大豆耐低磷相關(guān)基因的定位與克隆

張丹，宋海娜，程浩，喻德躍

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大豆耐低磷相關(guān)基因的定位與克隆

張丹1，宋海娜2，程浩3，喻德躍3

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；2. 平頂山學(xué)院低山丘陵區(qū)生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，平頂山 467000；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210095

大豆是食用油和植物蛋白的主要來源，土壤有效磷含量低是限制當(dāng)前大豆生產(chǎn)的重要因素之一。鑒定優(yōu)異耐低磷種質(zhì)資源、快速發(fā)掘利用優(yōu)異耐低磷基因、通過分子育種培育磷高效品種、改善大豆應(yīng)對低磷脅迫的能力，是解決土壤有效磷含量低這一問題的有效途徑。近年來，國內(nèi)外開展了一些大豆磷效率相關(guān)基因的定位與克隆研究，但由于QTL連鎖作圖的精度較低，難以準(zhǔn)確地分離候選基因，而大豆基因組的復(fù)雜性及相關(guān)功能基因分子機(jī)制的不明確阻礙了人們對大豆耐低磷特性本質(zhì)的認(rèn)識。文章綜述了大豆耐低磷相關(guān)基因的定位、克隆及功能驗(yàn)證等方面的研究進(jìn)展，分析了大豆耐低磷相關(guān)基因研究中存在的問題，以期為快速有效地分離目的基因、驗(yàn)證基因功能、解析大豆磷高效分子機(jī)制提供參考。

大豆；耐低磷；基因定位；分子育種

大面積土壤缺磷是目前限制我國農(nóng)作物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良的主要因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國耕地約有1億hm2，缺磷(有效磷≤10 mg/kg)的耕地面積約占81.5%，其中嚴(yán)重缺磷(有效磷≤5 mg/kg)的耕地占50.5%左右[1]。實(shí)際上土壤中的總磷含量并不低，只是能被植物直接吸收利用的有效磷含量很低，因此作物仍表現(xiàn)缺磷，這就是特有的“遺傳學(xué)缺磷”現(xiàn)象[2, 3]。為保證作物獲得或維持較高產(chǎn)量，只能不斷施用磷肥[4]。近來，我國每年在土壤中施用1100多萬噸磷肥，約占全球磷肥消費(fèi)總量的35%。而當(dāng)季磷肥利用效率僅為10%~25%，這意味著每年近1000萬噸磷素累積于土壤[5]。另外，過量施磷會(huì)造成土壤中有害元素的積累、環(huán)境污染增加[6]。更為嚴(yán)重的是，磷礦是不可再生資源，研究表明全球磷素資源有可能在未來30~100年間枯竭[7, 8]。由此將導(dǎo)致磷肥市場供不應(yīng)求，進(jìn)一步危及全球糧食安全。有研究表明，未來世界面臨的主要危機(jī)不是水危機(jī)，也不是石油危機(jī)，而是磷危機(jī)[7]。我國易開采的富磷礦儲量只占總儲量的8.4%，僅能維持我國10~15年時(shí)間的使用需求，磷素危機(jī)已經(jīng)對我國糧食生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。因此，面對土壤磷素利用率低及磷資源枯竭的危機(jī)，發(fā)掘作物自身潛力和高效利用土壤潛在的磷資源是解決供磷與磷流失矛盾和防止磷污染的有效途徑。

大豆[(L). Merr.]是世界上最重要的糧油兼用作物，是植物蛋白、食用油和動(dòng)物飼料的主要來源。作為需磷量較大的農(nóng)作物，大豆籽粒含磷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于水稻、小麥和玉米[9]。由于大豆的根瘤菌具有固氮作用，磷素已成為大豆生長及產(chǎn)量最重要的限制性元素[10]。磷的缺乏不僅影響大豆的生長發(fā)育，增加花莢脫落，還會(huì)抑制根瘤的形成，降低固氮效率，最終嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。因此，低磷脅迫已經(jīng)成為當(dāng)前我國大豆生產(chǎn)的重要限制因素。盡管大豆對低磷脅迫的耐性受數(shù)量性狀基因控制，是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果，但已有研究表明，不同大豆品種對低磷脅迫和磷肥效應(yīng)有顯著的遺傳差異[11~13]。磷效率本身的遺傳特性是不同大豆品種間耐低磷能力存在差異的主要原因，而耐低磷能力的強(qiáng)弱是影響大豆磷效率及產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，因此挖掘與大豆耐低磷能力相關(guān)的關(guān)鍵基因，通過分子標(biāo)記輔助選擇等手段選育磷高效的優(yōu)良品種，對提高大豆產(chǎn)量及高效利用土壤難溶態(tài)磷具有重要意義。

