肖元元 王倩倩 毛月芹 魏美林 韓峻峰 殷 峻 魏 麗

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種由多病因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積過(guò)多所導(dǎo)致的臨床綜合征，它除了可以引起相關(guān)肝臟疾病如肝硬化、肝癌等疾病的發(fā)生以外，還與肥胖、血脂紊亂、2 型糖尿病、高血壓等代謝綜合征密切相關(guān)［1］。肝內(nèi)過(guò)量的游離脂肪酸(FFA)及其異常代謝產(chǎn)物的過(guò)度堆積是造成肝細(xì)胞過(guò)度脂性凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致NAFLD 的主要原因［2］。Exendin-4 是胰高血糖素樣肽1(GLP -1)受體激動(dòng)劑，是一類目前廣泛用于糖尿病治療的新型藥物，因其降糖效果顯著，可明顯降低體重，并且低血糖發(fā)生率較低而在糖尿病及肥胖癥的臨床治療中得到應(yīng)用［3］。除了對(duì)糖尿病有顯著治療效果以外，近年來(lái)的許多研究發(fā)現(xiàn)GLP -1 可以同樣顯著調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝。sirt6 是酵母染色質(zhì)沉默因子(silent information regulator 2，sir2)同系物家族中的一員，近年來(lái)因其在基因的維護(hù)和修復(fù)、細(xì)胞存活和凋亡、炎癥、心血管功能、氧化應(yīng)激、壽命以及代謝和能量合成等方面所發(fā)揮的重要作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)sirt6 可以參與肝臟糖異生、糖酵解以及脂肪酸合成等關(guān)鍵步驟的調(diào)節(jié)［4］。關(guān)于肝臟脂質(zhì)沉積是否會(huì)對(duì)sirt6 表達(dá)產(chǎn)生影響以及Exendin-4 是否可以通過(guò)sirt6 調(diào)節(jié)肝臟的糖脂代謝及其相關(guān)機(jī)制目前還不是很清楚。鑒于此，本課題旨在通過(guò)游離脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性病變模型，觀察Exendin -4 對(duì)sirt6表達(dá)的影響以及其在肝臟糖異生作用中的調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

1.材料:人肝癌HepG2 細(xì)胞株由上海市糖尿病研究所保存。棕櫚酸、油酸、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。sirt6 Stealth RNAi 干擾質(zhì)粒、對(duì)照干擾質(zhì)粒、Lipo -fectamine2000 購(gòu)自Invitrogen 公司。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司。兔抗sirt6 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司。兔抗β-actin 抗體購(gòu)自CST 公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔、抗小鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。ECL 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。cDNA 反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司。MTT 試劑、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):HepG2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，每2 天傳代1 次。在37℃、95%濕度和5%CO2條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70% ～80%后，給予相應(yīng)處理。對(duì)照組給予含1% BSA 的DMEM 培養(yǎng)，對(duì)照組分別給予300μmol/L 濃度的游離脂肪酸(棕櫚酸與油酸比例為2∶1)與1%BSA 對(duì)待24h 后，再給予100nmol/L 濃度Exendin-4 對(duì)待24h。(2)油紅O 染色:油紅O 染料經(jīng)異丙醇溶解后過(guò)濾，置于4℃?zhèn)溆?。HepG2 細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理后棄培養(yǎng)液，PBS 洗3次，經(jīng)10%多聚甲醛固定液固定后，加油紅O 染液于細(xì)胞表面10min。用60%異丙醇洗細(xì)胞2 次，以去除多余的染料，自來(lái)水清洗，倒置顯微鏡下觀察，拍照。(3)siRNA 干擾實(shí)驗(yàn):將HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板，在無(wú)抗生素的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)的轉(zhuǎn)染密度約30% ～50%。將sirt6 stealth RNAi 和Stealth siRNA negative control 用Lipofectamine 2000 根據(jù)說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h，采用Western blot 法和RT -PCR 法檢測(cè)Stealth RNAi 對(duì)sirt6 基因的沉默程度。(4)細(xì)胞RNA 的提取與RT -PCR:將接種于6 孔板內(nèi)的HepG2 細(xì)胞按Trizol 說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，用RT-PCR 法擴(kuò)增檢測(cè)目的基因。目的基因引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μl，42℃溫育50min，95℃加熱5min，冰上放置終止反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增采用20μl 反應(yīng)體系。95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸40s，經(jīng)30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后在紫外燈下照相。比較目的基因與內(nèi)參基因β -actin 相對(duì)比值，計(jì)算表達(dá)水平。(5)Western blot 法實(shí)驗(yàn):收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗細(xì)胞2 次。加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，4℃12000r/min 離心15min。取上清，此為細(xì)胞總蛋白，用BCA 法蛋白定量。將已定量好的細(xì)胞總蛋白與6 ×蛋白電泳上樣緩沖液按5∶1比例混合。95℃水浴變性5min，冰上冷卻備用。20～30μg 的蛋白經(jīng)SDS -PAGE 電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶/TBST 封閉90min，分別用兔抗人sirt6、β-actin 等抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗10min ×3 次。分別加HRP 標(biāo)記的抗兔二抗室溫孵育2h(1∶5000)。TBST 洗10min×3 次。用ECL 試劑進(jìn)行顯影曝光，掃描圖像分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR 引物序列

