(yīng)的生化、細(xì)胞、生理、行為以及能量上的變化[18]，是衡量環(huán)境污染物的暴露及效應(yīng)的生物反應(yīng)。P450s酶系屬于混合功能氧化酶(MFO)的一種，已作為環(huán)境中公認(rèn)的生物標(biāo)志物，對多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)等有機(jī)污染物極敏感，可通過水體水生生物P450酶來監(jiān)測這些有機(jī)污染物的污染狀況[19]。其中，魚肝細(xì)胞色素 P4501A1(CYP1A1)作為有機(jī)污染物的生物標(biāo)志物已經(jīng)大量應(yīng)用于野外現(xiàn)場研究[20]。P450酶系作為良好的生物標(biāo)志物，一是外源化合物可以誘導(dǎo)或抑制P450酶活性表達(dá)[21]，可通過P450酶的表達(dá)量得到監(jiān)控，同時，其良好的解毒性可將脂溶性有機(jī)異生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為水溶性的易被生物排泄的代謝產(chǎn)物，包含生物轉(zhuǎn)化酶和解毒酶，幾乎存在于生物體所有組織中[22]。P450酶還可通過電子傳遞機(jī)制和羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化、脫氯化等過程生物催化不同類型外源物質(zhì)代謝過程，從而實(shí)現(xiàn)對污染物的生物降解[23]。目前，研究表明P450酶系中的亞酶CYP1A1，在二惡英(TCDD)濃度為50.0 nmol/L以上，處理48、72 h的誘導(dǎo)下，CYP1A1的表達(dá)上調(diào)，存在相應(yīng)的時間與劑量關(guān)系[24]，CYP1A1可作為TCDD污染物的檢測性物質(zhì)；黑斑蛙(Rananigromaculata)暴露于Cd溶液30 d，其精巢組織細(xì)胞色素P450亞族酶乙氧基異酚惡唑脫乙基酶(EROD)活性在0.5和1.0 mg/L Cd 處理組被顯著抑制，對低濃度的Cd溶液較敏感[25]。艾國民等利用高效液相色譜法測定家蠅吡蟲啉抗性和敏感品系體內(nèi)細(xì)胞色素P450 O-脫甲基活性，發(fā)現(xiàn)抗性品系家蠅的P450 O-脫甲基活性為敏感品系的3.34倍[26]。該研究通過分光光度計法測定細(xì)胞色素P450 O-脫甲基活性，結(jié)果表明P450酶活性對對氯苯酚與對苯二胺響應(yīng)存在相應(yīng)時間與劑量效應(yīng)。取代苯對氯苯酚和對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲體內(nèi)P450酶活性的影響主要表現(xiàn)為抑制作用，96 h作用時間內(nèi)最大抑制率分別為70.68%和64.94%，而對離體P450酶活性的IC50分別為466.15和594.43 mg/L，均高于LC50。雖然離體P450IC50可以表明花翅搖蚊幼蟲對對氯苯酚敏感性高于對苯二胺，但從作為指示性指標(biāo)來說，水體中對氯苯酚與對苯二胺的濃度遠(yuǎn)小于LC50，采用搖蚊急性毒性處理的LC50比離體P450酶活性的LC50更為適合。總之，對氯苯酚與對苯二胺對花翅搖蚊4齡幼蟲均具有一定的毒性效應(yīng)，且隨著處理時間的延長，花翅搖蚊幼蟲對對氯苯酚和對苯二胺的敏感性增大。此外，對氯苯酚和對苯二胺還影響花翅搖蚊體內(nèi)和體外細(xì)胞色素P450酶活性，并隨著濃度和暴露時間的延長呈現(xiàn)劑量-時間效應(yīng)，表明細(xì)胞色素P450酶參與了花翅搖蚊對對氯苯酚和對苯二胺的應(yīng)答機(jī)制。然而，由于編碼細(xì)胞色素P450蛋白的基因是一個超級家族，可能由于不同亞家族基因?qū)β缺椒雍蛯Ρ蕉反嬖诓煌瑫r間和濃度表達(dá)效應(yīng)，最終導(dǎo)致P450酶活性呈現(xiàn)無顯著的差異規(guī)律性，因此，有關(guān)細(xì)胞色素P450家族基因表達(dá)與取代苯類有機(jī)污染物脅迫的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

[1] 劉洪霞. 花翅搖蚊乙酰膽堿酯酶的生化特性及其在水質(zhì)監(jiān)測中的應(yīng)用[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[2] 陳傳平, 張庭廷, 何梅, 等. 苯胺、苯酚對淡水藻類生長的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2007, 18(1): 219-223.

[3] SAHA N C, BHUNIA F, KAVIRAJ A. Toxicity of phenol to fish and aquatic ecosystems[J]. Bulletin of Envirionmental Contamination and Toxicology, 1999, 63(2):195-202.

[4] 周文敏, 傅德黔, 孫宗光.中國水中優(yōu)先控制污染物黑名單的確定[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 1991, 6(4): 1-3.

[5] 于淑池, 許麗敏, 朱葉蓮, 等.對苯二胺對泥鰍的急性毒性及安全評價[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2011, 32(2)：131-134.

[6] LEWIS D F, WATSON E, LAKE B G. Evolution of the cytochrome P450 superfamily,sequence alignments and pharmacokinetics[J]. Mutat Res, 1998, 410: 245-270.

[7] 趙于丁, 郭敦明, 范青海, 等. 生物標(biāo)志物在農(nóng)藥水生態(tài)毒理學(xué)中應(yīng)用的進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 25(1): 203-209.

