宋振輝，封海波，張鸚俊

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.西南大學(xué)榮昌校區(qū)圖書(shū)館，重慶 榮昌 402460）

桿狀病毒（Baculovirus）是一類(lèi)在自然界中專(zhuān)一性感染節(jié)肢動(dòng)物的DNA病毒，在分類(lèi)學(xué)上屬于桿狀病毒科（Baculoviridae），其宿主主要包括鱗翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）和雙翅目（Diptera）昆蟲(chóng)?；跅U狀病毒全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將桿狀病毒科劃分為4 個(gè)屬：Alpha 桿狀病毒屬（以鱗翅目昆蟲(chóng)為特異宿主的NPV），Beta桿狀病毒屬（以鱗翅目昆蟲(chóng)為特異宿主的GV），Gamma桿狀病毒屬（以膜翅目為特異宿主的NPV）以及Delta桿狀病毒屬（以雙翅目為特異宿主的NPV）[1-2]。目前，廣泛用于攜帶外源基因表達(dá)的桿狀病毒僅限于核型多角體病毒（NPV）。該病毒在它的生活史上會(huì)形成兩種形式：包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）和出芽病毒粒子（budded virus，BV）。病毒感染宿主細(xì)胞早期，主要產(chǎn)生病毒粒子BV，到了感染晚期，則BV減少，逐漸過(guò)渡到只產(chǎn)生ODV。因?yàn)檫@兩種病毒粒子具有相同的核衣殼，不同的囊膜組成分，致使它們侵入宿主細(xì)胞的方式有所差異[3]，在自然界中，ODV介導(dǎo)口服感染，BV介導(dǎo)系統(tǒng)感染，BV可以轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但不能繁殖。近年來(lái)，許多研究人員致力于桿狀病毒侵入宿主細(xì)胞的研究，對(duì)介導(dǎo)ODV口服感染的囊膜蛋白有了新的發(fā)現(xiàn)，對(duì)BV進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制，特別是可轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的種類(lèi)進(jìn)行了積極探索，本文就桿狀病毒ODV和BV囊膜蛋白介導(dǎo)病毒侵染宿主細(xì)胞中的作用最新進(jìn)展作一簡(jiǎn)要論述，希望為研究桿狀病毒侵入細(xì)胞機(jī)理及其作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因傳遞載體提供參考。

1 桿狀病毒ODV膜蛋白在侵染宿主細(xì)胞中的作用

ODV病毒粒子包括10 余種囊膜蛋白，其中6 種囊膜蛋白被鑒定為病毒口服感染昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的必需蛋白，分別為P74（PIF0、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4）和PIF5，在ODV感染過(guò)程中，除了PIF5 蛋白不作為PIF復(fù)合體的組份，其余囊膜蛋白之間通過(guò)非共價(jià)健相互作用以PIF 復(fù)合體的形式發(fā)揮功能[4]，3 種蛋白PIF1、PIF2 和P74 被證明在病毒粘附宿主細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用，缺失3 種蛋白的任何一個(gè)將喪失病毒口服感染的能力。研究表明，PIF1、PIF2和PIF3形成穩(wěn)定的復(fù)合體存在于AcMNPVODV病毒粒子的表面，此復(fù)合體能夠抵抗2%SDS和5%β巰基乙醇在50 ℃條件下作用5 min，免疫共沉淀分析表明，PIF復(fù)合體具有一個(gè)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，當(dāng)PIF4 基因缺失時(shí)，PIF1、PIF2 和PIF3 始終能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合體。但是，缺失PIF1、PIF2 或PIF3 將導(dǎo)致復(fù)合體的破裂，因此，穩(wěn)定的PIF 復(fù)合體能夠進(jìn)一步的分成兩種組成單位，即PIF1、PIF2 和PIF3 形成的穩(wěn)定核心，然后PIF4 緊密地與這個(gè)穩(wěn)定的核心結(jié)構(gòu)結(jié)合。研究表明，由PIF1、PIF2、PIF3、PIF4 形成的復(fù)合體在桿狀病毒口服感染的起始階段具有重要作用[5]。P95 和P74（PIF0）也與PIF1-4 復(fù)合體松弛地結(jié)合，P95 被核心基因編碼，除了在自身啟動(dòng)子和宿主肌動(dòng)蛋白基因的驅(qū)動(dòng)下能夠表達(dá)外源基因，P95 還具有殼多糖結(jié)合能力[6]，可能調(diào)節(jié)ODV與圍食膜或中腸上皮細(xì)胞的相互作用。P95可能是病毒體外感染的必需基因，因?yàn)槿笔95 的桿狀病毒DNA不能產(chǎn)生感染性病毒粒子[7]，在多個(gè)包埋型核多角體病毒（MNPV）中，P95 被發(fā)現(xiàn)是BV和ODV的一種成分，但最近通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析在苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Ac-MNPV）BV結(jié)構(gòu)蛋白中沒(méi)有P95 的存在。在ODV感染過(guò)程中，Ac5、Ac68 和Ac108 被鑒定為病毒粒子口服感染的必需膜蛋白，通過(guò)基因插入缺失和變異的方法，證明此3 種膜蛋白可參與PIF 復(fù)合體的組成，但卻為病毒復(fù)制的非必需蛋白[8-9]，關(guān)于Ac5、Ac68和Ac108 與PIF 復(fù)合體的相互作用方式及其在病毒感染過(guò)程的具體作用有待進(jìn)一步闡明。

