Toll 樣受體在高遷移率族蛋白B1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻罂莘窦毎置诖傺仔约毎蜃又械淖饔?/h1>
2015-01-16 06:10:10陳旭林王仁素王永杰孫業(yè)祥
感染、炎癥、修復(fù) 2015年2期
陳旭林 孫 立 郭 峰 王 飛 劉 晟 梁 勛 王仁素 王永杰 孫業(yè)祥
（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，安徽 合肥 230022）
高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）作為一個重要的促炎性細胞因子，被認為既是炎癥早期的啟動者，又是炎癥晚期的促進者[1]，介導(dǎo)了嚴(yán)重?zé)齻娜硌装Y反應(yīng)過程，參與了燒傷后全身多臟器損傷的發(fā)生[2]，但其在促進燒傷后肝臟枯否細胞（Kupffer cells, KCs）表達促炎因子中的具體機制尚不清楚。HMGB1主要通過Toll樣受體(TLRs)信號途徑（特別是TLR2和TLR4）起到引起炎癥反應(yīng)的作用[3]。本文探討TLRs在HMGB1誘導(dǎo)的嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs分泌促炎性細胞因子中的作用，以了解HMGB1促炎作用的受體機制。
1 材料和方法
1.1 動物分組與燒傷模型的制備 健康成年雄性SD大鼠32只，體重200～250 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心。常溫下飼養(yǎng)1周，隨機分為燙傷組(n=24)和假燙組(n=8)。燙傷組大鼠以戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部置于98 ℃水中12 s，造成30%TBSA Ⅲ度燒傷，燒傷后立即給予乳酸林格液(30 ml/kg)腹腔注射進行液體復(fù)蘇。假燙組大鼠進行相同的麻醉，但給予室溫水浴，不行液體復(fù)蘇。各組大鼠于燙傷或假燙后24 h心臟取血處死，分離肝臟KCs。
1.2 KCs的分離與培養(yǎng) KCs的分離采用肝臟原位灌注，Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心和選擇性黏附法[4]。KCs活性的判斷和鑒定分別采用臺盼藍染色和乳膠微粒吞噬試驗，活性和純度均大于95%。分離后的KCs以每孔1×106的密度接種于24孔板中。為觀察HMGB1對燒傷后KCs促炎性細胞因子產(chǎn)生的影響，燙傷組和假燙組大鼠的KCs分別采用不同濃度HMGB1（0、50、100、200 ng/ml，美國Sigma公司）刺激48 h，然后測定細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β的含量。為了解HMGB1燒傷后促炎作用的受體機制，另將燙傷組大鼠的KCs分離后隨機分為4組：①對照組，RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h；②HMGB1組，100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；③HMGB1+TLR2抗體組，20 μg/ml TLR2抗體（美國Invivogen公司）培養(yǎng)2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；④HMGB1+TLR4抗體組, 20μg/ml TLR4抗體（美國Invivogen公司）培養(yǎng)2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h。檢測各組KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表達。
1.3 ELISA法測定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量 收集細胞培養(yǎng)上清液，使用大鼠TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國Bio Source公司）檢測TNF-α和IL-1β含量，相關(guān)操作按照生產(chǎn)商提供的說明書進行。
1.4 Northern blot法檢測KCs中TNF -α和 IL-1β mRNA的表達 使用 Trizol法提取KCs的總RNA，測定260和280 nm處 吸光度值以反映RNA 含量和純度。采用文獻[5]的方法將提取的10 μg RNA電泳后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜（Hybond-N+，美國Amersham公司），得到的印記分別與(α-32P)d CTP(3000 Ci/mmol，美國Amersha公司）標(biāo)記的大鼠TNF-α和IL-1β的c DNA探針相雜交，采用GAPDH作為內(nèi)參照。雜交膜使用Phosphor-Imager成像系統(tǒng)進行吸光度分析。
2 結(jié) 果
2.1 HMGB1刺激后燒傷大鼠KCs 上清液TNF-α和IL-1β含量的變化 燙傷組和假燙組大鼠的KCs在HMGB1刺激后，上清液中的TNF-α 和IL-1β含量均明顯升高，其升高幅度與HMGB1均呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：HMGB1刺激后，燙傷組大鼠KCs分泌的TNF-α和IL-1β水平顯著高于假燙組大鼠的KCs（P＜0.05或P ＜0.01），這種差異在使用100 ng/ml或者更高濃度HMGB1刺激后更為明顯。見表1。
