三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法驗(yàn)證

施　敏,管　敏,周琴妹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京　 210029)

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三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法驗(yàn)證

施敏,管敏,周琴妹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

摘要:目的 建立皮炎洗劑、黃芩油膏及燙傷藥水這三種具有抑菌成分的外用制劑的微生物限度檢查方法。方法 按照2010年版《中國藥典》的規(guī)定測定三種制劑對5種規(guī)定試驗(yàn)菌株的回收率，并對其控制菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果皮炎洗劑采用薄膜過濾法，黃芩油膏采用培養(yǎng)基稀釋法，燙傷藥水采用預(yù)濾過和培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用，5種菌回收率均可達(dá)到70%以上，控制菌檢查采用常規(guī)方法和培養(yǎng)基稀釋法。結(jié)論該文建立了皮炎洗劑、黃芩油膏及燙傷藥水這三種不同劑型的、具有抑菌成分的微生物限度檢查方法。

關(guān)鍵詞：薄膜過濾法；培養(yǎng)基稀釋法；外用制劑；微生物限度

皮炎洗劑、黃芩油膏和燙傷藥水均為我院醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，在臨床被廣泛應(yīng)用。該三種制劑為不同劑型的外用制劑，都含有抑菌成分，本文按照2010年版《中國藥典》一部[1]的要求，采用合適的方法，如培養(yǎng)基稀釋法，薄膜過濾法，預(yù)濾過法或幾種方法聯(lián)用，消除制劑的抑菌作用后再進(jìn)行檢驗(yàn)，以期建立更具科學(xué)性和合理性的微生物限度檢查方法，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1試驗(yàn)材料

供試品：皮炎洗劑、黃芩油膏、燙傷藥水均由我院制劑部生產(chǎn)，其處方組成、批號等信息詳見表1。

表1　三種制劑處方組成及批號信息表

試驗(yàn)菌株：大腸埃希菌[CMCC(B) 44 102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63 501]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]、銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10 104]、白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉[CMCC(F) 98 003]，以上由江蘇省藥檢所提供, 傳代次數(shù)均為第4代。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：131224)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：070313)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號：050407)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號：1110203)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：1401132)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號：1401072)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號：150513)，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：100129),以上培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

稀釋液：pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液(批號：1306192，北京三藥科技開發(fā)公司)、0.9%無菌氯化鈉溶液(本實(shí)驗(yàn)室配制)。

儀器：DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海申賢儀器設(shè)備廠)，MJ-100B霉菌培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，YX-280 D-TT手提式壓力蒸汽滅菌器(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)，100級潔凈工作臺(AIR TECH ,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

2試驗(yàn)方法

2.1供試液的制備皮炎洗劑：吸取本品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液。

黃芩油膏：取樣品5 g于無菌研缽中，加入溶化的(溫度不超過45℃)5 g司盤80，3 g單硬脂酸甘油酯，10 g聚山梨酯80，慢慢加入45℃的pH=7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液，邊加邊研磨，使供試品充分乳化，作為1∶20的供試液。

燙傷藥水：吸取本品10 mL，加入pH=7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液，采用脫脂棉對該供試液進(jìn)行預(yù)過濾[2]，去除沉淀，濾液備用。

2.2菌液制備[1]接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至相應(yīng)濃度制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.3細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗(yàn)證

2.3.1試驗(yàn)組常規(guī)方法：上述供試液1 mL及試驗(yàn)用菌的各種菌液1 mL，立即傾注15～20 mL溫度不超過45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于相應(yīng)溫度條件下倒置培養(yǎng)，計數(shù)。

培養(yǎng)基稀釋法：上述供試液 1 mL分別加至多個平皿中，加入試驗(yàn)用菌的各種菌液1 mL。

薄膜過濾法：取供試品溶液1 mL，用薄膜過濾，以pH=7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液為沖洗液，在最后一次沖洗液中加入菌懸液1 mL，濾干后取出濾膜，菌面朝上貼于已制備好的相應(yīng)瓊脂平板上，按菌落計數(shù)方法測定其菌落數(shù)，作為試驗(yàn)組。

