光動(dòng)力學(xué)處理對(duì)宮頸癌細(xì)胞的miRNA的影響

蘭艷麗，劉　韻

(湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 襄陽　441021)

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光動(dòng)力學(xué)處理對(duì)宮頸癌細(xì)胞的miRNA的影響

蘭艷麗，劉韻

(湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 襄陽441021)

摘要：目的研究光動(dòng)力學(xué)(PDT)處理對(duì)宮頸癌細(xì)胞的miRNA的影響。方法 將HeLa細(xì)胞接種到黑色透明底的96孔微Optilux板(1×10 4細(xì)胞/孔)。24 h后，當(dāng)細(xì)胞附著在培養(yǎng)板上，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.4)中洗滌3次，進(jìn)行不同濃度的光敏劑PDT處理。評(píng)價(jià)PDT對(duì)HeLa細(xì)胞活力影響，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以評(píng)估其對(duì)PDT靈敏度。激光照射1 h后，所有HeLa細(xì)胞的總細(xì)胞RNA經(jīng)Quick Gene RNA細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒提取后，進(jìn)行DNA酶處理，使用大容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。實(shí)時(shí)PCR定量測定凋亡相關(guān)的miRNA(MIR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達(dá)水平。結(jié)果 PDT處理1 h后，與未做任何干預(yù)處理的對(duì)照組比較，HeLa細(xì)胞存活率顯著降低至78%。PDT處理24 h后，HeLa細(xì)胞全部死亡。此外，PDT處理1 h后，HeLa細(xì)胞內(nèi)聚半胱天冬酶活性，顯著增高。另外，PDT處理1 h后，miR-210和miR-296的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。然而，其他miRNA的表達(dá)水平包括miR-7，miR-148a，miR-204和miR-216與對(duì)照組無差異。結(jié)論 PDT處理宮頸癌細(xì)胞后，miRNA表達(dá)水平不同，miR-210和miR-296的表達(dá)水平最高，可以作為宮頸癌PDT療效的標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞：光動(dòng)力療法；小分子RNA；細(xì)胞凋亡；HeLa細(xì)胞；5氨基乙酰丙酸

宮頸癌是世界上第二大常見婦女腫瘤，在發(fā)展中國家尤為常見，我國宮頸癌的發(fā)生率高居女性惡性腫瘤的第一位，是引起婦女癌癥相關(guān)死亡的重要原因。近年來我國宮頸癌發(fā)病率總體偏高，宮頸癌低齡化的趨勢十分顯著，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健康。其中腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。宮頸癌早期可以發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移患者愈后不佳。目前宮頸癌常用的治療手段主要是手術(shù)、放療和化療等，這些方法創(chuàng)傷大，毒副反應(yīng)重，而且可能剝奪年輕患者的生育功能。因此積極開展宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于宮頸癌的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來發(fā)展起來光動(dòng)力療法是的一種新的腫瘤治療方法，該方法是通過光敏化反應(yīng)直接作用達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，是一種光化學(xué)技術(shù)，用于新血管形成相關(guān)的多種癌癥和疾病的治療。該方法的其最大優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞高度的篩選選擇性并具有組織特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞情況的同時(shí)對(duì)健康組織的傷害及損傷達(dá)到最小。研究較熱門的小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼進(jìn)行調(diào)控的單鏈RNA。目前幾年來，關(guān)于miRNA與子宮頸癌癥之前關(guān)系的研究已經(jīng)成為了腫瘤研究熱點(diǎn)。光動(dòng)力療法(PDT)miRNA是由基因編碼、轉(zhuǎn)錄成單個(gè)或群集的初級(jí)轉(zhuǎn)錄子，隨后產(chǎn)生成熟miRNA。人類癌癥細(xì)胞的變化與miRNA表達(dá)相關(guān)。據(jù)最新報(bào)道，miRNA的表達(dá)模式因腫瘤類型的不同而不同，并且miRNA表達(dá)譜反映了腫瘤的發(fā)育譜系和分化狀態(tài)[1]。大量的研究表明，該小分子物質(zhì)miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡表現(xiàn)出及腫瘤形成等方面具有廣泛而精確地調(diào)控蛋白質(zhì)分解以及合成的重要作用。miRNA的異常表達(dá)可表現(xiàn)出被認(rèn)為與宮頸癌癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切的相關(guān)性。光動(dòng)力學(xué)是宮頸癌癥的有效方法已經(jīng)被證實(shí)，因此，更好地理解PDT治療腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，將有助于設(shè)計(jì)新的干預(yù)措施和改善患者的長期生存情況。在這項(xiàng)研究中，重點(diǎn)研究PDT處理HeLa細(xì)胞后癌細(xì)胞內(nèi)miRNA的變化。本課題通過篩選以及篩查對(duì)宮頸癌癥光動(dòng)力學(xué)治療前及治療之后差異性表達(dá)的miRNA，旨在為差異miRNA對(duì)疾病的預(yù)測以及預(yù)后判斷，且為功能分析提供前提以及基礎(chǔ)。

