李作美，李 娜，王曉云，于澤權(quán)

（蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

桶裝純凈水的微生物檢測(cè)與鑒定

李作美，李 娜，王曉云，于澤權(quán)

（蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

選用成品桶裝純凈水為研究對(duì)象，成品分別在下線6 h、12 h、24 h、48 h、96 h后進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)，并對(duì)其微生物類(lèi)別進(jìn)行鑒定，目的是對(duì)桶裝純凈水中的微生物有針對(duì)性地進(jìn)行預(yù)防和控制。結(jié)果表明，成品下線6 h后，檢測(cè)樣品時(shí)幾乎沒(méi)有微生物的存在，然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落總數(shù)明顯的增多。分別對(duì)不同的菌落進(jìn)行分離、純化并進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示有細(xì)菌（主要是大腸桿菌）和真菌。

桶裝純凈水；微生物；菌落總數(shù)；大腸桿菌

快節(jié)奏的現(xiàn)代生活使得桶裝純凈水走進(jìn)千家萬(wàn)戶，其已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N方便快捷的飲用水資源。但由于質(zhì)量參差不齊，純凈水是否真的“純凈”，存在著質(zhì)疑[1]。

目前我國(guó)的桶裝純凈水市場(chǎng)抽檢合格率低，主要表現(xiàn)在純凈水中微生物數(shù)量超標(biāo)，這在一定程度上給消費(fèi)者的健康帶來(lái)危害[2]。由于桶裝純凈水在生產(chǎn)、運(yùn)輸和飲用過(guò)程中稍有不慎就容易引起污染，其衛(wèi)生安全值得人們?nèi)リP(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水為研究對(duì)象，對(duì)水樣中的微生物進(jìn)行檢測(cè)和分離鑒定，旨在為今后桶裝純凈水的生產(chǎn)、運(yùn)輸及飲用中制定更加安全的防控措施。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水。

蛋白胨和酵母浸膏（生化純），氯化鈉、葡萄糖、乳糖、磷酸二氫鉀、瓊脂、乙醇、碘、草酸銨、碘化鉀等（分析純）：南京博岸生物科技有限公司；溴甲酚紫、伊紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)、沙黃等：南京匯鑫化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)菌培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、葡萄糖蛋白胨瓊脂水培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭（eosinmethylene blue，EMB）培養(yǎng)基[3-7]。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9012恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YM-50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；B203LED光學(xué)顯微鏡：重慶奧特關(guān)學(xué)儀器有限公司；CX-204凈化工作臺(tái)：久禾凈化技術(shù)有限公司；FA1604電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水樣的稀釋[8]

在裝有225 mL蒸餾水的滅菌三角瓶?jī)?nèi)注入25 mL樣品，混合均勻，得到10-1的樣品溶液。在裝有9 mL蒸餾水的滅菌試管中加入1 mL稀釋10倍的樣品溶液，混合均勻，得到10-2的樣品溶液，同樣方法制成10-3的樣品溶液。

分別吸取10-1、10-2、10-3樣品1 mL于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋梯度做2個(gè)平皿。吸取1mL無(wú)菌水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定[9-10]

在適合計(jì)數(shù)范圍內(nèi)若唯有一個(gè)稀釋度平板菌落數(shù)，則計(jì)算兩平板菌落數(shù)平均值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，獲得每毫升樣本中菌落總數(shù)；在適合計(jì)數(shù)范圍內(nèi)有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)，其計(jì)算公式：

式中：N為樣品中菌落數(shù)，CFU/mL；∑C為平板菌落數(shù)之和；n1為第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2為第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

若是每一個(gè)稀釋度平板菌落數(shù)都超過(guò)300CFU，就計(jì)數(shù)稀釋度最高的平板，其余平板記“多不可計(jì)”，以平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)作結(jié)果。若是每一個(gè)稀釋度平板菌落數(shù)都低于30，就計(jì)算稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)獲得結(jié)果。若是每一個(gè)稀釋度（包含樣本原液）平板都沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，就以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)記錄。若是每一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300范圍內(nèi)，就計(jì)算最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。

