董春霞何 琴

（1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401320）

犬布魯氏菌病實驗室診斷方法研究進展

董春霞1何 琴2

（1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120；2.重慶市巴南區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401320）

布魯氏菌?。˙rucellosis）又稱地中海弛張熱，馬耳他熱，波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病。以流產(chǎn)、不育、生殖器官和胎膜發(fā)炎為特征，人感染后可引起波浪熱為特征。自1887年（Bruce）首次從因布魯氏菌病死亡士兵脾中分到布氏菌迄今已百余年。據(jù)20世紀80年代末的報告，在世界200多個國家和地區(qū)中已有160多個存在人畜布魯氏菌病，分布于世界各大洲。該病在我國的內(nèi)蒙古、東北、西北等牧區(qū)曾一度流行，北方地區(qū)也有散發(fā)，由于布魯氏菌病對畜牧生產(chǎn)影響很大，造成了很大的損失，我國政府長期致力于牛、羊、豬等的布魯氏菌病預(yù)防和控制工作，但卻忽視了犬布魯氏菌病的防控、監(jiān)測和診斷治療。隨著人們生活水平的不斷提高，寵物犬的飼養(yǎng)數(shù)量也急劇增加，人與犬共眠同枕的現(xiàn)象也屢見不鮮，犬作為人類布魯氏菌病的重要傳染源之一不容忽視。單從臨床上來診斷布魯氏菌病是比較困難的，往往需要采用實驗室診斷技術(shù)才能對其確診，現(xiàn)階段犬布魯氏菌病實驗室技術(shù)方法研究進展做一綜述。

1 細菌學(xué)診斷方法

1.1 涂片檢查

將流產(chǎn)胎兒的胃內(nèi)容物、肺、肝和脾，以及流產(chǎn)胎盤和羊水等標本直接涂片，柯茲洛夫斯基鑒別染色可做出初步的疑似診斷，細菌呈紅色球狀小桿菌。

1.2 分離培養(yǎng)

對于疑似布魯氏菌感染的動物，做血液細菌分離培養(yǎng)是最具診斷性的檢測方法。培養(yǎng)后，按常規(guī)方法進行鑒定，也可用PCR方法、定量PCR方法鑒定。雖然細菌分離作為布魯氏菌病診斷的金標準，但是這種診斷方法煩瑣、培養(yǎng)鑒定時間長、試驗條件要求高，只能在具備相應(yīng)生物安全級別的實驗室進行，受實驗室條件限制很難進行。

2 血清學(xué)診斷方法

2.1 凝集試驗

快速平板凝集實驗（RSAT）是一種快速的檢測方法，具有特異、敏感、廉價、操作簡便的特點，但受驗溫度和凝集時間相對較短的影響，不易準確判定結(jié)果，所以，本方法主要作為布魯氏菌病監(jiān)測的初篩試驗。對RBPT陽性樣品還需要通過試管凝集試驗（SAT）或補體結(jié)合試驗（CFT）進行最終的判定。SAT是中國法定布魯氏菌病診斷的正式試驗，可作為布魯氏菌病的早期診斷，同時，用于人畜布魯氏菌菌苗免疫后血清抗體的檢測，但不適合綿羊種布魯氏菌病的診斷。具有結(jié)果判斷容易的優(yōu)點，但操作繁雜、費時，不適于現(xiàn)場應(yīng)用。因為特異性和敏感性都比較差，在發(fā)達國家基本上已經(jīng)停止使用了。