1資料和方法

1.1資料光敏劑5-ALA(5氨基乙酰丙酸)購自美國Sigma公司。宮頸癌細(xì)胞系Hela由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院婦科腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供。連續(xù)波半導(dǎo)體激光發(fā)生器用于激發(fā)光敏劑(664±1)nm波長(JENOPTIK公司，德國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)物，光敏劑，PDTHeLa細(xì)胞接種到黑色透明底96孔的微Optilux板(BD生物科學(xué)公司，加利福尼亞州)(1×104細(xì)胞/孔)。24 h后，當(dāng)細(xì)胞附著在培養(yǎng)板上，除去培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH 7.4)中洗滌3次，進(jìn)行PDT處理。簡言之，光敏劑ALA：分子量167.6，使用前藥物用PBS配成25 mmol·L-1，5 mol·L-1NaOH 調(diào)pH值至7.0，濾過除菌，避光保存。細(xì)胞經(jīng)由連接于培養(yǎng)板底部的光纖進(jìn)行激光照射。激光照射后，將培養(yǎng)基替換為完全生長基。試劑：Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(美國Invitroge公司)，蛋白酶 K( 默克生物公司)，TaqMix(東盛生物公司)，PCR試劑盒、TaqMan miRNA試劑盒(美國Santa Cruz公司)，RNA提取試劑盒采用(美國Sigma)，DEPC(上海碧云天生物)，乙醇、異丙醇、氯仿(上海碩盟生物)。

儀器：高速冷凍離心機(jī)(德國BiofugeStratos)，-8～4℃冰箱(日本松下)， PCR儀(澳大利亞Rotor-gene)，紫外分光光度儀(Beckman Coulter 公司)。

1.3HeLa細(xì)胞的PDT療效評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)PDT對(duì)HeLa細(xì)胞活力的影響，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以評(píng)估其對(duì)PDT的靈敏度。細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片用70%酒精擦凈，將蓋玻片蓋于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上，常規(guī)消化細(xì)胞，吹打成均勻的細(xì)胞懸液，用吸管吸一滴細(xì)胞懸液，由蓋玻片邊緣加入，計(jì)數(shù)室的四角的四個(gè)大 方格的細(xì)胞數(shù)(又各劃分為16個(gè)中方格)。壓線的只計(jì)上線和左側(cè)，按下式計(jì)數(shù)：細(xì)胞數(shù)/mL= PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)， 采用FLICA聚半胱天冬檢測方法測量蛋白酶活性水平。

1.4RNA提取和實(shí)時(shí)PCR 激光照射1 h后，所有HeLa細(xì)胞的總細(xì)胞RNA經(jīng)Quick Gene RNA細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒提取。所有樣品進(jìn)行DNA酶處理，以避免DNA污染，接著使用大容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。采用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，采用TaqMan miRNA試劑盒檢測MicroRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用RNU6作為內(nèi)參進(jìn)行校正。對(duì)MicroRNA的表達(dá)水平采用二步法進(jìn)行檢測，第一步是通過莖環(huán)引物來合成互補(bǔ)DNA，再通過miRNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對(duì)10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)了反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，在PCR管加入10 μL的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總的RNA濃度調(diào)整到2 μg·L-1，最后加入5 μL的逆轉(zhuǎn)錄引物，在冰上混勻之后反應(yīng)5 min，接著進(jìn)行梯度變性反應(yīng)，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減，第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman miRNA的特異性引物(MicroRNA：上游5'-caca guaggc cuca aauguuuguuga uga-3'，下游5'-gugu cguccg gggu uuacagacaacu acu-3')，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，cDNA共5 μL加入到RNA的去酶的水當(dāng)中，將體積擴(kuò)增至20 μL，通過循環(huán)反應(yīng)94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、60 s，72℃、7 min遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán)之后，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，采用熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)，按照PCR操作說明，Ct的檢測值應(yīng)當(dāng)在20～32之外的需要進(jìn)行第二次檢測。應(yīng)用△Ct=Ct microRNA-CtRNU6的計(jì)算公式計(jì)算microRNA的相對(duì)表達(dá)量。測定凋亡相關(guān)的miRNA(miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1HeLa細(xì)胞的PDT療效PDT處理1 h后，與未做干預(yù)處理的相比對(duì)照組，HeLa細(xì)胞存活率顯著降低至78%。PDT處理24 h后，HeLa細(xì)胞全部死亡。此外，PDT處理1 h后，HeLa細(xì)胞內(nèi)聚半胱天冬酶活性，顯著增高。細(xì)胞存活率與PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果，見表1。這些結(jié)果表明，PDT處理宮頸癌后，癌細(xì)胞凋亡將立即啟動(dòng)。