本文綜述了近年來大豆耐低磷相關(guān)基因的定位、克隆及功能驗(yàn)證等方面的研究進(jìn)展，介紹了目前大豆中已克隆的磷效率相關(guān)基因及其克隆方法，比較各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用特點(diǎn)，并對這些候選基因的功能及其潛在育種利用價(jià)值進(jìn)行了歸納。同時(shí)，分析了當(dāng)前研究存在的主要問題，期望能為快速準(zhǔn)確地選擇合適的目標(biāo)基因及大豆磷高效分子機(jī)制的解析研究提供參考。

1 大豆耐低磷相關(guān)基因的QTL定位

大豆磷效率是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，基于家系的連鎖分析是研究復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的經(jīng)典方法。近年來，國內(nèi)外通過連鎖分析對大豆磷效率相關(guān)性狀進(jìn)行了廣泛的QTL定位研究(表1)。2005年Li等[14]首先利用科豐1號與南農(nóng)1138-2雜交衍生的116個(gè)重組自交系在F連鎖群上檢測到7個(gè)與耐低磷相關(guān)QTL；同樣，耿雷躍等[15]利用該群體的184個(gè)家系在高磷和低磷水平下分別檢測到3個(gè)和12個(gè)加性的QTL，可解釋4.0%~13.8%的表型變異；另外在兩種磷水平下還檢測到19對互作QTL，可解釋3.3%~19.9%的表型變異。2007年，崔世友等[16]利用耐低磷品種南農(nóng)94-156和低磷敏感品種波高衍生的152個(gè)重組自交系通過盆栽試驗(yàn)對大豆耐低磷相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析，結(jié)果檢測到7個(gè)QTL，對表型變異的解釋率為4.8%~17.0%。Zhang等[17]利用同一群體進(jìn)一步在低磷和正常供磷條件下調(diào)查大豆苗期5個(gè)磷效率相關(guān)性狀，定位到34個(gè)加性QTL與耐低磷性狀相關(guān)。這些結(jié)果有助于人們初步認(rèn)識大豆耐低磷的遺傳基礎(chǔ)，為分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

上述研究中所采用的篩選指標(biāo)主要涉及生物量、磷含量、根相關(guān)性狀等，且均集中在苗期進(jìn)行。雖然大豆在苗期對磷缺乏較為敏感，但是筆者前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，大豆對低磷脅迫的另一個(gè)敏感期是開花結(jié)莢期，此時(shí)是大豆對磷素吸收的高峰時(shí)期，約占整個(gè)時(shí)期吸磷量的90%，尤其是結(jié)莢鼓粒期吸磷量約占一半以上，此時(shí)缺磷顯著減少花和莢的形成，增加花莢的脫落，原因是磷是大豆花和莢的形成所必須的營養(yǎng)元素[18]。因此，在花莢期選擇耐低磷相關(guān)性狀來評價(jià)大豆的耐低磷特性及進(jìn)行耐低磷QTL的定位研究更具合理性和代表性。2010年，Zhang等[19]利用南農(nóng)94-156和波高衍生的重組自交系群體嘗試在花莢期利用花莢脫落率、酸性磷酸酶活性和莢葉磷含量來評價(jià)大豆耐低磷性，取得良好效果，除了利用條件定位法在該時(shí)期檢測到耐低磷QTL的凈效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)對表型的貢獻(xiàn)達(dá)19.3%，還通過多年多點(diǎn)試驗(yàn)利用相對酶活性和莢葉磷含量定位到一個(gè)磷效率主效QTL，并在后期圖位克隆了控制該位點(diǎn)的基因[20](表1)。2010年，Liang等[21]在花期利用磷效率敏感基因型BD2和磷高效基因型BX10衍生的重組自交系對磷效率相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析，結(jié)果在 5個(gè)連鎖群上檢測到31個(gè)QTL位點(diǎn)，可解釋9.1%~31.1%的表型變異。此外，2013年，King等[22]利用92個(gè)F2:4家系定位大豆籽粒磷含量相關(guān)的QTL，共定位到3個(gè)QTL分別位于12、7和17號染色體上，其中兩個(gè)位點(diǎn)包括磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，一個(gè)位點(diǎn)包含一個(gè)ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，為進(jìn)一步研究磷酸鹽代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。

