崔 磊, 黎 江, 劉 輝, 吳紅平, 李林芳, 郝方元, 金華君, 錢其軍,

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所, 杭州 310018; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒基因治療實驗室, 上海 200438)

自表達(dá)SIRPα-Fc融合蛋白對T細(xì)胞功能的影響

崔 磊1, 黎 江2, 劉 輝2, 吳紅平2, 李林芳2, 郝方元2, 金華君2, 錢其軍1,2

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院新元醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所, 杭州 310018; 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒基因治療實驗室, 上海 200438)

探討攜帶SIRPα-Fc(SF)融合基因蛋白基因的重組腺病毒Ad35-SF感染T細(xì)胞后對T細(xì)胞功能的影響。腺病毒Ad35-SF感染Jurkat T細(xì)胞后,通過Western blotting及ELISA方法檢測細(xì)胞上清中SF融合蛋白的大小與表達(dá)量;通過流式分析技術(shù)檢測細(xì)胞表面CD47的封閉情況;通過CCK8方法檢測細(xì)胞的增殖與對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明,Ad35-SF構(gòu)建成功,其感染Jurkat T細(xì)胞后,能在其內(nèi)表達(dá)并分泌產(chǎn)生大小約為48 kD的SF蛋白,細(xì)胞上清中SF的表達(dá)量可到達(dá)19.1 μg/mL。Ad35-SF(MOI=1)感染Jurkat細(xì)胞18 h后,細(xì)胞CD47陽性比例從97.06%下降到15.32%;當(dāng)Ad35-SF感染復(fù)數(shù)增加至5,10時,CD47陽性比率進(jìn)一步降低至2.94%和1.73%。相對于空病毒對照組,Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞48 h后其增殖效果提高了29%,對肝癌細(xì)胞株Hep 3B的殺傷作用提升25.6%(p<0.01)。結(jié)果表明構(gòu)建的重組腺病毒Ad35-SF能有效感染Jurkat細(xì)胞并在其內(nèi)表達(dá)分泌SF蛋白,封閉細(xì)胞表面的CD47,同時顯著提高Jurkat細(xì)胞的增殖能力和對肝癌細(xì)胞的殺傷作用。

CD47; T細(xì)胞; 腺病毒; 肝癌

0 引 言

CD47是腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的膜蛋白[1],其能與巨噬細(xì)胞表面的CD47的受體—信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal Regulatory Protein α,SIRP α)結(jié)合,釋放“不吃我”信號,抑制巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[2-3]。研究表明,當(dāng)CD47與SIRPα的結(jié)合被阻斷后,可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對腫瘤的吞噬作用[4-6]。另有研究表明,活化的T淋巴細(xì)胞中CD47高表達(dá)[7-8],其能與另一種CD47受體——血小板反應(yīng)蛋白1(Thrombospondin-1,TSP1)結(jié)合,抑制T淋巴細(xì)胞的增殖與活化,進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[9-12]。因此,封閉細(xì)胞表面的CD47將有助于維持巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬以及T淋巴細(xì)胞的增殖與活化。

在本研究中,筆者將來自于SIRPα突變株CV1(由Weiskopf等[13]發(fā)現(xiàn))、具有高親和力結(jié)合CD47的作用的肽段與人類IgG1的Fc段基因融合,組成SF融合基因嵌入到35型非增殖型腺病毒中。利用新構(gòu)建的腺病毒Ad35-SF感染T淋巴細(xì)胞,原位表達(dá)并分泌SF蛋白從而封閉細(xì)胞表面的CD47。本實驗選用易于被腺病毒感染的Jurkat細(xì)胞作為研究對象,探索封閉CD47的Jurkat細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的殺傷影響,為病毒Ad35-SF感染CTL細(xì)胞以及CIK細(xì)胞后對腫瘤細(xì)胞殺傷影響的研究提供指導(dǎo)。

1 實 驗

1.1 實驗材料與儀器

用于鑒定病毒和SF基因的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成(合成的引物序列如表1)。E.coliDH5α菌,腺病毒載體pPE3-F35,載體質(zhì)粒pDC898,SIRPα-Fc(SF)基因模板質(zhì)粒均由第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院基因-病毒治療實驗室構(gòu)建保存。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)血清、培養(yǎng)液購于Gibco公司,人胚腎細(xì)胞HEK293、肝癌細(xì)胞Hep-3B由第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院基因-病毒治療實驗室保存?zhèn)溆?。羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗兔IgG-HRP、鼠抗人IgG-HRP均購于Abcam公司,流式細(xì)胞儀guava easycyte BHT購于MERCK公司,ChemiDocXRS購于伯樂生物公司,同型抗體鼠抗人IgG-FITC以及鼠抗人CD47-FITC抗體均購于BD公司。CCK8試劑盒購于同仁化學(xué)。