[8] 葛士林, 曹傳旺, 王志英. 3種農(nóng)藥對紅裸須搖蚊體內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和AChE活性的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 39(1): 108-109, 126.

[9] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(2): 248-254.

[10] 匡少平, 孫東亞. 多環(huán)芳烴的毒理學(xué)特征與生物標(biāo)記物研究[J].世界科技研究與發(fā)展, 2007, 29(2): 41-47.

[11]中國國家標(biāo)準(zhǔn)總局. GB/T31270.12-2014化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2014.

[12] 李鐵軍,郭遠(yuǎn)明,尤矩炬,等. 苯酚、苯胺、氯苯和硝基苯對三疣梭子蟹Portunustrituberculatus(Miers)的急性毒性研究[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 2009(1):15-17.

[13] 翟麗華. 部分取代苯化合物對發(fā)光菌的急性毒性研究[D].鄭州：鄭州大學(xué), 2003.

[14] 董玉瑛,馮霄,雷炳莉. 毒性比法量化判定芳烴化合物毒性類型的研究[J]. 大連民族學(xué)院學(xué)報, 2005(5):12-14, 29.

[15] 王陽峰,呂玉新. 用水生態(tài)毒理學(xué)方法評價13種硝基苯類化合物的急性毒性[J]. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2004(6): 456-457, 460.

[16] 聶長明,文松年,李忠海,等. 基態(tài)原子價殼層電子能級連接性指數(shù)與元素的電負(fù)性[J]. 化學(xué)學(xué)報,2002(2):207-214, 181.

[17] 聶長明. 基團(tuán)電負(fù)性[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2000(2):176-180.

[18] DEPLEDGE M H, AAGAARD A, GYORKOS P. Assessment of trace metal toxicity using molecular, physiological and behavioural biomarkers [J]. Marine Pollution Bulletin, 1995, 31: 19-27.

[19]丁竹紅,謝標(biāo),王曉蓉. 生物標(biāo)志物及其在環(huán)境中的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù), 2002(5):465-467, 470.

[20] 姜元臻. 生物標(biāo)志物監(jiān)測環(huán)境污染研究新進(jìn)展[J]. 廣東化工, 2010(4):150-152, 154.

[21] 朱琳, 錢蕓, 劉廣良. 細(xì)胞色素P450酶系及其在毒理學(xué)上的應(yīng)用[J]. 上海環(huán)境科學(xué), 2001, 20(2): 88-91.

[22] 生秀梅,熊麗,唐紅楓,等. 細(xì)胞色素P450酶系作為生物標(biāo)志物在毒理學(xué)上的應(yīng)用[J]. 四川環(huán)境, 2005(3):74-78.

[23] 尚衛(wèi)輝, 李永濤, 舒薇,等. P450酶系對污染物的生物指示和催化降解機(jī)制[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2009(6):12-16.

[24] 劉移民, YAN YAN, BEVERLY D,等. 多環(huán)芳烴受體基因與細(xì)胞色素P4501A1/1B1基因表達(dá)的調(diào)控[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué), 2003(3):10-13.

[25] 賈秀英, 施蔡雷, 張杭君. 鎘對黑斑蛙精巢細(xì)胞色素P450酶及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2013, 33(10) : 2892-2896.

[26] 艾國民, 王慶敏, 鄒東云, 等. 高效液相色譜法測定家蠅細(xì)胞色素P450 O-脫甲基活性[J]. 分析化學(xué), 2009(8):1157-1160.

Toxicity of Two Substituted Benzenes and Their Effects on Cytochrome P450 Activity ofChironomuskiinensis

NIU Fang1, XIE Fei2, ZHANG Jian1, CAO Chuan-wang1*et al

(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; 2. Jiangxi Forest Pest Control and Quarantine Bureau, Nanchang, Jiangxi 330038)

[Objective] The aim was to evaluate the effects of substituted benzenes on the aquatic insect toxicity and the activities of cytochrome P450. [Method] The 4th instarC.kiinensislarvae were used to evaluate the toxicity of p-chlorophenol and p-phenylenediamine and the effects of them on the activities of cytochrome P450 using the method of liquid culture and in vivo and in vitro enzymatic activity assay, respectively. [Result] TheLC50value of p-chlorophenol and p-phenylenediamine to larvae after exposure for 24 h was 38.65 and 78.43 mg/L, respectively. The inhibition of P450 activities in the 4th instarC.kiinensislarvae gradually decreased with the increase of treatment time of p-chlorophenol while the induction of P450 activity increased with the increase of p-phenylenediamine concentration. The median inhibitory concentration (IC50) of the in vitro cytochrome P450 activity for p-chlorophenol and p-phenylenediamine were 466.15 and 594.43 mg/L, respectively. [Conclusion] The cytochrome P450 activity of theC.kiinensiscan be served as a biochemical marker to monitor the water pollution caused by the p-chlorophenol and p-phenylenediamine.

Chironomuskiinensis； P-chlorophenol； P-phenylenediamine； Cytochrome P450；Toxicity；Activity

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2572014CA10)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201409)；東北林業(yè)大學(xué)青年拔尖人才項(xiàng)目(PYTT-1213-10)。

牛芳(1989-)，女，吉林吉林人，碩士研究生，研究方向：昆蟲毒理學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事昆蟲毒理學(xué)研究。

2015-03-18

S 186

A

0517-6611(2015)12-113-04