1.3.3 大腸菌群的測(cè)定

乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)[11]：在乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)接種待測(cè)樣品，每一個(gè)稀釋度接種三管，37℃培育24h，若乳糖膽鹽發(fā)酵管均沒(méi)有產(chǎn)氣現(xiàn)象就記錄大腸菌群陰性；若產(chǎn)氣，即試管中倒置的德漢氏小管中有氣泡產(chǎn)生，則繼續(xù)試驗(yàn)。

伊紅美藍(lán)瓊脂平板分離[11]：在EMB培養(yǎng)基平板上分別接種產(chǎn)氣產(chǎn)酸的培養(yǎng)物，37℃培養(yǎng)18～24h。篩選吻合如下特點(diǎn)：深紫黑色有金屬光澤、紫黑色不帶或略帶金屬光澤、淡紫紅色中央顏色較深的菌落，涂片。

革蘭氏染色[12]：制片，用結(jié)晶紫染色液染色1min后用蒸餾水清洗。涂片烘干用革蘭氏碘液作用1min用蒸餾水清洗。涂片烘干用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇脫色約30s，蒸餾水洗。涂片烘干用復(fù)染色液染色1min水洗烘干。顯微鏡觀測(cè)，染色結(jié)果呈紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，呈紅色的是革蘭氏陰性菌。

復(fù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[11]：樣本為革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，則挑取該菌落的另外一部分，接種到乳糖發(fā)酵管，每管能夠接種來(lái)自同一初發(fā)酵管同類(lèi)型菌落1～3個(gè)，37℃培養(yǎng)24h。乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽孢桿菌，可記錄為大腸菌群陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定[13]

2.1.1 成品下線6h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線6h后，對(duì)純凈水進(jìn)行取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每一個(gè)濃度稀釋梯度做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，即表1中用序號(hào)1和2所表示。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基制成平板，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，培養(yǎng)基內(nèi)無(wú)菌落生長(zhǎng)，各梯度平均菌落數(shù)為0，平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL。

2.1.2 成品下線12h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線12h后，對(duì)純凈水進(jìn)行取樣稀釋并培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，培養(yǎng)基中存在較少菌落，10-1樣品的平均菌落數(shù)為40～50CFU/mL，其他稀釋度平均菌落數(shù)為0，樣品中平均菌落總數(shù)為45CFU/mL。

2.1.3 成品下線24h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線24h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個(gè)濃度做2個(gè)平行試驗(yàn)，采用細(xì)菌培養(yǎng)基制成平板，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，培養(yǎng)基中菌落數(shù)量明顯增加，10-1樣品平均菌落數(shù)33CFU/mL，10-2樣本平均菌落數(shù)13CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)6CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)335CFU/mL。

2.1.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線48 h后，從同一批次的純凈水中取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個(gè)濃度做2個(gè)平行試驗(yàn)，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基上菌落較多，10-1樣本平均菌落數(shù)222 CFU/mL，10-2樣本平均菌落數(shù)89 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)24 CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)225 CFU/mL。

2.1.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線96 h后，取樣稀釋并培養(yǎng)，在37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，培養(yǎng)基長(zhǎng)滿了菌落，10-1樣本菌落數(shù)多不可計(jì)，10-2樣本平均菌落數(shù)220 CFU/mL，10-3樣本平均菌落數(shù)33 CFU/mL，樣品平均菌落總數(shù)2.5×104CFU/mL。

2.2 真菌菌落總數(shù)的測(cè)定

2.2.1 成品下線6 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線6 h后，對(duì)純凈水進(jìn)行取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個(gè)濃度做2個(gè)平行試驗(yàn)，分別配制酵母菌培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)酵母和霉菌，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿內(nèi)無(wú)酵母菌及霉菌的生長(zhǎng)，樣品霉菌平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)＜1×10-3CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.2.2 成品下線12 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線12 h后，對(duì)純凈水進(jìn)行取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個(gè)濃度做2個(gè)平行試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿中有少量霉菌及酵母存在，10-1樣本霉菌平均數(shù)為3 CFU/mL，酵母菌平均數(shù)為5 CFU/mL，其他稀釋度無(wú)菌落生長(zhǎng)。樣品霉菌平均菌落總數(shù)30 CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)45 CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.2.3 成品下線24 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線24 h后，對(duì)純凈水進(jìn)行取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，從表8可以看出，霉菌及酵母菌數(shù)量明顯增加，10-1樣本霉菌平均菌落數(shù)56 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)27 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數(shù)11 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)6 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數(shù)5 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)3 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數(shù)560 CFU/mL，酵母平均菌落總數(shù)270 CFU/mL。