基于大豆耐低磷相關(guān)QTL定位結(jié)果，可以看出大豆磷效率除了受少數(shù)主效QTL作用外，還受大量微效多基因控制，而這些基因除了表現(xiàn)為加性效應(yīng)，還具有一定上位性作用。如位于大豆D1b+W連鎖群上Satt274標(biāo)記附近的QTL同時(shí)存在著加性效應(yīng)和上位性效應(yīng)，且在該位點(diǎn)還檢測到耐低磷QTL的凈遺傳效應(yīng)，對表型變異的解釋率也很大[19]。這些結(jié)果不僅說明大豆磷效率的遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，還表明磷效率存在主效QTL，為精細(xì)定位及圖位克隆主效QTL提供了理論依據(jù)。由于目前定位的磷效率QTL均是基于分離群體的家系連鎖分析所得，而分離群體又受雜交或自交次數(shù)的限制，缺乏足夠的重組事件，置信區(qū)間一般較大，導(dǎo)致QTL作圖的精度一般較低，因此被精細(xì)定位、圖位克隆的QTL非常少。

2 大豆耐低磷相關(guān)基因的克隆與功能分析

大豆是古四倍體自花授粉作物，基因組復(fù)雜且重復(fù)序列多。一些重要的功能基因，尤其是控制復(fù)雜數(shù)量性狀的基因，其克隆存在較大困難。目前，已克隆的大豆耐低磷相關(guān)基因主要是通過同源克隆和電子克隆獲得，也有少數(shù)基因是通過圖位克隆、芯片技術(shù)、抑制差減雜交及功能克隆等方法獲得。

2.1 圖位克隆獲得的大豆耐低磷相關(guān)基因

圖位克隆法(Map-based cloning)是分離和克隆植物基因的有效方法[24]，也是常用的基因克隆技術(shù)之一。近年來，盡管植物磷效率相關(guān)的QTL定位研究發(fā)展較快，但是通過圖位克隆法分離得到的磷效率相關(guān)基因卻很少。2012年，Gamuyao等[25]在水稻中通過經(jīng)典的圖位克隆法分離得到一個(gè)耐低磷相關(guān)基因()，該基因編碼一個(gè)蛋白激酶，能夠顯著增強(qiáng)水稻早期根系的生長，從而獲得更多的磷及其他營養(yǎng)元素，并最終增加產(chǎn)量。2014年，Zhang等[19]在連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合方法的基礎(chǔ)上，在大豆中圖位克隆了一個(gè)磷效率相關(guān)基因，該基因編碼一個(gè)酸性磷酸酶，其分離克隆過程不同于在水稻中的經(jīng)典圖位克隆方法。首先利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對前期連鎖分析定位一個(gè)主效耐低磷QTL()進(jìn)行驗(yàn)證，然后在該區(qū)域開發(fā)高密度的分子標(biāo)記，通過關(guān)聯(lián)分析局部掃描將目標(biāo)QTL限定在250 kb的范圍內(nèi)，并結(jié)合大豆基因組信息、生物信息學(xué)及誘導(dǎo)表達(dá)分析等方法分離并克隆了控制該位點(diǎn)的候選基因()。進(jìn)一步通過誘導(dǎo)表達(dá)分析、原核表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)證明在低磷條件下表達(dá)量顯著升高，導(dǎo)致酸性磷酸酶活性升高從而提高大豆耐低磷能力。通過候選基因關(guān)聯(lián)分析鑒定與大豆耐低磷相關(guān)的有利單倍型，開發(fā)了一個(gè)功能分子標(biāo)記[19]，為大豆磷高效分子育種提供新的基因信息和技術(shù)支持。

