■ 李亞菲 余祖華 劉賽寶 李三棟 丁 軻

(1.河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站，河南洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽 471003)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(嘔吐毒素，DON)是分布最廣泛的鐮刀霉菌毒素之一，由于其廣泛存在于谷物類飼料中，已經(jīng)成為動(dòng)物飼料中毒的重要原因之一。人和動(dòng)物食用后，可引起嘔吐、腹瀉、流產(chǎn)、癌變和免疫抑制等，具有高度的危害性。農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心2008年在全國的一些飼料和養(yǎng)殖企業(yè)里采集了7種主要飼料原料(玉米、豆粕、菜粕、棉粕、小麥、麥麩、魚粉)及2種主要配合飼料共計(jì)1 018個(gè)樣品，嘔吐毒素平均檢出率為95.5%，超標(biāo)率平均為18.7%，且能量原料玉米和蛋白原料豆粕中毒素含量均較高。因此，飼料行業(yè)急需解決嘔吐毒素等霉菌毒素污染的問題。近年來，生物降解逐漸成為霉菌毒素脫毒的一種新趨勢(shì)，可以通過使用酶或者活菌來改變毒素的結(jié)構(gòu)，將毒素轉(zhuǎn)化成為對(duì)動(dòng)物無毒的物質(zhì)。目前關(guān)于生物降解DON菌株的報(bào)道并不多，要獲得具有DON降解能力的菌株，就必須從特定的自然界中采集大量的樣品，進(jìn)行有針對(duì)性的分離，然后再從中分離篩選具有高活性的特異性菌株。因此，本研究旨在篩選對(duì)嘔吐毒素有較好降解作用的菌株，以便為開發(fā)具有霉菌毒素降解作用的新型生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

分別取自河南省洛陽市周邊野外散置的秸稈及下層土壤、瘤胃內(nèi)容物等樣品，共55份。

1.1.2 主要試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，純度≥97.0%；嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。Premix Ex Taq?、pMDl8-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；凝膠回收試劑盒購自天根生物有限公司。

1.1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）、酶標(biāo)儀(Multiskan FC)、紫外可見分光光度計(jì) (UV-1200)，Bio-metro PCR儀。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

察氏液體培養(yǎng)基：蔗糖 3%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，K2HPO40.1%，調(diào)pH值7.0～7.2，121℃，高壓滅菌20 min。

察氏固體培養(yǎng)基：蔗糖 3%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05% ，KCl 0.05% ，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001% ，K2HPO40.1%，瓊脂粉1.5%，調(diào)pH值7.0～7.2，121℃，高壓滅菌20 min。無機(jī)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.1%，K2HPO4·3H2O 0.6%，KH2PO40.3%，NaCl 0.05%，Mg-SO4·7H2O 0.05%，CaCl20.005%，調(diào) pH 值 7.0～7.2，121℃，高壓滅菌20 min。使用前按照4μg/ml的量添加DON。

1.1.5 引物

參照Shiang N L，等（2006）設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含真菌rDNA 18 S和28 S的部分區(qū)域和ITS1，5.8 S，ITS2的完整區(qū)域的片段，即rDNA-ITS通用引物ITSl：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

取1 g秸稈、土壤或1 ml的瘤胃內(nèi)容物等樣品，分別加入50 ml的滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分混勻。

1.2.2 DON降解菌株的初篩

DON降解菌株的初篩參考文獻(xiàn)描述方法進(jìn)行，具體如下：取上述混懸液1 ml加入250 ml含有DON的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，然后取1 ml培養(yǎng)后的樣品液再加入另一250 ml含有DON的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，再置28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，吸取二次培養(yǎng)后的樣品液200μl涂于含有DON的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板，再置28℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d，觀察結(jié)果。

1.2.3 DON降解菌株的純化

挑取在含有DON的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，轉(zhuǎn)接于新的含有DON的無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，如此反復(fù)3～4次進(jìn)行純化，保存能在DON為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。

1.2.4 DON降解菌株的復(fù)篩

取上述篩選、純化的菌株接種察氏液體培養(yǎng)基，于28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取新鮮菌液按照5 ml/g的接種量接種于粉碎的玉米秸稈中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，然后按照嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒操作說明測(cè)定分離菌株降解玉米秸稈中DON的效果，以篩選具有降解玉米秸稈中DON的菌株。

1.2.5 DON降解菌株的形態(tài)學(xué)特征

將上述篩選的菌株進(jìn)行平板點(diǎn)種或劃線接種于察氏固體培養(yǎng)基平板上，在28℃下培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)、色澤。同時(shí)，在察氏培養(yǎng)基上劃線接種線上面插進(jìn)去滅菌的蓋玻片，等菌落長(zhǎng)出來以后，從培養(yǎng)基上直接拔出蓋玻片，輕輕放在中央加有美蘭染色液的潔凈的載玻片上，染色后顯微鏡下觀察觀察孢子和基內(nèi)菌絲的形態(tài)。