2.2.4 成品下線48 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線48 h后取樣培養(yǎng)，霉菌及酵母菌數(shù)量增加較多，10-1樣本霉菌平均菌落數(shù)107 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)135 CFU/mL。10-2樣本霉菌菌落數(shù)59 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)39 CFU/mL。10-3樣本霉菌菌落數(shù)27 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)15 CFU/mL。樣本霉菌平均菌落總數(shù)1×103CFU/mL，酵母菌平均菌落總數(shù)1.3×102CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)表9。

2.2.5 成品下線96 h后桶裝純凈水取樣培養(yǎng)

成品下線96 h后，取樣并稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為10-1、10-2、10-3，每個(gè)濃度做2個(gè)平行試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。10-1樣本霉菌、酵母菌平均菌落數(shù)多不可計(jì)，10-2樣本霉菌平均菌落數(shù)163 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)166 CFU/mL，10-3樣本霉菌平均菌落數(shù)46 CFU/mL，酵母菌平均菌落數(shù)79 CFU/mL。樣品霉菌平均菌落總數(shù)4.4×104CFU/mL，酵母菌平均菌落總數(shù)7.9×104CFU/mL，結(jié)果見(jiàn)表10。

2.3 大腸菌群測(cè)定

2.3.1 乳糖膽鹽發(fā)酵試驗(yàn)

成品下線96 h后取樣，置乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24 h，觀察乳糖膽鹽發(fā)酵10-1-1、10-1-2、10-1-3、10-2-2、10-2-3和10-3-2號(hào)試管中產(chǎn)氣，其余的不產(chǎn)氣的記為大腸菌群陰性菌。結(jié)果見(jiàn)表11。

2.3.2 伊紅美藍(lán)瓊脂平板試驗(yàn)

在乳糖膽鹽發(fā)酵管中，選取德漢氏小管產(chǎn)氣的試管，進(jìn)行取樣稀釋，然后接種到EMB培養(yǎng)基中，涂布均勻，37℃培養(yǎng)24 h。觀察到培養(yǎng)基的表面長(zhǎng)滿了帶有金屬光澤的紫色菌落。

2.3.3 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

由于乳糖發(fā)酵試驗(yàn)不是純菌發(fā)酵而是樣品發(fā)酵，所以初發(fā)酵陽(yáng)性并不能代表大腸菌群為陽(yáng)性，要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。挑選合適的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)取相同部位的菌落置于乳糖發(fā)酵管37℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果見(jiàn)表12。

由表12可知，10-1-2、10-2-2和10-2-3號(hào)試管中存在大腸菌群。對(duì)照MPN檢索表可得，樣品中大腸菌群1 100 CFU/100 mL。95%可信限下限300 CFU/100 mL，上限3 600 CFU/100 mL。