1.2 實驗方法

1.2.1 病毒包裝、擴(kuò)增和鑒定

將pDC898和pCA19-SF通過SalI和EcoR I雙酶切,pDC898酶切產(chǎn)物電泳回收5 262 bp的基因片段,pCA19-SF酶切產(chǎn)物電泳回收1 143 bp的基因片段。所得的大小片段產(chǎn)物進(jìn)一步連接、轉(zhuǎn)化,挑取陽性克隆,抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送北京六合華大基因有限公司測序。命名正確的質(zhì)粒為pDC898-SF。隨后將質(zhì)粒pDC898-SF與腺病毒骨架質(zhì)粒pPE3-F35利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝并獲得4個Ad35-SF病毒株。應(yīng)用Qiagen DNA Kit提取重組腺病毒DNA,對病毒基因組進(jìn)行PCR鑒定,采用有限稀釋法測定病毒滴度。

1.2.2 Western blotting法檢測

Jurkat細(xì)胞采用1640+10%胎牛血清(FBS)培養(yǎng)液。0.25%胰酶消化細(xì)胞、傳代,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。使用重組病毒Ad35-SF分別以MOI=1、5、10感染5×105/孔的Jurkat細(xì)胞,饑餓感染2 h后,每孔補(bǔ)加2%的FBS和無血清的1640培養(yǎng)液至終體積為3 mL,感染48 h后收取上清。將收集到的上清加入蛋白上樣緩沖液100℃煮10 min。冷卻后以每孔10 μL的量上樣,經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗(兔抗人IgG)4℃孵育過夜,洗膜,二抗(鼠抗兔IgG-HRP)室溫孵育45 min,洗膜。將ECL試劑作用于PVDF膜上,暗室反應(yīng)5 min于ChemiDocXRS儀器上拍攝。

1.2.3 ELISA法檢測

采用雙抗夾心法:用包被液將羊抗人IgG抗體稀釋到1.0 μg/mL,100 μL/孔包被酶標(biāo)板,4℃過夜;PBST清洗5次拍干,每孔加入100 μL封閉液(2% BSA),37℃孵育1 h;PBST清洗5次拍干;加入樣品(PBS 100倍稀釋1.2.2中收集的上清)及標(biāo)準(zhǔn)品(即西妥昔單抗,經(jīng)PBS連續(xù)倍比稀釋,500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8 ng/mL和0 ng/mL),100 μL/孔,設(shè)復(fù)孔及對照孔,37℃孵育50 min;PBST清洗拍干;用封閉液將鼠抗人IgG-HRP稀釋到0.5 ng/mL,100 μL/孔,37℃孵育45 min;PBST清洗排干,加入底物顯色液(TMB),100 μL/孔,37℃避光顯色10 min;每孔加入50 μL終止液,在酶標(biāo)儀450 nm處測OD值;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算SF蛋白的表達(dá)量。

1.2.4 流式檢測

以每孔5×106個Jurkat細(xì)胞鋪六孔板,24 h后收集細(xì)胞,加入鼠抗人抗CD47-FITC 3 μL,以加入等量同型對照抗體及不添加任何抗體的細(xì)胞作為對照,避光孵育15 min后流式細(xì)胞儀測試Jurkat細(xì)胞的CD47表達(dá)量。

同理,分別以MOI=1、5和10的Ad35-SF病毒量感染Jurkat細(xì)胞,18 h后收集細(xì)胞檢測感染病毒后CD47的表達(dá)量,以感染未攜帶目的基因的空病毒Ad35(MOI=10)的樣品作為對照;以MOI=1的Ad35-SF病毒量感染Jurkat細(xì)胞,分別在感染24、48、72 h后收集細(xì)胞,檢測CD47的表達(dá)量,以MOI=1感染Ad35病毒72 h后收集的樣品作為對照。

1.2.5 CCK8法檢測細(xì)胞增殖

將Jurkat細(xì)胞3×105/孔鋪六孔板,分別加入Ad35病毒組和Ad35-SF(MOI=5)。饑餓感染2 h后,每孔補(bǔ)加2%的FBS和無血清的1 640培養(yǎng)液至終體積為3 mL,混勻后使用排槍轉(zhuǎn)移至96孔板,2 000個/孔。48 h后,每孔加入10 μL CCK8,1.5 h后于450 nm測吸光值。同時,繪制Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量/OD標(biāo)準(zhǔn)曲線(經(jīng)1 640連續(xù)倍比稀釋,12 000、6 000、1 500、750、375、187.5、93.75個/孔),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 CCK8法檢測Jurkat T細(xì)胞的殺傷

