李雪麗 范吉平 梁麗娜

·綜述·

干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的研究進(jìn)展

李雪麗1，2范吉平2，3梁麗娜2

干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的研究近年來受到廣泛關(guān)注，這些研究通過移植胚胎干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、骨髓來源干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等促進(jìn)受損視網(wǎng)膜修復(fù)并改善視功能，個(gè)別研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，為視網(wǎng)膜色素變性和年齡相關(guān)性黃斑變性等患者帶來復(fù)明的希望。本文對(duì)這一領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀予以綜述，并就其發(fā)展前景和面臨的挑戰(zhàn)予以討論。

視網(wǎng)膜退行性病變；干細(xì)胞治療

視網(wǎng)膜退行性疾病包括視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）等，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）及感光細(xì)胞進(jìn)行性損傷、丟失而引起視網(wǎng)膜功能障礙，最終導(dǎo)致患者視力喪失至失明，此類疾病至今仍無有效的治療方法。干細(xì)胞移植是近年來廣受關(guān)注的基于細(xì)胞替代策略的視網(wǎng)膜退行性疾病治療方法，并被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景和臨床轉(zhuǎn)化潛能的治療策略之一。本文將對(duì)這一研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展及面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 供體干細(xì)胞來源

干細(xì)胞是生物個(gè)體生長發(fā)育中具有自我更新、增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。目前較多用于視網(wǎng)膜移植研究的主要有胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞（retinal progenitor cells，RPCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等。

1.1 視網(wǎng)膜前體細(xì)胞

RPCs來源于胎兒或新生兒視網(wǎng)膜組織，是由多種未成熟前體細(xì)胞組成的細(xì)胞群，在胚胎發(fā)育過程中生長成完整的視網(wǎng)膜組織。自1991年，研究者相繼報(bào)道〔1，2〕體外誘導(dǎo)可促使RPCs增殖分化生成新的視網(wǎng)膜神經(jīng)元和各種視網(wǎng)膜支持細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，RPCs能夠遷移至視網(wǎng)膜各層，并發(fā)育成具有典型形態(tài)特征的各種視網(wǎng)膜細(xì)胞〔3，4〕。盡管這些研究都有力的支持了RPCs具有治療視網(wǎng)膜退行性病變的潛能，但RPCs的增殖潛能是有限的，且視網(wǎng)膜下腔的免疫赦免環(huán)境也是相對(duì)的，因此RPCs的進(jìn)一步分離純化是其應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。

