王晶晶　朱明利　劉壽榮★

納米細(xì)菌及其與結(jié)石性疾病的研究進(jìn)展

王晶晶朱明利劉壽榮★

納米細(xì)菌（NB），又稱為納米鈣化顆粒（CNP），是納米級的球形或球桿狀顆粒，它是單純的晶體結(jié)構(gòu)還是新的生命形式是現(xiàn)代微生物學(xué)一個最大的爭議，雖然納米細(xì)菌的性質(zhì)仍在爭論中，但對其的研究已經(jīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展開，尤其與病理性鈣化疾病的研究取得了較大的進(jìn)展，本文就其做一綜述。

1　納米細(xì)菌

1.1納米細(xì)菌的生物學(xué)特征 納米細(xì)菌是芬蘭科學(xué)家Kajander等［1］在胎牛血清中首先發(fā)現(xiàn)并命名的特殊生物微粒，直徑約80～ 500nm，革蘭染色陰性，呈球狀或球桿狀，細(xì)胞壁厚，無莢膜與鞭毛。廣泛存在于礦物質(zhì)中和生物體內(nèi)，存在于人體的血液、尿、膽汁、前列腺液和其他許多器官組織中。Kajander等［1］將從胎牛血清中分離得到的納米細(xì)菌進(jìn)行16S r RNA檢測，并將其歸類于α2亞群布魯菌（包括巴爾通體屬和布氏桿菌屬）。由于缺乏令人滿意的16SrRNA 序列，故又稱其為納米鈣化顆粒（CNP）。其具有獨特的生物礦化特性：在pH7.4的生理性鈣磷濃度中，能分泌羥基磷灰石類的鈣化物，形成礦化的生物被膜，覆蓋于菌體周圍，使其能耐受高溫、強酸等多種不利理化因素，并能抵抗多種抗生素的打擊。1.2 納米細(xì)菌的培養(yǎng) 納米細(xì)菌培養(yǎng)條件：37℃、pH7.4、5%CO2，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM或RPMI1640，加入10%胎牛血清更利于繁殖，但其仍生長緩慢。NB倍增時間為3d，傳代1次/月，可連續(xù)傳5年，并能保持原有的生長特性。有文獻(xiàn)報道在培養(yǎng)基中加入堿性磷酸酶可加速其生長。郭亞楠等［2］對納米細(xì)菌的培養(yǎng)進(jìn)行探討，一方面改進(jìn)培養(yǎng)基，將10%胎牛血清的濃度提高到30%，認(rèn)為既增加了營養(yǎng)，又減少了因為換液而帶來的污染；另一方面，分別采用細(xì)菌培養(yǎng)箱和細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行納米細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果顯示在生長速度方面兩者差異不大，但是兩組納米細(xì)菌的外殼狀態(tài)差異明顯，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下納米細(xì)菌只有少量礦化外殼，而細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)境下納米細(xì)菌產(chǎn)生很厚的礦化外殼。