2.2 Toll樣受體在HMGB1刺激致KCs培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β含量變化中的作用100 ng/ml HMGB1刺激后燒傷大鼠KCs分泌TNF-α和IL-1β顯著增加，TLR2/4抗體預(yù)培養(yǎng)KCs都可以明顯減弱HMGB1誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β上調(diào)的作用（P ＜0.01）。TLR4抗體抑制HMGB1誘導(dǎo)TNF-α表達的作用比TLR2抗體更明顯（73%對53%，P ＜0.05），加入TLR4抗體預(yù)培養(yǎng)的KCs培養(yǎng)液上清中TNF-α水平與對照組之間差異無顯著性（P ＞0.05）。TLR2抗體較TLR4抗體更顯著地抑制了HMGB1誘導(dǎo)的IL-1β表達（79%對51%，P ＜0.05），HMGB1+TLR2組的KCs培養(yǎng)液上清中的IL-1β水平與對照組之間差異無顯著性（P ＞0.05）。見表2。
表1 HMGB1刺激嚴(yán)重燙傷大鼠KCs后培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β含量的變化（±s, n =8）
表1 HMGB1刺激嚴(yán)重燙傷大鼠KCs后培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β含量的變化（±s, n =8）
注：與假燙組比較：* P ＜0.05，** P ＜0.01
HMGB 1 (ng/ml) TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)假燙組 燙傷組 假燙組 燙傷組0 0.91±0.06 2.68±0.130 0.18±0.01 0.434±0.05000 50 1.75±0.16 4.41±0.43* 0.35±0.03 0.82±0.08*0 100 4.59±0.45 10.59±1.39** 0.85±0.09 2.49±0.33**200 8.04±0.76 18.69±1.98** 1.40±0.14 3.94±0.45**
表2 ELISA法檢測各組大鼠KCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）
表2 ELISA法檢測各組大鼠KCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）
注：與對照組比較：* P ＜0.05，** P ＜0.01；與 HMGB1 組比較 ：#P ＜0.05，##P ＜0.01
組 別 TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)對照組 2.69±0.140 0.43±0.0500 HMGB1組 10.59±1.39** 2.49±0.33**HMGB1＋TLR2 抗體組 4.956±0.36*## 0.52±0.08##HMGB 1＋TLR4 抗體組 2.88±0.36## 1.21±0.21*##
2.3 TLRs在HMGB1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs TNF-α和 IL-1β mRNA 表 達 中 的 作 用Northern blot結(jié)果表明，100 ng/ml HMGB1刺 激 KCs 48 h后， 細 胞 內(nèi) TNF-α和 IL-1β m RNA水平均較對照組明顯升高（P ＜0.01）。與HMGB1單獨刺激組比較，使用TLR2/4抗體預(yù)培養(yǎng)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs明顯抑制HMGB1誘導(dǎo)的 TNF-α 和 IL-1β mRNA 表 達（P ＜0.01）。TLR2抗體抑制IL-1β m RNA表達的作用更為明顯，而TLR4抗體抑制TNF-α mRNA表達的作用更為顯著。
3 討 論
枯否細胞存在于肝血竇中，是組成機體單核-巨噬細胞系統(tǒng)最大的群體，占單核-巨噬細胞總數(shù)的80%～90%。KCs是重度燒傷早期炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放的重要來源，并且導(dǎo)致了燒傷后的肝損傷，抑制KCs的活化可以減輕燒傷后全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
圖1 Northern blot法檢測各組大鼠KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表達
HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，最初認為它是一種參與維護核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白。HMGB1可由燒傷后損傷的細胞被動釋放，也可由應(yīng)激狀態(tài)下的單核細胞和巨噬細胞主動分泌，是一種引起燒傷后組織損傷和炎癥反應(yīng)的介質(zhì)。大面積燒傷患者血漿中HMGB1水平明顯升高[6-7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1作為一種強有力的促炎性細胞因子和“晚期”炎癥介質(zhì)參與了全身炎癥反應(yīng)的進程[1]。在本研究中，雖然HMGB1能誘導(dǎo)各實驗組KCs中TNF-α和IL-1β表達增高，但是嚴(yán)重?zé)齻笫髞碓吹腒Cs對于HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β表達比假燙組更敏感。HMGB1上調(diào)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs表達TNF-α和IL-1β呈劑量依賴性的關(guān)系。這些結(jié)果表明HMGB1可能在燒傷后炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大過程中起到非常重要的作用。