表1 不同處理對(duì)HeLa細(xì)胞存活率及凋亡的影響

注：光敏劑濃度0mg·L-1為對(duì)照組。

2.2PDT處理后癌細(xì)胞的miRNA表達(dá)情況PDT處理1 h后，miR-210和miR-296的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，然而，其他miRNA的表達(dá)水平包括miR-7，miR-148a，miR-204和miR-216與對(duì)照組無差異。見圖1和圖2。

3討論

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤，是引起婦女癌癥死亡的主要原因。近年來我國宮頸癌發(fā)病率總體偏高，每年新發(fā)病例近13萬，接近于發(fā)達(dá)國家的6倍，宮頸癌低齡化的趨勢也十分顯著，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健康[2]。宮頸癌早期腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者術(shù)后治愈效果不佳，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。通過對(duì)宮頸癌光動(dòng)力學(xué)治療前后差異表達(dá)microRNA的研究，可以更好的發(fā)現(xiàn)其發(fā)生機(jī)制并為相關(guān)研究提供新思路，同時(shí)也可以為新的治療方法和提早預(yù)防提供新方向[3]。希望本研究中的研究思路和結(jié)論對(duì)今后更深入機(jī)制研究提供新的思路，同時(shí)也希望本研究為治療宮頸癌光動(dòng)力學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)。光動(dòng)力療法是近年來發(fā)展起來的一種較新腫瘤治療方法，是通過光敏化反應(yīng)達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，其最大優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)腫瘤細(xì)胞高度的選擇性和組織特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)健康組織的損傷達(dá)到最小[4-5]。目前，PDT已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療局部疾病和癌前病變，如子宮頸癌，膀胱癌，垂體瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，同時(shí)作為姑息治療早期肺癌和食道癌及基底細(xì)胞癌的一種治療手段[6]。