2.3.2菌液組不加供試液，同試驗(yàn)組方法操作,分別測定各試驗(yàn)菌的菌數(shù)。

2.3.3供試品對照組不加菌液，同試驗(yàn)組方法操作,測定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.4回收率計算分別計算5種試驗(yàn)菌株的回收率。

2.4.1金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組：取相應(yīng)的供試液10 mL及1 mL金黃色葡萄球菌(含菌數(shù)為10～100 cfu)，加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

空白對照組：取相應(yīng)的供試液10 mL，加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

陰性組：1 mL大腸埃希菌(含菌數(shù)為10～100 cfu)，加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)48 h，再用甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

2.4.2銅綠假單胞菌 試驗(yàn)組：取相應(yīng)的供試液10 mL及1 mL銅綠假單胞菌液(含菌數(shù)為10～100 cfu)，加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，振搖均勻，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

空白對照組：取相應(yīng)的供試液10 mL，加入100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，振搖均勻，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

陰性組： 1 mL金黃色葡萄球菌(含菌數(shù)為10～100 cfu)，加入100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37℃培養(yǎng)24 h，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

3試驗(yàn)結(jié)果

3.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)

3.1.1培養(yǎng)基稀釋法3種制劑先采用常規(guī)方法驗(yàn)證，回收率達(dá)不到要求，故采用培養(yǎng)基稀釋法，5株試驗(yàn)菌的回收率見表2。由表2可知，黃芩油膏采用培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證(每皿0.5 mL)，5種菌的回收率均大于70%，其抑菌作用基本被消除，可采用培養(yǎng)基稀釋法檢查細(xì)菌、真菌及酵母菌計數(shù)。燙傷藥水的溶劑是80%的乙醇，配成1∶10的供試液之后，兒茶素、冰片等水不溶性成分析出，析出的沉淀一方面具有較強(qiáng)抑菌作用[3]，另一方面影響平皿中菌落的計數(shù)，故先采用脫脂棉對供試液進(jìn)行預(yù)過濾[2]，去除沉淀，濾液再采用培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證，回收率大于70%。

表2　培養(yǎng)基稀釋法回收率/%

3.1.2薄膜過濾法皮炎洗劑中含大黃、苦參、黃芩等藥材，抑菌活性較強(qiáng)[4-8]，采用培養(yǎng)基稀釋法大腸埃希菌等多株菌的回收率均低于70%，故采用薄膜過濾法，用100 mL pH=7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗，抑菌活性基本被消除，5株菌回收率達(dá)到70%以上，該法可作為皮炎洗劑的微生物限度檢查的方法。

3.2控制菌驗(yàn)證黃芩油膏和燙傷藥水采用常規(guī)法，皮炎洗劑采用培養(yǎng)基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗(yàn)組均可檢出，陰性對照和空白對照未檢出，滿足要求，結(jié)果見表3。

表3　控制菌驗(yàn)證結(jié)果

注：表中的培養(yǎng)基稀釋法使用的培養(yǎng)基為 200 mL。

4討論

皮炎洗劑由大黃、苦參、黃芩等藥材水煎煮濃縮而得，其中大黃素、苦參堿、黃芩苷均具有抗菌作用，皮炎洗劑的抑菌活性較強(qiáng)，采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法回收率達(dá)不到要求，采用薄膜過濾法，用100 mL pH=7.0氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗即可基本消除其抑菌作用，回收率大于70%。

黃芩油膏以凡士林為基質(zhì)，制備供試液時，振搖、攪拌都不能使基質(zhì)分散均勻，影響菌落計數(shù)，采用研磨法，邊加入表面活性劑邊研磨，至分散均勻。以羊毛脂、凡士林等為主要基質(zhì)的油膏類制劑應(yīng)優(yōu)先選擇常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法，而盡量避免使用薄膜過濾法，因?yàn)橛椭曰|(zhì)即使乳化后仍很難過膜，濾速緩慢，且很容易堵塞濾膜。