由于100 ng/ml HMGB1上調(diào)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs 分泌TNF-α和IL-1β的作用最為顯著，故在探討TLRs在HMGB1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻驥Cs促炎性細胞因子產(chǎn)生中的作用時，采用100 ng/ml HMGB1刺激KCs。
Toll樣受體是一組高度保守的蛋白，接受各種內(nèi)源性和外源性刺激后激活固有免疫細胞,在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[8]。HMGB1主要通過Toll樣受體信號途徑（特別是TLR2和TLR4）起到引起炎癥反應(yīng)的作用[9-10]。本實驗中用特異性阻斷劑分別阻斷TLR2和TLR4的表達，發(fā)現(xiàn)阻斷TLR4的表達較阻斷TLR2的表達能更有效地抑制HMGB1誘導(dǎo)KCs表達TNF-α。另一方面，阻斷TLR2的表達比阻斷TLR4的表達更顯著地抑制了HMGB1誘導(dǎo)KCs表達IL-1β。本研究結(jié)果表明，HMGB1通過TLR2和TLR4介導(dǎo)KCs表 達 TNF-α和 IL-1β； TLR4在 HMGB1誘導(dǎo)KCs表達TNF-α的過程中起到更加重要的作用，而HMGB1誘導(dǎo)KCs表達IL-1β主要依靠TLR2介導(dǎo)。TLR2和TLR4在HMGB1誘導(dǎo)燒傷后KCs產(chǎn)生和釋放炎性細胞因子的過程中發(fā)揮著不同作用。
除TLR2及TLR4外，Toll樣受體家族中的TLR9和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE）同樣可以被HMGB1激活[9,11]，但其激活在燒傷后HMGB1誘導(dǎo)的KCs活化及炎性細胞因子釋放中的作用尚不明確。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)使用RAGE抗體預(yù)培養(yǎng)的KCs并不能降低HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β分泌，這意味著絕大多數(shù)HMGB1引起的燒傷KCs活化并不依賴RAGE。有關(guān)TLR9在嚴(yán)重?zé)齻驢MGB1介導(dǎo)的KCs激活及炎性細胞因子釋放中的作用還有待于進一步研究。
［1］Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection[J]. Annu Rev Immunol, 2011,29:139-162.
［2］Liang X, Wang RS, Wang F, Liu S,Guo F, Sun L, Wang YJ, Sun YX, Chen XL, etal. Sodium butyrate protects against severe burninduced remote acute lung injury in rats[J]. PLoS One, 2013,8(7):e68786.
［3］Yang J, Chen L, Yang J. High mobility group box-1 induces migration of vascular smooth muscle cells via TLR4-dependent PI3K/Akt pathway activation[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(3):3361-3367.
［4］Chen XL, Xia ZF, Wei D. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in Kupffer cell secretion of the proinflammatory cytokines after burn trauma[J]. Burns 2003, 29(6):533-539.
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高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）作為一個重要的促炎性細胞因子，被認為既是炎癥早期的啟動者，又是炎癥晚期的促進者[1]，介導(dǎo)了嚴(yán)重?zé)齻娜硌装Y反應(yīng)過程，參與了燒傷后全身多臟器損傷的發(fā)生[2]，但其在促進燒傷后肝臟枯否細胞（Kupffer cells, KCs）表達促炎因子中的具體機制尚不清楚。HMGB1主要通過Toll樣受體(TLRs)信號途徑（特別是TLR2和TLR4）起到引起炎癥反應(yīng)的作用[3]。本文探討TLRs在HMGB1誘導(dǎo)的嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs分泌促炎性細胞因子中的作用，以了解HMGB1促炎作用的受體機制。
1 材料和方法
1.1 動物分組與燒傷模型的制備 健康成年雄性SD大鼠32只，體重200～250 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物中心。常溫下飼養(yǎng)1周，隨機分為燙傷組(n=24)和假燙組(n=8)。燙傷組大鼠以戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部置于98 ℃水中12 s，造成30%TBSA Ⅲ度燒傷，燒傷后立即給予乳酸林格液(30 ml/kg)腹腔注射進行液體復(fù)蘇。假燙組大鼠進行相同的麻醉，但給予室溫水浴，不行液體復(fù)蘇。各組大鼠于燙傷或假燙后24 h心臟取血處死，分離肝臟KCs。