1.2 胚胎干細(xì)胞

ESCs是來源于胚泡期胚胎的內(nèi)細(xì)胞群，具有自我更新能力和分化成三胚層各種成體細(xì)胞的能力。因此，ESCs對(duì)于促進(jìn)功能性細(xì)胞的再生具有極大的治療優(yōu)勢(shì)，如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等。研究表明，小鼠及人ESCs（human ESCs，hESCs）能夠分化成光感受器前體細(xì)胞、光感受器和RPE細(xì)胞〔5-7〕。2004年，Haruta等〔8〕首次將食蟹猴ESCs來源的RPE細(xì)胞移植到RCS大鼠，以改善其視功能。2009年，Lamba等〔9〕將hESCs來源的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植到成年Crx（-/-）小鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞不僅能分化成功能性感光細(xì)胞，還能改善小鼠的視功能。其他研究顯示〔10〕，將hESCs-RPE細(xì)胞移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔隙可觀察到吞噬作用，并且感光細(xì)胞變性減慢，視網(wǎng)膜電生理活動(dòng)和視功能也得到較好的維持，表明這些細(xì)胞確實(shí)具有RPE細(xì)胞的形態(tài)及功能特征，如極性分布，吞噬作用，緊密連接及在視黃醇循環(huán)中的作用等。目前，hESCs-RPE移植的臨床試驗(yàn)亦得到開展。2012年，在美國先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司進(jìn)行的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，命名為MA09-hRPE的hESCs-RPE細(xì)胞懸浮液被移植到兩位患者（一位干性AMD患者和一位Stargardt患者）的視網(wǎng)膜下〔11〕，4個(gè)月后，兩位患者都沒有出現(xiàn)畸形瘤，視力也沒有下降。最近，Schwartz等報(bào)道〔12〕參加hESCs-RPE移植臨床研究的9名Stargardt患者和9名萎縮性AMD患者均未發(fā)現(xiàn)不良增生、排斥反應(yīng)及與移植相關(guān)的嚴(yán)重眼部及全身安全性問題，所發(fā)生的不良反應(yīng)與玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)及免疫抑制治療有關(guān)。其中13名患者（72%）在移植部位的視網(wǎng)膜下觀察到色素增加，治療眼中有10眼最佳矯正視力提高，7眼視力穩(wěn)定，1眼視力下降，對(duì)側(cè)未治療眼未發(fā)現(xiàn)視力提高。與視覺相關(guān)的生活質(zhì)量評(píng)分AMD患者中提高16～25分，Stargardt患者中提高8～20分，初步證明了細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變的安全性和有效性。然而，有關(guān)倫理、免疫排斥反應(yīng)及畸形瘤的形成仍然阻礙ESCs移植的進(jìn)一步應(yīng)用。在一項(xiàng)研究中〔13〕，視網(wǎng)膜下腔移植hESCs源性神經(jīng)前體細(xì)胞的小鼠有50%以上形成腫瘤，該研究中采用的神經(jīng)前體細(xì)胞僅是部分分化細(xì)胞，可能這些細(xì)胞比終端分化的hESCs-RPE細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤作用。

1.3 人胎兒干細(xì)胞

人胎兒干細(xì)胞（human foetal stem cells，F(xiàn)SCs）來源于各種胚胎和胚外組織，被認(rèn)為是與成體干細(xì)胞和ESCs不同的。有研究者〔14〕用酶解法從捐贈(zèng)流產(chǎn)胎兒（懷孕16～20周）腦組織中分離得到人類胎兒神經(jīng)干細(xì)胞，通過測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白CD133的表達(dá)進(jìn)行鑒定，純化的干細(xì)胞被注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔，細(xì)胞可在注射位點(diǎn)存活并遷移到視網(wǎng)膜各層，大鼠的視功能和視網(wǎng)膜組織學(xué)都有所改善，但移植的干細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出視網(wǎng)膜的形態(tài)特征或表達(dá)視網(wǎng)膜細(xì)胞特異標(biāo)志物，這一修復(fù)作用的確切機(jī)制還是未知的。最近，命名為HuCNS-SC的細(xì)胞已經(jīng)由美國干細(xì)胞公司開發(fā)，并用于一項(xiàng)16名干性AMD患者的臨床試驗(yàn)中，該試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

1.4 人臍帶組織來源干細(xì)胞

人臍帶組織來源干細(xì)胞（human umbilical tissue-derived stem cells，hUTSCs）能夠從捐贈(zèng)的流產(chǎn)胎兒臍帶獲得，通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增。2007年，Lund等〔15〕將hUTSCs懸液注射到80只RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔隙，治療組大鼠與對(duì)照組相比視功能得到了較好的改善，hUTSCs可能通過分泌高水平的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)神經(jīng)元存活而發(fā)揮修復(fù)作用。在這些研究基礎(chǔ)上，美國強(qiáng)生公司及其研究分支機(jī)構(gòu)合作開展了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，將命名為CNTO 2476的hUTSCs細(xì)胞系用于干性AMD患者的治療，這些細(xì)胞通過導(dǎo)管輸送系統(tǒng)經(jīng)過白色鞏膜纖維層和血管脈絡(luò)膜組織到達(dá)視網(wǎng)膜下腔隙，這項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