結(jié) 果

1.游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的脂肪酸沉積:分別用0 和300μmol/L 的游離脂肪酸對(duì)待HepG2 細(xì)胞24h 后，與對(duì)照組相比，300μmol/L 游離脂肪酸對(duì)待組細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)油紅O 染色加深，脂質(zhì)沉積現(xiàn)象明顯增加，提示肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性病變(圖1)。

圖1 油紅O 染色評(píng)估游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的脂肪性病變(×200)

2. Exendin-4 逆轉(zhuǎn)由游離脂肪酸所導(dǎo)致的HepG2 細(xì)胞內(nèi)sirt6 表達(dá)的下調(diào):研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸可以顯著降低HepG2 細(xì)胞內(nèi)sirt6 的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，游離脂肪酸處理組中sirt6 表達(dá)水平約下降了50%，而當(dāng)使用100nmol/L 的Exendin-4 處理24h后，則可以明顯的逆轉(zhuǎn)由游離脂肪酸所導(dǎo)致的sirt6表達(dá)的下調(diào)(圖2)。這些結(jié)果提示Exendin -4 可能會(huì)影響肝細(xì)胞內(nèi)sirt6 的表達(dá)。

圖2 各組細(xì)胞中sirt6 蛋白表達(dá)水平變化

3.Exendin-4 可以通過(guò)激活sirt6 下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)糖異生基因的表達(dá):過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)GLP -1 可以通過(guò)影響肝臟的糖異生水平起降低血糖的作用。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)GLP -1 可以通過(guò)抑制肝臟糖異生關(guān)鍵基因G6Pase 和PEPCK 的表達(dá)進(jìn)而影響肝臟的糖異生。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4 可以顯著降低HepG2 內(nèi)由游離脂肪酸對(duì)待所導(dǎo)致的G6Pase和PEPCK 兩個(gè)糖異生關(guān)鍵基因mRNA 水平的升高。然而當(dāng)使用基因干擾抑制sirt6 基因的表達(dá)后，sirt6在蛋白與基因水平的表達(dá)均被顯著下調(diào)(圖3)，而且Exendin-4 對(duì)糖異生的改善作用則消失不見(jiàn)(圖4)。因此筆者認(rèn)為sirt6 參與了Exendin-4 對(duì)肝臟糖異生作用的調(diào)節(jié)。

圖3 sirt6 表達(dá)抑制后各組細(xì)胞sirt6 蛋白表達(dá)情況

圖4 sirt6 表達(dá)抑制后各組細(xì)胞sirt6 及糖異生相關(guān)基因的表達(dá)情況

討 論

非酒精性脂肪肝是由多種原因所導(dǎo)致的體內(nèi)游離脂肪酸的增高，進(jìn)而引起的肝臟脂質(zhì)的過(guò)度堆積所引起的疾病［5］。隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。非酒精性脂肪肝患者主要表現(xiàn)為肝臟的胰島素抵抗，而肝臟的胰島素抵抗則是造成空腹及餐后血糖升高的主要原因之一。因此，非酒精性脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展，與糖尿病及肥胖等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。棕櫚酸和油酸是日常飲食中常見(jiàn)的長(zhǎng)鏈脂肪酸。既往已有研究通過(guò)使用棕櫚酸與油酸的混合物成功誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的脂肪性病變［6］。在筆者的試驗(yàn)中，同樣使用這種方法對(duì)細(xì)胞給予不同濃度和時(shí)間的游離脂肪酸對(duì)待后，通過(guò)對(duì)細(xì)胞活力以及凋亡的檢測(cè)筆者選擇對(duì)細(xì)胞毒性最低的藥物劑量和作用時(shí)間，在進(jìn)行細(xì)胞的油紅O 染色后，筆者成功構(gòu)建了HepG2 細(xì)胞的脂肪性病變模型。