3 結(jié)論

根據(jù)GB4789—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》和GB17324—2003《瓶（桶）裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，采用菌落計(jì)數(shù)及多管發(fā)酵等。對(duì)某公司生產(chǎn)的桶裝純凈水進(jìn)行微生物檢測(cè)鑒定[14-16]。樣品采集選擇的時(shí)間分別為成品下線后6 h、12 h、24 h、48 h和96 h。在純凈水生產(chǎn)工藝中有臭氧殺菌的工序，殘留的臭氧有殺菌的功效，加上生產(chǎn)環(huán)節(jié)符合衛(wèi)生要求，因此成品下線6 h檢測(cè)樣品時(shí)幾乎沒(méi)有微生物的存在。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桶裝純凈水隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物的菌落總數(shù)也隨之增多，成品下線12 h后，細(xì)菌、霉菌、酵母菌菌落總數(shù)及大腸菌群均超過(guò)國(guó)標(biāo)要求。分析造成這種現(xiàn)象的原因，有可能是3種情況：一是桶裝純凈水在生產(chǎn)過(guò)程中殺菌不徹底；二是在運(yùn)輸銷(xiāo)售過(guò)程中的擠壓、碰撞造成桶蓋松動(dòng)；三是開(kāi)啟飲用的過(guò)程中受到有菌的飲水機(jī)的影響。針對(duì)這幾種微生物污染的原因，首先應(yīng)從生產(chǎn)環(huán)節(jié)加以控制，嚴(yán)格要求從業(yè)人員進(jìn)行無(wú)菌操作，制定良好的操作規(guī)范，確定關(guān)鍵控制點(diǎn)。對(duì)制水車(chē)間和灌裝車(chē)間進(jìn)行紫外線殺菌，對(duì)生產(chǎn)管道和貯水容器、空桶及桶蓋進(jìn)行臭氧消毒。其次在運(yùn)輸銷(xiāo)售過(guò)程中，要檢查桶蓋的密封性是否完好，嚴(yán)防過(guò)分的擠壓、劇烈的碰撞導(dǎo)致桶蓋松動(dòng)。最后在開(kāi)啟飲用前，要對(duì)飲水機(jī)進(jìn)行清洗消毒，防止雜菌污染?？傊?，解決好桶裝純凈水在生產(chǎn)、運(yùn)輸和飲用過(guò)程中的微生物污染問(wèn)題，是提高桶裝純凈水質(zhì)量的有效途徑。

[1]彭 輝，王燕玲.純凈水微生物問(wèn)題探析[J].中國(guó)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督，2008 （3）：64-65.

[2]吳平芳，賀連華，劉 濤，等.抽檢與送檢桶裝純凈水微生物污染的調(diào)查研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（8）：861-863.

[3]王冬月，沈明珠，吳 葉，等.學(xué)校桶裝純凈水及飲水機(jī)衛(wèi)生狀況的調(diào)查[J].環(huán)境與健康，2007，23（21）：1970-1971.

[4]蒲 彪，胡小松.飲料工藝學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009.

[5]黃坤輝，楊維占，蘇蘭妹.桶裝純凈水在生產(chǎn)過(guò)程中微生物污染及控制措施的研究[J].疾病監(jiān)測(cè)與控制，2011，5（1）：1-3.

[6]齊克久.市售純凈水微生物污染情況分析[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)，2006 （1）：24.

[7]高永慧，張冬青.純凈水質(zhì)量現(xiàn)狀和對(duì)純凈水國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的建議[J].安徽電子信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，9（4）：78-80.

[8]李 勤，李 丁，何玉馨，等.桶裝純凈水微生物污染結(jié)果分析[J].職業(yè)與健康，2003，19（9）：67-67.

[9]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[10]汪 莉.桶裝純凈水微生物污染狀況調(diào)查分析[J].實(shí)用預(yù)防學(xué)，2004，11（1）：133-134.

[11]王利艷.飲用純凈水微生物檢驗(yàn)中菌落總數(shù)的不確定度評(píng)定[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2013，5（3）：1554-1554.

[12]黃久紅，胡金妹，張 翔.桶裝飲用純凈水衛(wèi)生質(zhì)量現(xiàn)狀[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2005，6（2）：159-159.

[13]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 4789—2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[14]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB 17324—2003瓶（桶）裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[15]葉 明.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2009.

[16]張 嵐，接偉光.食品微生物學(xué)[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2014.

Detection and identification of microorganisms in bottled purified water

LIZuomei,LINa,WANGXiaoyun,YUZequan

(Departmentof Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The totalbacterialcountwas detected and microorganism categories were identified in bottled purified water afteronline production for6 h, 12 h,24 h,48 h,96 h.The main detection purpose was to prevent and control microorganism in pure water process.Test results showed that total bacterial count of samples after online production for 6 h almost had no microorganisms,however,with the extension of time,the totalnumber of colonies increased obviously.Afterseparation,purification and identification ofdifferentcolonies,the results showed thatbacteria(mainly Escherichia coli)and fungiwere founded.

bottled purified water;microorganism;totalbacterialcount;Escherichia coli

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.036

2014-09-02

蚌埠學(xué)院工程研究中心項(xiàng)目（BBXYGC2013C05）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201411305016）

李作美（1975-），講師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。