1.3納米細(xì)菌的檢測 目前對納米細(xì)菌的檢測主要包括：

免疫組化染色法、透射電鏡掃描法、鈣染色法、PCR法、Hoechst33258DNA染色法等。但以上方法存在著一定的非特異性，故一般聯(lián)合采用多種方法對其進(jìn)行檢測鑒定。（1）免疫組化染色法：是公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)。利用無水乙醇/乙醚（1：1）混合液固定15min，采用SABC法。判斷標(biāo)準(zhǔn)：在高倍視野可見微小的黃色至棕黃色桿狀或球狀顆粒者為納米細(xì)菌。（2）間接免疫熒光法：一般采用單克隆抗體免疫熒光法。4%多聚甲醛固定15min，水洗70℃烤10min，滴加一抗（8D10），37℃孵育60min，PBS沖洗（2min×3次），滴加二抗，37℃孵育40min，PBS沖洗（2min×3次），80%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：高倍視野下可見綠色的桿狀或球狀顆粒分布。（3）透射電鏡掃描（負(fù)染法）：將標(biāo)本用2.5%的戊二醛固定，將細(xì)菌稀釋液滴在有膜的銅網(wǎng)上，靜置數(shù)分鐘后，用濾紙尖吸掉，用3%磷鎢酸染色1～2min，置于電鏡下觀察照相。判斷標(biāo)準(zhǔn)：呈球狀或球桿狀，大小100～500nm，菌體周圍有一層黑色物質(zhì)包繞。（4）掃描電鏡法：將培養(yǎng)物低溫離心沉淀（14000g、4℃、30min），沉淀用PBS反復(fù)沖洗3次，3%戊二醛固定（4℃、2h），1%四氧化二鋨（4℃、1h），梯度乙醇脫水，臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡下觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：納米細(xì)菌成簇成長，球狀或桿狀，外殼呈毛刺狀。（5）鈣染色 包括Dahl McGee-Russel茜素紅鈣染色和Von kossa染色法。Dahl McGee-Russel茜素紅鈣染色：將標(biāo)本涂片固定，2%茜素紅2s染液初染2～5min，0.2%淡綠水溶液復(fù)染20～30s，0.5%醋酸水溶液速洗；95%乙醇和100%乙醇脫水，烘干后用二甲苯透明中性樹膠封固，顯微鏡觀察。判斷標(biāo)準(zhǔn)：油鏡下觀察納米細(xì)菌體積極其微小，聚集成簇。Vonkossa染色法：標(biāo)本滴于載玻片上，放入5%硝酸銀溶液中避光15min，于紫外燈下照射15 min，沖洗3 min，5%硫代硫酸鈉水溶液處理，沖洗3 min，0.1%核固紅染液復(fù)染1 min，蒸餾水洗3 min。判斷標(biāo)準(zhǔn)：染色后納米細(xì)菌呈棕褐色。（6）PCR法：對用PCR法檢測納米細(xì)菌存在很大的爭議，有學(xué)者認(rèn)為納米16sRNA序列與周圍環(huán)境中的污染菌高度同源，故認(rèn)為PCR法對納米細(xì)菌的鑒定沒有任何意義。但有些學(xué)者亦認(rèn)為PCR法不需要培養(yǎng)，縮短了檢測的時間，減少了污染，是簡單、快速、低成本的檢測方法。郭桂林［3］分別用PCR和ELASA法檢測肝病患者血中納米細(xì)菌（NB），結(jié)果顯示兩種方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為PCR法對NB的檢測是一可靠的檢測方法。（7）Hoechst33258進(jìn)行DNA染色：Hoechst33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光燃料，常用于細(xì)胞凋亡檢測，也用于普通細(xì)胞核染色，或常規(guī)DNA染色。Kajander等將用Hoechst33258進(jìn)行DNA染色，發(fā)現(xiàn)濃度由0.5mg/ml提高至5mg/ml，熒光顯微鏡下可見特征性的熒光。而Raoult等研究發(fā)現(xiàn)不著色。此外，還有熒光定量RT-PCR法，免疫電鏡法等。

1.4關(guān)于納米細(xì)菌的爭議 爭議主要體現(xiàn)在以下幾個方面：（1）大?。杭{米細(xì)菌的直徑大約為80～ 500nm，研究認(rèn)為一個具有自我復(fù)制能力的生命形式的最小尺寸大約為140 nm，但Glass等［4］研究亦發(fā)現(xiàn)支原體能達(dá)到更小的尺寸，僅含43個RNA編碼基因和387個蛋白質(zhì)編碼基因，所以僅從大小不能判斷NB是否為微生物。（2）新陳代謝：納米細(xì)菌的新陳代謝極其緩慢，是普通細(xì)菌的萬分之一，具有有限的新陳代謝。然而barba等［5］將H-NMR光譜用于評估NB培養(yǎng)基的代謝改變，結(jié)果顯示培養(yǎng)6周的培養(yǎng)基與未培養(yǎng)的培養(yǎng)基沒有區(qū)別，認(rèn)為未檢測到任何代謝活動。（3）自我復(fù)制：納米細(xì)菌能進(jìn)行自我復(fù)制，掃描電鏡下可見到納米細(xì)菌一分為二以及融合成一個團塊等表現(xiàn)。但Young等［6］研究將其定義為仿生特性，包括細(xì)胞樣和組織樣的外形，具有生長、增殖和傳播的能力，但其本質(zhì)是被胎球蛋白包裹的純粹的納米羥基磷灰石顆粒。（4）16S rRNA：目前為止，仍缺乏準(zhǔn)確的基因組序列，而其16SrRNA又被有些學(xué)者認(rèn)為是實驗污染。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌的16SrRNA 同紫金牛葉桿菌幾乎相同。Barba等［5］將培養(yǎng)6周的CNP進(jìn)行實時PCR，在排除已知的細(xì)菌外，所有樣本的16sRNA均呈陰性。（5）核酸：是否具有核酸，是納米細(xì)菌是否為微生物的一個爭議重點。Kajande等［1］用Hoechst33258對納米細(xì)菌DNA進(jìn)行染色，將濃度由0.5ml提高至5ml，在熒光顯微鏡下見特征性的熒光，由此認(rèn)為納米細(xì)菌存在DNA。但是Raoult［7］應(yīng)用hoechst 33258進(jìn)行DNA染色，結(jié)果顯示不著色，從而認(rèn)為納米細(xì)菌不存在核酸。Miller等［8］將DNA探針放入納米細(xì)菌勻漿，結(jié)果提示納米細(xì)菌存在核酸。（6）單克隆抗體：單克隆抗體的特異性也受到質(zhì)疑，Martel和Young［9］報道，認(rèn)為這些抗體能與人類和牛血清白蛋白（BSA）起反應(yīng)，因此不能作為一個活的微生物的特異性標(biāo)志物。Hiromi Kumon［10］等也提出了一些NB的單克隆抗體，研究顯示所有的IgG類抗體對各種已知的蛋白質(zhì)顯示出特異性，也包括BSA。