Exendin-4 是一種胰高血糖素樣肽-1 類似物，發(fā)揮GLP-1 受體激動(dòng)劑的功能。因其具有葡萄糖刺激的促進(jìn)胰島素分泌、延緩胃排空以及抑制食欲等作用，是目前臨床上較為有效的治療2 型糖尿病的新型藥物［7］。除了胰腺組織，最近的研究發(fā)現(xiàn)在肝臟組織同樣存在GLP -1 受體的表達(dá)，并且GLP -1 對(duì)肝臟的糖脂代謝也有重要的調(diào)節(jié)作用［8］。GLP-1 可以有效地減少肝臟的脂質(zhì)含量，降低體內(nèi)膽固醇、甘油三酯以及轉(zhuǎn)氨酶水平［9，10］。此外由于肝臟在維持體內(nèi)血糖平衡中的重要作用，研究GLP -1 對(duì)肝臟肝糖分解以及糖原合成的影響也受到越來(lái)越多的關(guān)注。Fan 等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4 治療3 個(gè)月的小鼠肝臟中糖異生關(guān)鍵激酶G6Pase 和PEPCK 的表達(dá)水平顯著下降。同時(shí)Lee 等［12］的研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)給予過(guò)表達(dá)GLP -1，通過(guò)下調(diào)糖異生關(guān)鍵激酶的表達(dá)，顯著地降低了肝糖輸出。

在筆者的實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，在給予游離脂肪酸對(duì)待的肝細(xì)胞中，油紅O 染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞發(fā)生明顯的脂肪性病變，模仿了體內(nèi)非酒精性脂肪肝的患病狀態(tài)。同時(shí)檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)糖異生關(guān)鍵基因G6Pase 和PEPCK 發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)水平被顯著上調(diào)，但是在此基礎(chǔ)上筆者同時(shí)對(duì)細(xì)胞給予GLP -1 類似物Exendin-4 處理后，這種由非游離脂肪酸所導(dǎo)致的肝臟糖異生水平的升高可以被顯著逆轉(zhuǎn)，由此可以說(shuō)明Exendin-4 對(duì)肝臟脂肪性病變誘導(dǎo)的體內(nèi)糖異生水平的升高具有明顯的治療效果。

Sirtuins 是一種NAD+的去乙酰化酶家族，在調(diào)節(jié)包括細(xì)胞活力、發(fā)育、染色質(zhì)動(dòng)力、DNA 修復(fù)以及代謝等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［13］。sirt6 是該家族中的一員，特別參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的衰老以及代謝等過(guò)程［14］。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)過(guò)表達(dá)sirt6 可以有效降低血清甘油三酯以及膽固醇水平，而肝臟特異性敲除sirt6 則可以增加肝臟糖酵解以及甘油三酯的合成，并降低脂肪酸的β 氧化促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生［15］。Dominy等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，這種調(diào)節(jié)主要與sirt6 參與調(diào)節(jié)GCN5 的去乙?；M(jìn)而導(dǎo)致PGC -1α 的乙?；嘘P(guān)，而PGC-1α 又是肝臟糖異生基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。鑒于以上的研究結(jié)果，筆者假設(shè)Exendin-4 可以具有通過(guò)對(duì)肝臟sirt6 表達(dá)的調(diào)控進(jìn)而降低肝臟糖異生的作用。

通過(guò)筆者的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸對(duì)待的肝細(xì)胞內(nèi)sirt6 表達(dá)顯著降低，而Exedin-4 聯(lián)合處理后則可以相應(yīng)改善這一現(xiàn)象。同時(shí)，筆者的實(shí)驗(yàn)通過(guò)siRNA干擾技術(shù)下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)sirt6 的表達(dá)水平后，不但Exendin-4 對(duì)sirt6 表達(dá)的調(diào)控作用消失，同時(shí)Exendin-4 也無(wú)法顯著抑制由高游離脂肪酸對(duì)待所導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)糖異生基因水平的升高。這些結(jié)果均說(shuō)明在肝細(xì)胞內(nèi)Exendin-4 可能是通過(guò)激活sirt6 進(jìn)而影響肝臟的糖異生，起到減少肝糖輸出降低血糖的作用。這些將為以后更好地應(yīng)用GLP -1 類似物藥物治療非酒精性脂肪肝、胰島素抵抗、2 型糖尿病以及相關(guān)代謝綜合征提供理論依據(jù)。

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