1.5 間充質(zhì)干細(xì)胞

MSCs來源于骨髓、脂肪組織、胎盤和肝組織等，MSCs有能力分化成中胚層細(xì)胞及非中胚層細(xì)胞，如心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞和胰島素生成細(xì)胞等。其中，骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived MSCs，BMMSCs）獨(dú)立于造血系統(tǒng)，具有自我更新能力和生長成多種組織的潛能。Kicic等〔16〕采用激活素A，牛磺酸和表皮生長因子體外誘導(dǎo)MSCs分化成能夠表達(dá)光感受器特異標(biāo)記物的細(xì)胞；體內(nèi)研究顯示，將MSCs注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔2周后，該細(xì)胞可整合到宿主視網(wǎng)膜并形成類似感光細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和表達(dá)其特異標(biāo)志物，整個(gè)過程未發(fā)現(xiàn)畸形瘤的形成。Inoue和Lu等〔17-18〕先后將MSCs和BMMSCs分別注射到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔隙，發(fā)現(xiàn)能夠減緩視網(wǎng)膜的變性，且MSCs可遷移到視網(wǎng)膜并分化成感光細(xì)胞，視覺功能也得到一定程度的改善。另一項(xiàng)研究〔19〕將BMMSCs注射到小鼠RP模型視網(wǎng)膜下腔，結(jié)果RPE和感光細(xì)胞形態(tài)都有所改善。

1.6 骨髓來源的極小胚胎樣干細(xì)胞

極小胚胎樣干細(xì)胞（very small embryonic like stem cells，VSEL）是小鼠骨髓中一種稀少的同源細(xì)胞群，表現(xiàn)為與ESCs相似的形態(tài)，可表達(dá)幾種ESCs的標(biāo)志物；在體外，VSEL具有分化成三胚層細(xì)胞的潛能〔20〕。VSEL是干細(xì)胞的游動(dòng)庫，當(dāng)出現(xiàn)以下情況時(shí)可被動(dòng)員到外周血：（1）小鼠及人急性心肌梗死〔21〕；（2）小鼠及人腦卒中〔20〕；（3）肝中毒或骨骼肌損傷后〔22〕；（4）STZ誘導(dǎo)的糖尿病〔23〕。體內(nèi)研究顯示〔24〕，NaIO3誘導(dǎo)的RPE變性小鼠模型經(jīng)生長因子處理后，BMCs被明顯動(dòng)員到外周血，并駐留在視網(wǎng)膜下腔。最近，研究者發(fā)現(xiàn)〔25〕VSEL在鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)，且占新生視網(wǎng)膜細(xì)胞約1.5%，VSEL也能夠分化成表達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)元特殊標(biāo)志物的細(xì)胞及類似RPE的細(xì)胞。

1.7 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

2006年Takahashi等〔26〕首次報(bào)道了來源于成體組織的iPSCs。iPSCs是由體外終端分化的體細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四個(gè)基因而重新編程得到的ESCs樣多能干細(xì)胞，iPSCs具有與ESCs相似的發(fā)育潛能，如形態(tài)特征，增殖能力，形成畸胎瘤等。2009年，Carr等〔27〕通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，人iPSCs來源的RPE細(xì)胞在形態(tài)和功能上均具有RPE細(xì)胞的典型特征，將其移植到RCS大鼠后感光細(xì)胞的功能得到較好的維持。此后，Tucker和Zhou等〔28，29〕分別將小鼠或豬iPSCs來源的光感受器前體細(xì)胞用于移植實(shí)驗(yàn)，取得了與ESCs相似的治療效果。Meyer等〔30〕采用信號(hào)分子程序性誘導(dǎo)人iPSCs細(xì)胞分化為各種視網(wǎng)膜細(xì)胞。以上研究表明，iPSCs移植可能是極具應(yīng)用前景的治療方法，能夠提供患者所需的無限細(xì)胞數(shù)量。然而，特定iPSCs的生成及應(yīng)用仍需考慮以下問題：（1）雖然視網(wǎng)膜下腔隙具有免疫豁免特性，原理上不需要使用免疫抑制藥物阻止排斥反應(yīng)，但由于遺傳信息改變產(chǎn)生的排斥反應(yīng)亦有報(bào)道〔31〕；（2）由患者自體iPSCs誘導(dǎo)生成的RPE或者感光細(xì)胞，仍然攜帶致病基因，需要對(duì)缺陷基因進(jìn)行修補(bǔ)，增加移植后細(xì)胞的存活率；（3）提高iPSCs在體外誘導(dǎo)分化成所需細(xì)胞的能力；（4）降低病毒整合和iPSCs生成癌基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)〔32〕。