2.2 補體結(jié)合試驗（CFT）

補體結(jié)合試驗是目前血清學(xué)試驗中最為準確的試驗技術(shù)之一，被世界動物衛(wèi)生組織認證為布魯氏菌病診斷的確診性試驗。由于豬的補體會干擾豚鼠補體的作用，導(dǎo)致試驗的敏感性降低38%～40%，因而CFT不適合豬種布魯氏菌病的檢測。CFT參與的成分多，需要設(shè)立各種各樣的對照組，試驗步驟多，結(jié)論也具有主觀性，對操作者的要求比較高，不適宜在基層推廣以及進行現(xiàn)場檢測。CFT在進行結(jié)果判定時，主要是采用目視比色法來比較有色溶液顏色的深淺來測定溶血程度，所以，試驗結(jié)果很容易受主觀因素的影響而導(dǎo)致一定的誤差。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA 是免疫技術(shù)中應(yīng)用最廣的一種，在適合的載體上，酶標記抗體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體形成酶標記的抗原-抗體免疫復(fù)合物，在一定的底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物，使其水解、氧化或還原成另外一種帶色物質(zhì)。由于在一定條件下，酶的降解底物和呈現(xiàn)色澤是成正比的，因此，可以應(yīng)用酶測定儀進行測定，從而計算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的種類和含量。ELISA方法具有敏感、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、安全及污染少、易于自動化操作等特點。既可以作為確定檢測，又可以作為篩選和鑒別用，但由于試驗條件要求高，操作較煩瑣，不宜用作快速診斷，也不宜向基層推廣以及進行現(xiàn)場檢測。

2.4 膠體金免疫層析檢測技術(shù)（GICA）

Kim等[13]用犬種布魯氏菌的抽提物作為檢測抗原建立了檢測犬血清布魯氏菌病抗體的GICA。分別用血液培養(yǎng)、2-巰基乙醇快速篩選凝集試驗（2-MERSAT）和GICA對發(fā)生布魯氏菌病的10個不同圈舍的犬群進行檢測，陽性率分別為24.8%、39.5%和39.1%。結(jié)果表明，GICA與常規(guī)的凝集試驗和細菌學(xué)檢測具有同樣的敏感性和特異性。GICA診斷布魯氏菌病，不僅具有試劑敏感、特異，且血清用量少，操作簡便快速，適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場檢測。

3 分子生物學(xué)診斷方法

3.1 PCR法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)成為布魯氏菌病分子生物學(xué)檢測和病原分種、分型的重要手段，也是當今研究的熱點。鐘旗等以布魯氏菌病致病力因子－四型分泌系統(tǒng)中的VirB8基因為模板，設(shè)計引物，建立VirB8-PCR方法。通過特異性和敏感性試驗，結(jié)果表明本檢測方法的特異性為100%，Hinic等建立的既可常規(guī)操作又可resl-time PCR的PCR新方法特異性強，可鑒別6個種的布魯氏菌。

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法

Ohtsuki等根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌BCSP31株的基因序列設(shè)計兩組用于6個種布魯氏菌鑒別的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）的特異性引物，通過對6個種22株布魯氏菌和18個種28株非布魯氏菌的檢測表明，對布魯氏菌的檢測具有特異性（5min，63℃）和敏感性（10fg基因組DNA）。

4 討論

除了上述檢測方法外，滴金免疫測定法（DIGFA）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）、免疫組化法（immunochemistry）、熒光探針分析法（fluorescence polarization assay FPA）等方法與技術(shù)也在布魯氏菌病檢測中發(fā)揮重要作用，各種方法各有優(yōu)缺點?？焖?、精確的診斷布魯氏菌病是有效防控本病的基礎(chǔ)和必要條件，各國布魯氏菌病診斷技術(shù)的不斷研究、發(fā)展為快速、精確的診斷本病提供了必要的技術(shù)支持。由于犬飼養(yǎng)數(shù)量的增多以及與人類的密切接觸，使得犬布魯氏病將成為未來人類感染布魯氏菌病的傳播方式之一。我國對犬布魯氏菌病的分布、流行情況還不是十分了解，疫苗研究幾乎為零，這樣既不利于犬的繁殖和飼養(yǎng)，也影響了人類和家畜布魯氏菌病的防控。因此，加大投入力度，廣泛開展犬布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查，研究簡便快速、高通量的監(jiān)測技術(shù)，研制適合犬應(yīng)用的疫苗，對于犬、家畜和人類布魯氏菌病的防控均具有重要的意義。