目前正在進(jìn)行的臨床研究目的是為了優(yōu)化PDT的條件。研究較熱門的小RNA(miRNA)是一類小分子非編碼進(jìn)行調(diào)控的單鏈RNA[7]。是一類能夠調(diào)節(jié)多種靶基因發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要分子，也是目前腫瘤分子機(jī)制的研究熱點(diǎn)內(nèi)容[8]。miRNA作為新型的非編碼的單鏈RNA，其長度僅為22個(gè)核苷酸序列，但是該分子廣泛存在于各類生物的真核細(xì)胞當(dāng)中，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，miRNA在腫瘤中的相關(guān)研究越來越深入，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與者各類腫瘤的生長、發(fā)育，與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，涉及到各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且miRNAs的表達(dá)譜還決定著腫瘤的基因反省，在腫瘤亞型、轉(zhuǎn)移等臨床病理因素中發(fā)揮著重要作用，尤其對(duì)于術(shù)后的生存期及預(yù)后具有一定的相關(guān)性，研究提示了miRNA可以用于對(duì)腫瘤預(yù)后的評(píng)估，其表達(dá)量與腫瘤的預(yù)后有著一定的相關(guān)性[9-10]。關(guān)于miRNA與子宮頸癌癥之前關(guān)系的研究已經(jīng)成為了腫瘤研究熱點(diǎn)[11]。大量的研究表明，該小分子物質(zhì)miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡表現(xiàn)出及腫瘤形成等方面具有廣泛而精確地調(diào)控蛋白質(zhì)分解以及合成的重要作者用[12]。本研究選用的microRNA表達(dá)譜芯片共篩選出170個(gè)與宮頸癌放化療敏感性相關(guān)的差異表達(dá)的microRNAs，治療抗拒組與敏感組相比表達(dá)顯著增高者144個(gè)，顯著降低者26個(gè)。選取兩組患者中統(tǒng)計(jì)學(xué)差異較為顯著，同時(shí)根據(jù)靶基因預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測分析，如預(yù)測發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體EGFR上有兩個(gè)miR-296的結(jié)合位點(diǎn)，并結(jié)合microRNA及其祀基因在其他腫瘤中的研究，如己有研究顯示miR-216作用于DNA-PKcs或ATM發(fā)揮作用，而DNA-PKcs和ATM是體內(nèi)DNA雙鏈斷裂修復(fù)的兩種主要方式[13]。因此選取miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296這6個(gè)microRNAs，作為區(qū)分敏感組和抗拒組的目標(biāo)microRNAs。經(jīng)進(jìn)一步的hierarchical聚類分析，從聚類圖上可以直觀的看出在敏感組和抗拒組中這6個(gè)microRNA表達(dá)差異明顯，能夠?qū)山M很明顯的區(qū)分開來。因此將這6個(gè)microRNA進(jìn)一步在小樣本中選用TaqMan Real-time PCR方法進(jìn)行初步的驗(yàn)證。雖然miR-886-3p、miR-125a-5p、miR-365和miR-489這4個(gè)microRNA未能在初步的驗(yàn)證中顯示出差異，但是由于驗(yàn)證的標(biāo)本量較少，敏感組和抗拒組均只有10例患者，因此可能存在偏倚和不足，如果能擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步的研究，可能會(huì)有更有說服力的結(jié)果。miR-101曾經(jīng)在宮頸癌中被報(bào)道表達(dá)下降，但并沒有它與治療相關(guān)方面的研究[14]。了解這些microRNAs在其他腫瘤中的研究，包括表達(dá)、作用的靶基因和相關(guān)作用機(jī)制等，可能對(duì)其在宮頸癌治療敏感性相關(guān)中的研究得到一定的啟示。

miRNA的異常表達(dá)可表現(xiàn)出被認(rèn)為與宮頸癌癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切的相關(guān)性[15]。然而，除了細(xì)胞活力本身之外，評(píng)估細(xì)胞死亡和PDT療效，沒有其他標(biāo)準(zhǔn)化的生物標(biāo)記物。已有研究通過高通量篩選技術(shù)的篩查出了與宮頸癌相關(guān)的MicroRNA，研究還提示了多指教MicroRNA基因的上調(diào)與宮頸癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，但特定區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)可以使人更易罹患疾病[16]，已有研究提示MicroRNA-421的+60位點(diǎn)上存在著基因多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)存在在種子序列當(dāng)中，可以調(diào)控該基因的成熟體，Cheng等[4]發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-95，124，125，133，134，144，150，152，187，190，191，192，193，204，211，218，220，296和299會(huì)減緩癌細(xì)胞的生長，而抑制miR-21和的miR-24顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的生長。此外，他們發(fā)現(xiàn)miRNA(miR-7，148，204，210，216和296)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，特定miRNA參與了細(xì)胞死亡應(yīng)答過程。本課題通過實(shí)時(shí)PCR定量測定凋亡相關(guān)的miRNA(miR-7，miR-148a，miR-204，miR-210，miR-216和miR-296的表達(dá)水平，旨在為差異miRNA對(duì)疾病的預(yù)測以及預(yù)后判斷，且為功能分析提供前提以及基礎(chǔ)。

miR-210是缺氧條件刺激下，最多的miRNA。由于PDT固有的后果是缺氧和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的HIF。本研究也觀察到miR-210的表達(dá)與其缺氧環(huán)境有關(guān)。已有報(bào)道HIF信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與miR-210的調(diào)節(jié)。為了研究miR-210功能部分或完全喪失導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)，他們還確定了miR-210的靶mRNA。根據(jù)該報(bào)告，miR-210作為一種重要的調(diào)節(jié)因子，參與基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞代謝，分化和發(fā)育[17]。miR-210作為重要的細(xì)胞過程調(diào)節(jié)器，以及參與腫瘤基因高頻拷貝過程，可以推測miR-210參與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞缺氧及細(xì)胞周期調(diào)控之間存在潛在聯(lián)系。