將Hep3B細(xì)胞以1×104/孔鋪96孔板,每孔加100 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁后,移去舊培養(yǎng)液。根據(jù)不同效靶比(E/T=1、2、5)加入Ad35-SF病毒感染后的Jurkat-SF細(xì)胞(MOI=5),補(bǔ)含2% FBS的1640培養(yǎng)液至200 μL,并設(shè)僅接種Hep3B細(xì)胞孔,僅接種Jurkat細(xì)胞孔以及含2% FBS的1640培養(yǎng)液對照孔,含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液對照孔。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)共培養(yǎng)12 h,加入CCK8試劑,30 min后在450 nm測吸光值。同時,繪制Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量/OD標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)胞數(shù)量曲線(經(jīng)1640連續(xù)倍比稀釋,500 000、250 000、125 000、62 500、31 250、15 625、7 812.5、3 906.25個/孔)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得細(xì)胞數(shù),計算裂解率，裂解率=[(靶細(xì)胞數(shù)量+效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量-實驗組細(xì)胞數(shù)量)/靶細(xì)胞數(shù)量]×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組病毒Ad35-SF的構(gòu)建與鑒定

將高親和力結(jié)合CD47分子的SIRPα突變株CV1基因片段與人類IgG1的Fc段基因融合成SIRPα-CV1-IgG1 Fc(簡稱SF),使用T細(xì)胞高活性啟動子TCEFI控制SF融合蛋白的表達(dá),將該表達(dá)框插入腺病毒E1區(qū);同時,將E3區(qū)原有的5型纖毛替換成5/35型纖毛,以增強(qiáng)病毒對T細(xì)胞的感染效率,構(gòu)建獲得的5/35嵌合纖毛、非增殖型腺病毒命名為Ad35-SF(模式見圖1)。

分別以SF基因、5/35型的纖毛蛋白基因、TCEFI啟動子及野毒E1A基因特異引物對包裝獲得的腺病毒進(jìn)行PCR鑒定,理論上使用對應(yīng)的引物應(yīng)分別能擴(kuò)增出1 143、879、1 882 bp和779 bp的片段產(chǎn)物。PCR片段電泳顯示,4個Ad35-SF病毒株不同基因片段的擴(kuò)增結(jié)果與理論結(jié)果相符,表明包裝的4個Ad35-SF病毒株均正確(圖2)。

2.2 病毒感染Jurkat細(xì)胞后SF蛋白的表達(dá)鑒定

使用Ad35-SF 1號克隆,MOI=1、5、10,分別感染Jurkat細(xì)胞48 h。Western blotting檢測顯示,分泌的SF蛋白大小約為48 kD,與理論的大小相符(因SIRPα存在轉(zhuǎn)錄后的不同修飾,而雜交出大小相近的兩條帶)(圖3)?？梢?隨著病毒感染量的增加,SF蛋白的分泌量增強(qiáng)(圖3)。

ELISA檢測結(jié)果顯示,不同MOI的Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞后,均能檢測到SF蛋白的表達(dá)。MOI=1時,培養(yǎng)液中SF蛋白的分泌量為2.1 μg/mL;MOI=5時,培養(yǎng)液中SF蛋白的量為13.7 μg/mL;MOI=10時,培養(yǎng)液中SF蛋白的量達(dá)到19.0 μg/mL(圖3b);在空白對照中,無病毒感染的Jurkat細(xì)胞上清沒有檢測到SF蛋白。表明隨著Ad35-SF病毒感染量的值提高,培養(yǎng)液中分泌的SF蛋白量也在相應(yīng)增加,其中在MOI=10時,培養(yǎng)液中SF蛋白的量最高,與Western blot結(jié)果相一致。

2.3 病毒感染Jurkat細(xì)胞后對其細(xì)胞表面CD47 的封閉作用檢測

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,未經(jīng)處理過的Jurkat細(xì)胞的CD47陽性比例為96.81%(如圖4a)。MOI=1、5、10的Ad35-SF病毒感染Jurkat細(xì)胞18 h小時后,CD47的陽性率分別降為15.32%、2.94%、1.73%(如圖4b)。MOI=1的Ad35-SF病毒感染Jurkat細(xì)胞24、48、72 h后,CD47的陽性率分別為3.97%、3.60%、2.36%(如圖4c)。結(jié)果表明,使用Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞后,CD47的陽性率能顯著、快速下降,表明Ad35-SF感染Jurkat細(xì)胞能通過自分泌的SF蛋白,有效封閉Jurkat細(xì)胞表面的CD47分子。

2.4 病毒Ad35-SF對Jurkat細(xì)胞的增殖影響

病毒感染細(xì)胞48 h后,在酶標(biāo)儀上測得Ad35-SF組、Ad35組、空白對照組的OD值分別為0.629、0.482、0.527(如圖5a),代入Jurkat細(xì)胞數(shù)量曲線可以計算出Ad35-SF組、Ad35組、空白對照組實際的細(xì)胞數(shù)量分別為5 235、3 539和4 058。相較空白對照組和Ad35組,Ad35-SF組Jurkat細(xì)胞的增殖效果分別提高29%和47.9%(p<0.01)(圖5b)。