2 桿狀病毒BV膜蛋白在侵染宿主細(xì)胞中的作用

桿狀病毒BV是通過(guò)膜蛋白gp64 或F 蛋白與宿主細(xì)胞的未知受體相互作用，以內(nèi)吞體的形式進(jìn)入宿主細(xì)胞。在內(nèi)吞體（endosome）低pH 值誘導(dǎo)下（pH＜5.5），使細(xì)胞膜構(gòu)象發(fā)生改變引發(fā)BV包膜與內(nèi)吞體膜的融合，從而釋放核衣殼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。研究表明，gp64 的糖基化修飾和三聚體蛋白的形成對(duì)于病毒的吸附和膜融合至關(guān)重要[10]。缺失糖基化位點(diǎn)的桿狀病毒對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞的吸附能力顯著降低，破壞gp64 三聚體蛋白亞基間的二硫鍵也將抑制gp64 的融合活性。分子進(jìn)化分析表明，核多角體病毒Ⅰ型如AcMNPV和OPMNPV膜融合蛋白為gp64，核多角體病毒Ⅱ型缺乏gp64的同源基因，具有膜融合F 蛋白，F(xiàn) 與gp64 蛋白在氨基酸序列上沒(méi)有同源性，但與gp64 功能相似，也具有低pH 值誘導(dǎo)的膜融合活性。桿狀病毒通過(guò)識(shí)別宿主細(xì)胞受體，以內(nèi)吞作用進(jìn)入胞內(nèi)，這種方式不只限于昆蟲(chóng)細(xì)胞，AcMNPV同樣能通過(guò)相同方式進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

桿狀病毒BV進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可在合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子控制下表達(dá)外源基因。近年來(lái)，利用桿狀病毒將抗原遞呈給哺乳動(dòng)物細(xì)胞已受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。不同動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，重組桿狀病毒的侵染效率存在差異，已知桿狀病毒可進(jìn)入的宿主細(xì)胞系包括人源Huh7、HepG2 細(xì)胞、豬源腎細(xì)胞系CPK、FS-L3 細(xì)胞、鼠源原代腎細(xì)胞、CHO、BHK細(xì)胞、牛源MDB、BT 細(xì)胞及不同哺乳動(dòng)物骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）等[11-12]。目前關(guān)于桿狀病毒BV進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)理尚不清楚，現(xiàn)在普遍認(rèn)為桿狀病毒可能通過(guò)某種受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，內(nèi)吞泡中的低pH 值條件可誘導(dǎo)病毒包膜蛋白gp64 的構(gòu)象發(fā)生變化，使膜融合區(qū)域暴露并與內(nèi)吞泡膜融合釋放出病毒核衣殼。

Duisit 等認(rèn)為病毒與細(xì)胞之間的靜電相互作用及細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素可能在此過(guò)程中起重要作用[13]。也有報(bào)道細(xì)胞表面的磷脂可能是桿狀病毒囊膜蛋白gp64 的重要識(shí)別、結(jié)合位點(diǎn)，他們認(rèn)為桿狀病毒的gp64 蛋白可能識(shí)別哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的某種特殊受體從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[14]。實(shí)驗(yàn)表明，桿狀病毒囊膜蛋白gp64 在吸附哺乳動(dòng)物細(xì)胞和內(nèi)體逃逸的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[15]。缺失gp64 基因的桿狀病毒無(wú)法進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而高效表達(dá)gp64 蛋白的桿狀病毒可顯著提高報(bào)告基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)效率，已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的磷脂充當(dāng)了gp64的“碼頭”，有利于病毒接觸細(xì)胞，除此之外，宿主細(xì)胞中是否有與gp64 特異性結(jié)合的蛋白參與病毒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程還不明確。

目前，利用桿狀病毒作為外源基因表達(dá)載體的研究報(bào)道日益增多，如在研究口服免疫疫苗方面，基于桿狀病毒作為載體表達(dá)病毒樣顆粒（VLPs），進(jìn)而評(píng)價(jià)其免疫效果，不妨是一種良好的研究思路。本課題組利用桿狀病毒為表達(dá)載體，在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了豬傳染性胃腸炎病毒樣顆粒[16]，目前正在評(píng)價(jià)病毒樣顆粒誘導(dǎo)機(jī)體黏膜免疫效果。總結(jié)國(guó)內(nèi)外與我們應(yīng)用桿狀病毒構(gòu)建病毒樣顆粒的研究，都客觀存在一定的不足，如VLPs 的表達(dá)量低、VLPs 的純化困難，易于被胃腸道降解等。桿狀病毒BV可以轉(zhuǎn)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞，利用這一特性，實(shí)現(xiàn)桿狀病毒經(jīng)黏膜途徑免疫機(jī)體，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體黏膜免疫應(yīng)答，將會(huì)避免以上的不足，值得進(jìn)一步探討。