2　納米細(xì)菌與疾病

2.1納米細(xì)菌的細(xì)胞毒性和致病機制 現(xiàn)有研究認(rèn)為納米細(xì)菌具有細(xì)胞毒性，能感染細(xì)胞和組織，分泌鈣化脂多糖生物膜，使細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生鈣化，并分泌一些細(xì)胞毒素及細(xì)胞因子，引起感染組織的炎癥反應(yīng)，伴炎癥因子的趨化與釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞的空泡樣變性、溶解或凋亡。于澄釩等［11］將NB與腎小管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到大量細(xì)胞胞體膨脹增大，胞核及胞漿松散，部分胞膜溶解或核仁不可見，少數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見空泡樣變。Zhang MJ等［12］將NB和人工合成的納米羥基磷灰石（nHAPs）分別作用于MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞，觀察到NB和nHAPs都會降低癌細(xì)胞活性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，但是NB的作用明顯強于nHAPs，可能是源于NB能產(chǎn)生有毒的代謝物或其蛋白質(zhì)成分。

2.2納米細(xì)菌與病理性鈣化疾病 目前的研究認(rèn)為納米細(xì)菌在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，尤與病理性鈣化的關(guān)系密切。1998年Kajander等［1］對腎結(jié)石與NB關(guān)系進(jìn)行研究，開啟了NB與疾病研究的先河，認(rèn)為NB是作為結(jié)石核心而起作用，類似于幽門螺桿菌。

近年來研究認(rèn)為納米細(xì)菌是血管病理性鈣化的一個潛在原因，研究主要集中在二尖瓣環(huán)鈣化［13］、冠狀動脈鈣化［14］、

動脈粥樣硬化［15］等。膽結(jié)石的形成是多因素作用的結(jié)果，主要包括細(xì)菌感染、脂代謝紊亂、膽囊動力學(xué)紊亂、致石基因與遺傳等方面。而膽汁納米細(xì)菌感染與膽囊結(jié)石的發(fā)生有關(guān)。張雷等［16］將膽汁中培養(yǎng)出的納米細(xì)菌與大腸桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)，并進(jìn)行茜素紅鈣染色，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組的鈣染色呈桔紅色，而普通大腸桿菌呈淡紅色，認(rèn)為納米細(xì)菌通過直接附著和侵入大腸桿菌的方式引起大腸桿菌發(fā)生生物礦化作用。王利明［17］將一定量的納米細(xì)菌注射到兔子膽囊中，作用2周后，可見膽囊中形成結(jié)石（15/20），與對照組差異顯著（2/10）。通過紅外光譜定性分析，歸類為黑色素結(jié)石。劉亞楠等［18］將納米細(xì)菌感染日本大耳白兔，顯示有膽結(jié)石形成，其結(jié)果與王利民等的研究一致。此外，納米細(xì)菌與胎盤鈣化［19］、牙結(jié)石［20］等關(guān)系密切。

2.3針對納米細(xì)菌的治療 抗納米細(xì)菌療法：由乙二胺四乙酸（EDTA）和四環(huán)素組成，其機制為EDTA先溶解納米細(xì)菌的鈣化外殼，再發(fā)揮四環(huán)素的穿透殺菌作用。有研究表明抗納米細(xì)菌治療，能有效改善冠脈的狹窄程度，緩解心絞痛癥狀。袁宇峰［21］等將該療法應(yīng)用于Ⅲ型前列腺炎，經(jīng)過為期3個月的治療患者的納米細(xì)菌陽性率、前列腺液卵磷脂小體及NIH-CPSI評分均較治療前有明顯改善。明愛民等［22］研究認(rèn)為四環(huán)素可作為納米細(xì)菌感染的Ⅲ型前列腺炎效果顯著，可作為一線藥物。

3　研究展望

未來的研究可從以下幾個方面展開：（1）繼續(xù)完善其DNA 序列的提取，擴大納米細(xì)菌樣本的研究。（2）由于納米細(xì)菌的培養(yǎng)周期長，不利于對納米細(xì)菌進(jìn)行研究，應(yīng)進(jìn)一步探索其培養(yǎng)方法。（3）納米細(xì)菌的致病機制有待進(jìn)一步研究，根據(jù)其細(xì)胞毒性，可以用于化療等方面。（4）尋求更直接、準(zhǔn)確的檢測方法，運用于臨床檢驗。（5）抗納米細(xì)菌療法來預(yù)防、治療結(jié)石相關(guān)疾病。

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