2 被替代治療的靶細(xì)胞類型

2.1RPE細(xì)胞

RPE對(duì)于維持神經(jīng)視網(wǎng)膜的功能非常重要，是視網(wǎng)膜退行性疾病治療研究中最重要的干預(yù)靶點(diǎn)之一。目前，研究較多的是采用hESCs通過自然分化或直接誘導(dǎo)法產(chǎn)生RPE樣細(xì)胞。hESCs-RPE細(xì)胞非常接近視網(wǎng)膜內(nèi)源性RPE的形態(tài)和功能，六角形的hESCs-RPE以單層生長且顯示極性，頂端有微絨毛和含黑色素小顆粒的色素〔5〕。hESCs-RPE能夠表達(dá)視黃醇循環(huán)相關(guān)蛋白和RPE細(xì)胞特異性蛋白R(shí)PE65，PAX6的表達(dá)水平與胎兒RPE細(xì)胞相似〔33〕；且PEDF傾向于由細(xì)胞頂端表面分泌，緊密連接蛋白1僅在細(xì)胞邊界表達(dá)〔34〕。此外，在英國的“治愈失明倫敦計(jì)劃”項(xiàng)目中，研究者開發(fā)了一種可在聚合體薄片上以單層生長的hESCs-RPE細(xì)胞系，旨在克服當(dāng)RPE細(xì)胞以懸浮液被注射移植后以紊亂形式黏附在Bruch's膜上的缺點(diǎn)〔35〕。

2.2 感光細(xì)胞

在AMD和Stargardt等疾病進(jìn)程中，RPE功能缺陷是導(dǎo)致感光細(xì)胞變性死亡的重要原因，雖然RPE替代具有積極的治療作用，但感光細(xì)胞丟失導(dǎo)致的視力喪失是不可逆的。對(duì)于這些患者，可能重新獲得視力的治療策略是替代變性或死亡的感光細(xì)胞。胎兒視網(wǎng)膜是感光細(xì)胞的重要來源，具有重建退行性變視網(wǎng)膜的潛能。從胎兒組織分離的感光細(xì)胞移植到人和小鼠后能夠改善視覺功能〔36〕，但僅有整合到成熟視網(wǎng)膜的細(xì)胞能夠分化成功能性視桿細(xì)胞〔3〕。此外，由于胎兒組織來源的感光細(xì)胞的有限性以及倫理問題極大的限制了該方法的臨床應(yīng)用。相比之下，多能干細(xì)胞來源的感光細(xì)胞移植，則不存在以上問題。2006年，Lamba等〔6〕采用IGF1，nooggin（NOG）和DKK1誘導(dǎo)分化出了hESCs來源的感光細(xì)胞，相似的誘導(dǎo)方法還有定時(shí)去除NOG〔37〕或添加LEFTY等〔30，38〕。另外，感光細(xì)胞也可由小鼠或人iPSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生〔39〕。最近，Garita-Hernández等〔40〕在誘導(dǎo)小鼠ESCs分化為感光細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)相對(duì)缺氧的培養(yǎng)條件能夠顯著增加細(xì)胞產(chǎn)率，而這一相對(duì)缺氧（2%O2）與子宮組織常氧環(huán)境相近。因此，模擬胚胎發(fā)育環(huán)境可能是細(xì)胞產(chǎn)率增加的原因。此外，Zhu等〔34〕研究發(fā)現(xiàn)與hESCs-RPE細(xì)胞共培養(yǎng)的光感受器祖細(xì)胞存活率明顯增加，這提示雙重替代可能成為一個(gè)新興的治療策略，而RPE和光感受器以及組織工程支架組合形式的開發(fā)可能成為未來的研究方向。