3 研究展望

在桿狀病毒ODV口服感染過(guò)程中PIF 復(fù)合體蛋白質(zhì)之間的相互作用是必需的，以前的研究證明，PIF 復(fù)合體包括PIF1、PIF2、PIF3、和P74，最新研究揭示更多的PIF 組成成分，至于新發(fā)現(xiàn)膜蛋白與PIF 之間的相關(guān)作用關(guān)系及其在病毒感染意義，PIF 復(fù)合體的宿主受體，及其ODV進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程中復(fù)合體的構(gòu)象變化等還需進(jìn)一步深入研究。利用桿狀病毒BV可轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一特性，已有越來(lái)越多關(guān)于桿狀病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的應(yīng)用報(bào)道，如在動(dòng)物基因工程疫苗、基因治療、病毒樣顆粒的組裝等領(lǐng)域中應(yīng)用桿狀病毒的研究日益增多，但目前還有亟待解決的問(wèn)題，如桿狀病毒敏感的哺乳動(dòng)物細(xì)胞還有那些，以及桿狀病毒進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的機(jī)制等，相信這些問(wèn)題的闡明，將為揭示桿狀病毒侵入宿主細(xì)胞機(jī)理及其作為表達(dá)載體系統(tǒng)提供重要的理論依據(jù)。

[1]David P A，Cohen MM，Bryn G D，et al.Encyclopedia of Autog-rapha californica Nucleopolyhedrovirus Genes.Virology Sinica[J].2009，24（5）:359-414.

[2]Liang Z，Zhang X X，Yin X M，et al.Genomic sequencing and analysis of Clostera anachoreta granulovirus[J].Arch Virol，2011，156（7）:1185-1198.

[3]Braunagel SC，Russell WK，Rosas AG，et al.Determination of the protein composition of the occlusion-derived virus of Autographa californica nucleopolyhedrovirus[J].Proc Natl Acad Sci U SA，2003，100:9797-9802.

[4]Ke P，Jan W，Van L，et al.Characterization of Novel components fo the baculovirus per os infectivity factor complex[J].JVirology，2012，86（9）:4981-4988.

[5]Yong JW，Olaf R P，Bininda E，et al.The genome of oryctes rhinoceros nudivirus provides novel insight into the evolution of nuclear arthropod specific large circular double-stranded DNAviruses[J].Virus Genes，2011，42（3）:444-456.

[6]Mei Y，Eric BC.Identification of a domain of the baculovirus autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus single-strand DNA-Binding protein LEF essential for viral DNAreplication[J].JVirology，2010，84（12）:6153-6162.

[7]Zhang VY，Chuan X Z.Advances on BmNPVFuctional Genomics[J].Biotechnology Biomaterials，2012，5:1-6.

[8]Nie Y C，F(xiàn)ang MG，Martin AE，et al.Analysis of the autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus overlapping gene pair lef3 and ac68 reveals that ac68 is a per os infectivity factor and that LEF3 is critical，but not essential，for virus replication[J].JVirology，2012，86（7）:3985-3994.

[9]Chang R L，Liu L，Wei CM，et al.Molecular cloning and cellular localization of Opdi108 from Ophiusa disjungens nucleopolyhedrovirus[J].Acta Entomologica Sinica，2012，55（4）:403-411.

[10]Oomens AG，Monsma SA，Blissard G W.The baculovirus GP64 envelope fusion protein:synthesis，olilomerization,and processing[J].Virology，1995，209（2）:592-603.

[11]Chiakako K，Yuuki K，Shuhei T，et al.Baculovirus Gp64-Mediated entry into mammalian cells[J].Virology，2012，86（5）:2610-2620.

[12]Hong Z C，Carlo P W，Yu CC.Membrane penetrating peptides greatly enhance baculovirus transduction efficiency into mammalian cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，405（2）:297-302.

[13]Duisit G，Saleum S，Douthe S，et al.Baculovirus vector requires electrostatic interactions including heparin sulfate for efficient gene transfer in mammalian cells[J].JGene Med，1999，1（2）:93-102.

[14]Tani H，Nishijima M，Ushijima H，et al.Characterization of Cell-Surface Determinants Important for Baculovirus infection[J].Virology，2001，279（1）:343-353.

[15]Chun X W，Shu W.APH-sensitive heparin-binding sequence from gp64 protein of baculovirus is important for binding to mammalian cells but not to sf9 insect cells[J].Journal of Virology，2012，8（1）:484-491.

[16]冷勇，宋振輝，卿家超，等.豬傳染性胃腸炎病毒M、sM基因重組桿狀病毒的構(gòu)建及病毒樣顆粒的組裝[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（9）：1432-1437.