2.5 Ad35-SF病毒對Jurkat細(xì)胞殺傷Hep3B細(xì)胞 的影響

對各組的OD值進(jìn)行計算,如圖6,Ad35-SF組中(E/T=1、2、5)Jurkat細(xì)胞對Hep3B細(xì)胞裂解率分別為37.65%、55.30%、80.65%;Ad35組中(E/T=1、2、5)Jurkat細(xì)胞對Hep3B細(xì)胞裂解率分別為21.05%、33.70%、57%;空白對照組中(E/T=1、2、5)Jurkat細(xì)胞對Hep3B細(xì)胞裂解率分別為16.05%、28.75%、54.95%。結(jié)果表明,3個不同實驗組均隨著效靶比的提高,Jurkat細(xì)胞對Hep3B細(xì)胞的裂解率逐漸加強(qiáng);但Ad35-SF組的裂解率在各個效靶比上均明顯優(yōu)于其它兩組(p<0.01)。已有文獻(xiàn)表明CD47調(diào)節(jié)著T細(xì)胞的活化與死亡,抑制T細(xì)胞CD47的表達(dá),能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖及活化[12,14]。這就與筆者的殺傷以及增殖實驗結(jié)果吻合,當(dāng)Jurkat細(xì)胞表面CD47被封閉后,Jurkat細(xì)胞自身的增殖和殺傷能力被顯著提高。另外,在體內(nèi)封閉CD47(包括腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞),除能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用外,還能夠改善腫瘤微環(huán)境、增強(qiáng)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞在腫瘤部位的聚集,促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和殺傷[12]。因而,當(dāng)將自表達(dá)SF融合蛋白的T細(xì)胞回輸體內(nèi)后,能通過上述多種途徑增強(qiáng)抗腫瘤效果。但由于時間關(guān)系,我們未能及時完成相應(yīng)的體內(nèi)研究。

3 結(jié) 論

a) 成功構(gòu)建T細(xì)胞高活性的表達(dá)系統(tǒng)。b) 成功構(gòu)建重組腺病毒載體Ad35-SF:證實其結(jié)構(gòu)正確并可在體外高效表達(dá)SF融合蛋白;c) Ad35-SF能夠增強(qiáng)T細(xì)胞功能:在短時間內(nèi)高效封閉Jurkat細(xì)胞以及CIK細(xì)胞表面CD47,并促進(jìn)Jurkat的增殖以及體外殺傷肝癌細(xì)胞株Hep3B的能力。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Effect of Self-Expression of SIRPα-Fc Fusion Protein on T Cell Function

CUI Lei1, LI Jiang2, LIU Hui2, WU Hong-ping2, LI Lin-fang2, HAO Fang-yuan2, JIN Hua-jun2, QIAN Qi-jun1,2

(1. School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

This paper investigates the effect of T cell functions after recombinant adenovirus Ad35-SF with SIRPα-Fc (SF) fusion gene and protein gene infects T cells. After adenovirus Ad35-SF infected Jurkat T cells, the magnitude and expression quantity of SF fusion protein in suspension of Jurkat T cells were detected through Western blotting and ELISA. The closure condition of CD47 was detected through flow cytometry. Cell proliferation and killing capacity to cancer cells were detected through CCK8. The results show that Ad35-SF was successfully constructed; after it infected Jurkat T cells, 48 kD SF proteins could be expressed and secreted; SF expression quantity could reach 19.1 μg/mL in the suspension of Jurkat T cells. After Ad35-SF (MOI=1) infected Jurkat cells for 18h, the proportion of CD47-positive cells dropped to 15.32% from 97.06%. When infection multiplicity of Ad35-SF increased to 5h and 10h, the proportion of CD47-positive cells further declined to 2.94% and 1.73%, respectively. Relative to the control group, the proliferation increased by 29% after Ad35-SF infected Jurkat cells for 48h, and skilling effect on hepatocellular carcinoma cell line Hep3B increased by 25.6% (p<0.01). The above results show that recombinant adenovirus Ad35-SF can effectively infect Jurkat cells, express and secrete SF protein as well as close CD 47 on cell surface. Meanwhile, it can significantly boost proliferation capacity of Jurkat cells and skilling effect on hepatoma carcinoma cells.

CD47; T cell; adenovirus; liver cancer

1673- 3851 (2015) 05- 0712- 06

2014-12-15

國家自然科學(xué)基金項目(81071850)

崔 磊(1989-),男,山西運(yùn)城人,碩士研究生,主要從事靶向基因—病毒治療方面的研究。

錢其軍,E-mail:qianqj@sino-gene.com

Q789

A