燙傷藥水為黃芩、兒茶、冰片等藥材的80%乙醇浸出液，抑菌活性較強(qiáng)，制成1∶10的供試液后，溶劑組成改變，兒茶、冰片等水不溶性成分析出，析出的沉淀一方面有較強(qiáng)抑菌作用，另一方面也影響平皿中菌落的計數(shù)。采用500 r·min-1低速離心5 min，仍有一部分沉淀浮于液面，故考慮用預(yù)過濾法進(jìn)行粗濾去除沉淀，苑思坤等[2]的研究表明，用濾紙過濾，過濾后菌液濃度大幅降低，降低樣品中微生物檢出的幾率，不適宜用作樣品前處理的過濾介質(zhì)；用紗布和脫脂棉為介質(zhì)，過濾前后菌液的濃度基本保持一致，但紗布對微小懸浮物的濾除作用較差，故本實(shí)驗(yàn)以脫脂棉為介質(zhì)進(jìn)行預(yù)過濾，而后濾液用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行檢查，5株菌的回收率均滿足要求。

皮炎洗劑、黃芩油膏和燙傷藥水分別為水提取制劑、醇浸出制劑和軟膏劑，基本涵蓋了中藥外用制劑的劑型，本試驗(yàn)選取這三種具有代表性的外用制劑進(jìn)行研究，其結(jié)果為今后具有抑菌活性的外用制劑的微生物限度檢查方法的建立提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[2]苑思坤,李玉芝,王紅云.微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預(yù)處理方法探討[J].中國藥業(yè),2010,19(18):42-43.

[3]周琴妹,吳旭彤.不同提取工藝的燙傷藥水抑菌試驗(yàn)[J].中成藥,1994,17(3):20.

[4]田代華.實(shí)用中藥詞典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:93,1695.

[5]余傳隆,黃泰康，丁志遵,等.中藥辭海(第一卷)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1993:326.

[6]宋立人,洪詢.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M].北京人民衛(wèi)生出版社,2001:118,1865.

[7]陳展,凌曉云.痔瘺洗液微生物限度檢查方法的建立[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(6)：1047-1050.

[8]施高翔,邵菁,汪天明,等.黃芩及其有效成分抗菌作用新進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2014,39(19):3713-3718.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.018

基金項(xiàng)目：江蘇省中醫(yī)院院級課題(No Y13043)

通信作者：周琴妹，女，主任中藥師，研究方向：藥品檢驗(yàn)及新藥研發(fā)，E-mail：zhoumeizi0917@163.com

(收稿日期：2015-06-12，修稿日期：2015-08-11)

Methodological validation of microbial limit test in three kinds of
external preparations with antibacterial ingredients

SHI Min, GUAN Min, ZHOU Qin-mei

(AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,Jiangsu210029,China)

Abstract：Objective To establish the methods of microbial limit test for three kinds of external preparations with antibacterial ingredients, such as PiYan lotion, HuangQin ointment and TangShang lotion. Methods According to Chinese Pharmacopoeia 2010, the recovery rates of these five stipulated microorganisms respectively treated by three preparations were detected. And the method of checking control bacteria were also validated. Results Membrane filtration method was proved to be applicable for PiYan lotion. Culture medium diluting method was proper for HuangQin ointment. And the methods combining medium diluting wih pre-filtration were adopted to TangShang lotion. The recovery rate of these five stipulated microorganisms reached 70% by appropriate methods. Routine method and culture medium diluting method were used for validation of the control bacteria test. Conclusion The methods of microbial limit test for these three different kinds of external preparations were established.

Key words:membrane filtration method;culture medium diluting method;external preparations;microbial limit test