3 干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病存在的問題

目前，干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的研究費(fèi)用昂貴，技術(shù)復(fù)雜，尚存在一些亟待解決的關(guān)鍵問題。首先，移植細(xì)胞與宿主組織的整合狀態(tài)是決定治療效果的關(guān)鍵因素。Wang等〔41〕將ARPE-19細(xì)胞和人雪旺細(xì)胞分別移植15周后，僅雪旺細(xì)胞能夠在視網(wǎng)膜RPE部位形成單層細(xì)胞，ARPE-19細(xì)胞雖然表現(xiàn)出RPE的特征，但未能形成單層細(xì)胞。Klimanskaya等〔33〕觀察到ESCs來源的RPE細(xì)胞以聚集形式移植后，不能在視網(wǎng)膜下腔RPE損傷處形成單層細(xì)胞。因此，有研究者提出了移植RPE細(xì)胞層來替代受損的RPE〔42〕，或者采用藥物干預(yù)來促進(jìn)移植細(xì)胞與宿主的整合〔43〕。其次，在視網(wǎng)膜退行性病變過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被激活并募集在病變部位形成屏障〔44〕，這在一定程度上阻礙了移植細(xì)胞于病變部位的增殖；而且，炎癥細(xì)胞釋放的過量的炎性因子〔45〕可能對(duì)移植細(xì)胞產(chǎn)生毒性而降低其成活率。此外，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是病灶主要的抗原呈遞細(xì)胞，其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是影響異體移植RPE和感光細(xì)胞長期存活的主要因素，并且隨著血-視網(wǎng)膜屏障的受損，眼部的免疫赦免環(huán)境也被破壞，致使無免疫抑制干預(yù)的異體移植細(xì)胞可能最終死亡。因此，在血-視網(wǎng)膜屏障功能重建之前，移植手術(shù)后采取免疫抑制干預(yù)是必要的。最后，仍有研究報(bào)道干細(xì)胞移植存在致瘤性〔13〕。因此，臨床試驗(yàn)之前，嚴(yán)格的干細(xì)胞篩選分化過程是非常重要的。

4 展望

既往研究已經(jīng)證明干細(xì)胞移植對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病視功能的改善具有極大的治療潛能，并正在從十多年的基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)向Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，這些臨床試驗(yàn)的結(jié)果初步表明干細(xì)胞治療基本符合預(yù)期效果，并摸索了移植術(shù)后所需免疫抑制的用量，探討了RPE替代和旁分泌模式之間的區(qū)別以及干細(xì)胞輸送方式等問題。理想的移植方法應(yīng)該具備高效率，高存活率，重復(fù)性好，宿主整合性好且不需要免疫抑制等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)保證干細(xì)胞來源容易獲取和不涉及倫理問題。雖然目前距理想的干細(xì)胞移植方法尚有一定距離，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各學(xué)科之間的交叉和促進(jìn)，相信干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性疾病的技術(shù)將日臻成熟并發(fā)揮更好的臨床作用。

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Research progress in stem cell-based therapies for retinal degenerative diseases

LI Xueli,FAN Jiping,LIANG Lina.Eye Hos-pital of China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China

Stem cell-based therapies for retinal degenerative diseases are underway.In recent studies,kinds of stem cells such as embryonic stem cell,umbilical cord stem cell,bone marrow-derived stem cells and induced pluripotent stem cell have been pursued to repair the damage of retina and improve visual function,and some studies have entered into clinical trials which brought hope to regain sight for patients suffering from retinitis pigmentosa and age related macula degeneration.In this review,we summarized the progress of stem cell-based approaches for treating retinal degenerative diseases and discussed the prospect and challenges in this field.

retinal degenerative diseases;stem cell-based therapy

R774.6

A

1002-4379（2015）06-0444-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.06.019

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81473736）

1中國中醫(yī)科學(xué)院博士后流動(dòng)站，北京100700

2中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院

3中國中醫(yī)科學(xué)院

梁麗娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com