1.2 KCs的分離與培養(yǎng) KCs的分離采用肝臟原位灌注，Nycodenz不連續(xù)密度梯度離心和選擇性黏附法[4]。KCs活性的判斷和鑒定分別采用臺盼藍染色和乳膠微粒吞噬試驗，活性和純度均大于95%。分離后的KCs以每孔1×106的密度接種于24孔板中。為觀察HMGB1對燒傷后KCs促炎性細胞因子產(chǎn)生的影響，燙傷組和假燙組大鼠的KCs分別采用不同濃度HMGB1（0、50、100、200 ng/ml，美國Sigma公司）刺激48 h，然后測定細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β的含量。為了解HMGB1燒傷后促炎作用的受體機制，另將燙傷組大鼠的KCs分離后隨機分為4組：①對照組，RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h；②HMGB1組，100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；③HMGB1+TLR2抗體組，20 μg/ml TLR2抗體（美國Invivogen公司）培養(yǎng)2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h；④HMGB1+TLR4抗體組, 20μg/ml TLR4抗體（美國Invivogen公司）培養(yǎng)2 h后加入100 ng/ml HMGB1 刺激48 h。檢測各組KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表達。
1.3 ELISA法測定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量 收集細胞培養(yǎng)上清液，使用大鼠TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國Bio Source公司）檢測TNF-α和IL-1β含量，相關(guān)操作按照生產(chǎn)商提供的說明書進行。
1.4 Northern blot法檢測KCs中TNF -α和 IL-1β mRNA的表達 使用 Trizol法提取KCs的總RNA，測定260和280 nm處 吸光度值以反映RNA 含量和純度。采用文獻[5]的方法將提取的10 μg RNA電泳后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜（Hybond-N+，美國Amersham公司），得到的印記分別與(α-32P)d CTP(3000 Ci/mmol，美國Amersha公司）標(biāo)記的大鼠TNF-α和IL-1β的c DNA探針相雜交，采用GAPDH作為內(nèi)參照。雜交膜使用Phosphor-Imager成像系統(tǒng)進行吸光度分析。
2 結(jié) 果
2.1 HMGB1刺激后燒傷大鼠KCs 上清液TNF-α和IL-1β含量的變化 燙傷組和假燙組大鼠的KCs在HMGB1刺激后，上清液中的TNF-α 和IL-1β含量均明顯升高，其升高幅度與HMGB1均呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示：HMGB1刺激后，燙傷組大鼠KCs分泌的TNF-α和IL-1β水平顯著高于假燙組大鼠的KCs（P＜0.05或P ＜0.01），這種差異在使用100 ng/ml或者更高濃度HMGB1刺激后更為明顯。見表1。
2.2 Toll樣受體在HMGB1刺激致KCs培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β含量變化中的作用100 ng/ml HMGB1刺激后燒傷大鼠KCs分泌TNF-α和IL-1β顯著增加，TLR2/4抗體預(yù)培養(yǎng)KCs都可以明顯減弱HMGB1誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β上調(diào)的作用（P ＜0.01）。TLR4抗體抑制HMGB1誘導(dǎo)TNF-α表達的作用比TLR2抗體更明顯（73%對53%，P ＜0.05），加入TLR4抗體預(yù)培養(yǎng)的KCs培養(yǎng)液上清中TNF-α水平與對照組之間差異無顯著性（P ＞0.05）。TLR2抗體較TLR4抗體更顯著地抑制了HMGB1誘導(dǎo)的IL-1β表達（79%對51%，P ＜0.05），HMGB1+TLR2組的KCs培養(yǎng)液上清中的IL-1β水平與對照組之間差異無顯著性（P ＞0.05）。見表2。
表1 HMGB1刺激嚴(yán)重燙傷大鼠KCs后培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β含量的變化（±s, n =8）
表1 HMGB1刺激嚴(yán)重燙傷大鼠KCs后培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-1β含量的變化（±s, n =8）
注：與假燙組比較：* P ＜0.05，** P ＜0.01
HMGB 1 (ng/ml) TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)假燙組 燙傷組 假燙組 燙傷組0 0.91±0.06 2.68±0.130 0.18±0.01 0.434±0.05000 50 1.75±0.16 4.41±0.43* 0.35±0.03 0.82±0.08*0 100 4.59±0.45 10.59±1.39** 0.85±0.09 2.49±0.33**200 8.04±0.76 18.69±1.98** 1.40±0.14 3.94±0.45**
表2 ELISA法檢測各組大鼠KCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）
表2 ELISA法檢測各組大鼠KCs培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的含量（±s, n =8）
注：與對照組比較：* P ＜0.05，** P ＜0.01；與 HMGB1 組比較 ：#P ＜0.05，##P ＜0.01