1.2.6 DON降解菌株的rDNA-ITS序列分析

采用參考邱海萍等(2014)的方法提取培養(yǎng)菌株的基因組DNA。用rDNA-ITS通用引物ITSl和ITS4 PCR擴(kuò)增分離菌株的rDNA-ITS區(qū)域。以25μl體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括Premix Ex Taq?12.5μl，上下游引物（20 pmol/μl）各0.5 μl，模板DNA 0.5 μl，超純水11μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4℃保存。將產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并將擴(kuò)增的與預(yù)期大小相符的特異性片段克隆至pMD18-T后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的序列，利用MEGA4.0對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離與篩選

將在分離培養(yǎng)基上初步分離出能以DON為唯一碳源的菌株純化后，接種察氏液培養(yǎng)液，然后接種粉碎的玉米秸稈中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，用嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定分離菌株降解玉米秸稈中DON的效果。根據(jù)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），計(jì)算經(jīng)初篩分離的菌株降解秸稈中DON的含量。其中菌株Ma-1-4的降解率為46%，具有較強(qiáng)的降解效果（見表1）。

圖1 DON標(biāo)準(zhǔn)品ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 降解DON菌株復(fù)篩結(jié)果

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)特征

圖2 復(fù)篩菌株菌落形態(tài)

將菌株Ma-1-4在察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行平板接種，置于28℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征。Ma-1-4培養(yǎng)后可見長(zhǎng)出菌落為白色，隨菌落的生長(zhǎng)，中心出現(xiàn)墨綠色并向上突起。擴(kuò)展過程中菌落邊緣有一圈白色菌絲，正反顏色不同，正面為墨綠色，背面為淺黃綠色。菌落生長(zhǎng)致密，不透明。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，白色消失，最終為墨綠色（見圖2A、圖2B）。在顯微鏡下可見菌絲無隔膜；分生孢子梗單枝，較長(zhǎng)，無足細(xì)胞；孢子梗頂端膨大，成帚狀，對(duì)稱，生分生孢子串：?jiǎn)蝹€(gè)分生孢子為球形或橢圓形（圖3A、圖3B）。根據(jù)Ma-1-4的菌落特征和顯微特征初步鑒定為青霉族，青霉屬。

2.3 菌株的rDNA-ITS分子鑒定結(jié)果

以菌株Ma1-4基因組DNA為模板，rDNA-ITS通用引物ITSl、ITS4經(jīng)PCR擴(kuò)增后在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖4所示，在約580 bp處有一明亮的條帶，與預(yù)期大小一致。將所擴(kuò)增的特異性片段克隆至pMD18-T后送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。Ma-1-4菌株的rDNA-ITS測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為586 bp。

圖3 復(fù)篩菌株顯微鏡下分生孢子形態(tài)

圖4 Ma-1-4菌株rDNA-ITS的PCR

2.4 基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將Ma-1-4菌株的rDNA-ITS序列在GenBank中進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)與16個(gè)青霉菌屬的模式菌株的同源性最高，下載這些菌株的rDNA-ITS序列，并利用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示，Ma-1-4與青霉菌(Penicillium)屬的爾青霉位于同一大分支。因此，綜合以上菌落特征、顯微特征和rDNA-ITS序列的分析，初步確認(rèn)菌株Ma-1-4為青霉菌屬。

3 討論

圖5 基于rDNA-ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

飼料中霉菌毒素的污染是一個(gè)普遍現(xiàn)象。雖然物理吸附是當(dāng)前控制飼料霉菌毒素污染的主要途徑，但物理吸附劑常常只對(duì)某一種霉菌毒素有較強(qiáng)選擇性，對(duì)其他種類的霉菌毒素選擇性不強(qiáng)，并且物理吸附劑還易導(dǎo)致對(duì)營養(yǎng)素的吸附，從而可能影響營養(yǎng)素的吸收。生物降解是近年來國內(nèi)外霉菌毒素脫毒技術(shù)方面的一個(gè)研究熱點(diǎn)。霉菌毒素的生物降解技術(shù)具有安全性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)而被人們寄于厚望。目前生物降解研究較多的是真菌，如木霉、青霉、曲霉等。Matsushima等從動(dòng)物消化系統(tǒng)中分離獲得了能夠水解單端孢霉烯酯鍵的厭氧菌。Binder等首次從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到一株厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌，該菌可以在轉(zhuǎn)化DON和其他單端孢霉烯族毒素，從而部分地減輕飼料中毒素的毒性。Ikunaga等從土壤中分離到一株諾卡氏菌在MM培養(yǎng)基中10d后可以完全降解DON；He等分離到一株能夠氧化DON的塔賓曲霉NJA-1，15d內(nèi)對(duì) DON的平均降解率為94.4%，但降解產(chǎn)物未知；徐劍宏等利用富集培養(yǎng)的方法，從土壤和麥穗樣品中分離獲得一株徳沃斯氏菌，將該菌添加到小麥飼料中后，飼料中的DON毒素降解率達(dá)到75.47%，未明確降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。本研究從洛陽市周邊采集的土壤樣品中分離到了1株能降解嘔吐毒素的霉菌，其降解率為46%，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)初步鑒定其分別為青霉菌屬，但本研究分離的菌株降解DON的能力沒有文獻(xiàn)報(bào)道的高，這可能是分離的菌株不同有關(guān)。另外，分離到的青霉菌Ma-1-4在降解DON的過程中是否會(huì)產(chǎn)生其它的毒素，能否進(jìn)一步開發(fā)為用于降解飼料原料中的DON發(fā)酵菌株還需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。