研究報(bào)道m(xù)iR-296在促進(jìn)腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。他們發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子單獨(dú)能夠增加miR-296的表達(dá)。此外該結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的反饋機(jī)制， VEGF誘導(dǎo)miR-296的表達(dá)，其靶點(diǎn)為肝細(xì)胞生長因子調(diào)控的酪氨酸激酶底物(HGS)，這反過來又導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子受體2和血小板衍生生長因子(PDGF)受體β蛋白水平的增加，最終提高血管內(nèi)皮生長因子的生成[18]。PDT處理后的固有后果之一，就是腫瘤細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長因子的敏感性增加[19]，因此我們的研究結(jié)果表明，抑制miR-296的表達(dá)，阻礙反饋機(jī)制，減少VEGF，應(yīng)該能夠改善PDT療效。

綜上所論， PDT導(dǎo)致缺氧，后者誘導(dǎo)miR-210的表達(dá)，隨后增加VEGF表達(dá)和miR-296的表達(dá)。因此，miR-210和miR-296的表達(dá)水平，可作為衡量PDT治療宮頸癌療效的生物標(biāo)記物。

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關(guān)于文稿中法定計(jì)量單位的書寫要求

本刊法定計(jì)量單位實(shí)行國務(wù)院1984年2月頒布的《中華人民共和國法定計(jì)量單位》，并以單位符號(hào)表示，具體使用參照1991年中華醫(yī)學(xué)會(huì)編輯出版部編輯的《法定計(jì)量單位在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用》一書。注意單位名稱與單位符號(hào)不可混合使用，如ng·kg-1·天-1應(yīng)改為ng·kg-1·min-1；組合單位符號(hào)中表示相除的斜線多于1條時(shí)，應(yīng)采用負(fù)數(shù)冪的形式表示，如ng/kg/min應(yīng)采用ng·kg-1·min-1的形式；組合單位中斜線和負(fù)數(shù)冪亦不可混用，如前例不宜采用ng/kg·min-1的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計(jì)量單位處用括號(hào)加注與舊制單位的換算系數(shù)，下文再出現(xiàn)時(shí)只列法定計(jì)量單位。人體及動(dòng)物體內(nèi)的壓力單位使用mmHg或cmH2O,但文中首次出現(xiàn)時(shí)用括號(hào)加注(1 mmHg=0.133 kPa)。正文中時(shí)間的表達(dá)，凡前面帶有具體數(shù)據(jù)者應(yīng)采用d、h、min、s，而不用天、小時(shí)、分鐘、秒。量的符號(hào)一律用斜體字母，如吸光度(舊稱光密度)的符號(hào)為A,“A”為斜體字。

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.020

通信作者：劉韻，女，副主任醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科疾病診斷與治療，E-mail:59210257@qq.com

(收稿日期：2015-05-04，修回日期：2015-07-09)

Photodynamic Treatment on miRNA in cancer cells

LAN Yan-li,LIU Yun

(XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiCollegeofArtsandSciences,Xiangyang,Hubei441021)

Abstract:Objective To study the photodynamic (PDT) effect on ervical cancer cells, miRNA expression.Methods HeLa cells were seeded into a black with clear bottom 96-well micro Optilux plates (BD Biosciences, CA) (1 × 104 cells / well).24 h later, when cells were attached to the culture plate, the medium was removed, and the cultures were washed 3 times in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4),PDT treatment with different concentrations of photosensitizer.HeLa cell viability evaluation PDT on impact, and cell count to assess their sensitivity for PDT.After laser irradiation 1 h, total cellular RNA of all HeLa cells Use Quick Gene RNA extraction cell culture kit.All DNA samples were enzymatically treated in order to avoid contamination of DNA, followed by the use of high capacity cDNA reverse transcription kit reverse transcription (RT).Apoptosis-related miRNA (miR-7, miR-148a, miR-204, miR-210, miR-216 and miR-296 expression levels were determined by quantitative real-time PCR.Results After PDT treatment 1h, compared with the control group without making any intervention treatment, HeLa cell viability was significantly reduced to 78%.24 hours after PDT treatment,HeLa cells all died. In addition, PDT poly caspase activity in HeLa cells within one hour after treatment, was significantly increased.In addition, the PDT treatment 1 h, miR-210 and miR-296 expression levels were significantly higher. However, the expression levels of other miRNA include miR-7, miR-148a, miR-204 and miR-216 no difference with the control group.

Conclusions Talaporfin sodium PDT photosensitizers treated as cervical cancer cells, distinct miRNA expression levels, the highest miR-210 and miR-296 expression levels can be used as markers of cervical cancer PDT efficacy thereof.

Key words:photodynamic therapy; small molecule RNA; apoptosis; HeLa cells; 5-ALA