組 別 TNF-α (ng/ml) IL-1β (ng/ml)對照組 2.69±0.140 0.43±0.0500 HMGB1組 10.59±1.39** 2.49±0.33**HMGB1＋TLR2 抗體組 4.956±0.36*## 0.52±0.08##HMGB 1＋TLR4 抗體組 2.88±0.36## 1.21±0.21*##
2.3 TLRs在HMGB1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs TNF-α和 IL-1β mRNA 表 達 中 的 作 用Northern blot結(jié)果表明，100 ng/ml HMGB1刺 激 KCs 48 h后， 細 胞 內(nèi) TNF-α和 IL-1β m RNA水平均較對照組明顯升高（P ＜0.01）。與HMGB1單獨刺激組比較，使用TLR2/4抗體預(yù)培養(yǎng)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs明顯抑制HMGB1誘導(dǎo)的 TNF-α 和 IL-1β mRNA 表 達（P ＜0.01）。TLR2抗體抑制IL-1β m RNA表達的作用更為明顯，而TLR4抗體抑制TNF-α mRNA表達的作用更為顯著。
3 討 論
枯否細胞存在于肝血竇中，是組成機體單核-巨噬細胞系統(tǒng)最大的群體，占單核-巨噬細胞總數(shù)的80%～90%。KCs是重度燒傷早期炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放的重要來源，并且導(dǎo)致了燒傷后的肝損傷，抑制KCs的活化可以減輕燒傷后全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
圖1 Northern blot法檢測各組大鼠KCs中TNF -α和IL-1β mRNA的表達
HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，最初認為它是一種參與維護核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白。HMGB1可由燒傷后損傷的細胞被動釋放，也可由應(yīng)激狀態(tài)下的單核細胞和巨噬細胞主動分泌，是一種引起燒傷后組織損傷和炎癥反應(yīng)的介質(zhì)。大面積燒傷患者血漿中HMGB1水平明顯升高[6-7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1作為一種強有力的促炎性細胞因子和“晚期”炎癥介質(zhì)參與了全身炎癥反應(yīng)的進程[1]。在本研究中，雖然HMGB1能誘導(dǎo)各實驗組KCs中TNF-α和IL-1β表達增高，但是嚴(yán)重?zé)齻笫髞碓吹腒Cs對于HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β表達比假燙組更敏感。HMGB1上調(diào)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs表達TNF-α和IL-1β呈劑量依賴性的關(guān)系。這些結(jié)果表明HMGB1可能在燒傷后炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大過程中起到非常重要的作用。
由于100 ng/ml HMGB1上調(diào)嚴(yán)重?zé)齻笫驥Cs 分泌TNF-α和IL-1β的作用最為顯著，故在探討TLRs在HMGB1誘導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻驥Cs促炎性細胞因子產(chǎn)生中的作用時，采用100 ng/ml HMGB1刺激KCs。
Toll樣受體是一組高度保守的蛋白，接受各種內(nèi)源性和外源性刺激后激活固有免疫細胞,在機體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[8]。HMGB1主要通過Toll樣受體信號途徑（特別是TLR2和TLR4）起到引起炎癥反應(yīng)的作用[9-10]。本實驗中用特異性阻斷劑分別阻斷TLR2和TLR4的表達，發(fā)現(xiàn)阻斷TLR4的表達較阻斷TLR2的表達能更有效地抑制HMGB1誘導(dǎo)KCs表達TNF-α。另一方面，阻斷TLR2的表達比阻斷TLR4的表達更顯著地抑制了HMGB1誘導(dǎo)KCs表達IL-1β。本研究結(jié)果表明，HMGB1通過TLR2和TLR4介導(dǎo)KCs表 達 TNF-α和 IL-1β； TLR4在 HMGB1誘導(dǎo)KCs表達TNF-α的過程中起到更加重要的作用，而HMGB1誘導(dǎo)KCs表達IL-1β主要依靠TLR2介導(dǎo)。TLR2和TLR4在HMGB1誘導(dǎo)燒傷后KCs產(chǎn)生和釋放炎性細胞因子的過程中發(fā)揮著不同作用。
除TLR2及TLR4外，Toll樣受體家族中的TLR9和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE）同樣可以被HMGB1激活[9,11]，但其激活在燒傷后HMGB1誘導(dǎo)的KCs活化及炎性細胞因子釋放中的作用尚不明確。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)使用RAGE抗體預(yù)培養(yǎng)的KCs并不能降低HMGB1誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β分泌，這意味著絕大多數(shù)HMGB1引起的燒傷KCs活化并不依賴RAGE。有關(guān)TLR9在嚴(yán)重?zé)齻驢MGB1介導(dǎo)的KCs激活及炎性細胞因子釋放中的作用還有待于進一步研究。
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