表1 已定位的大豆磷效率相關(guān)QTL

注：aNP表示自然群體。

2.2 同源克隆與電子克隆獲得的大豆耐低磷相關(guān)基因

同源克隆法(Homology-based cloning)是大豆基因克隆中常用的一種方法。不同物種具有相同或相似功能的基因及相對保守的區(qū)域，根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，然后利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA end, RACE)和染色體步移技術(shù)分別得到全長cDNA和全長基因[26]。這種方法相對于其他方法比較簡單，尤其是隨著對擬南芥、水稻等模式植物的深入研究，生物信息學(xué)迅猛發(fā)展，公共數(shù)據(jù)庫及輔助設(shè)計(jì)軟件日趨完善，不同物種具有相同或相似功能基因之間的基因組比較分析成為可能。因此，同源克隆也是目前大豆磷效率相關(guān)基因克隆中應(yīng)用最多的方法。近年來，國內(nèi)外研究者利用該方法克隆到的大豆磷效率相關(guān)基因見表2。如2009年Wang等[3]通過同源克隆的方法將擬南芥紫色磷酸酶基因轉(zhuǎn)入大豆，在酸性土壤中生長的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系磷效率及產(chǎn)量相關(guān)性狀均明顯優(yōu)于野生型，其中磷效率提高了117.8%、56.5%、57.8%，單株莢數(shù)提高35.9%、41.0%、59.0%，單株粒數(shù)也提高46.0%、48.3%、66.7%。2013年，Liang等[34]通過擬南芥基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物在大豆中擴(kuò)增得到一個(gè)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因()，結(jié)果表明蘋果酸分泌是大豆在酸性土壤中的重要適應(yīng)機(jī)制，土壤中pH值、鋁和磷三因素共同作用，影響蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)節(jié)其功能，并最終影響蘋果酸的分泌提高大豆對酸性土壤的適應(yīng)性。2014年，Kong等[35]通過搜索比對擬南芥數(shù)據(jù)庫克隆了一個(gè)大豆紫色酸性磷酸酶基因，該基因具有植酸酶活性，在植酸作為唯一磷源時(shí)，該基因的過量表達(dá)能提高擬南芥對有機(jī)磷的利用能力。另外，筆者所在實(shí)驗(yàn)室也利用同源克隆方法克隆到一個(gè)耐低磷相關(guān)基因，該基因編碼一個(gè)類受體蛋白激酶，初步驗(yàn)證該基因能夠提高大豆在低磷環(huán)境中的耐低磷能力(未發(fā)表)。

表2 利用同源克隆與電子克隆法獲得的大豆磷效率相關(guān)基因

電子克隆法是基于表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag, EST)和基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)展起來的基因克隆新型技術(shù)，利用生物信息學(xué)知識和計(jì)算機(jī)技術(shù)對EST 或基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較分析、整理拼接出新基因的編碼序列，確認(rèn)完整后根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證獲得全長基因[48]。隨著大豆EST數(shù)據(jù)庫中的基因片段不斷增加及大豆全基因組測序的完成，該方法在大豆磷效率相關(guān)基因克隆中應(yīng)用也較多(表2)。2012年，Qin等[43]以擬南芥與水稻中磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因基因?yàn)椴樵冃蛄兴阉鞔蠖够蚪M網(wǎng)站序列(http://www.phytozome.net/soy-bean.php)，克隆了一個(gè)高親和力的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，該基因調(diào)控磷從根向根瘤中的輸送，對大豆的根瘤及植株生長起著重要的調(diào)控作用。2013年，F(xiàn)an等[45]基于大豆基因組數(shù)據(jù)庫(Phytozome V8.0)獲得14個(gè)基因家族的序列，通過RT-PCR電子克隆了這些基因，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這些基因起源于4個(gè)不同的祖先，實(shí)驗(yàn)表明基因家族各成員在維持細(xì)胞乃至整個(gè)植株體內(nèi)磷的平衡具有協(xié)同作用。2014年，Yao等[47]通過搜索大豆基因組數(shù)據(jù)庫獲得了9個(gè)成員，系統(tǒng)發(fā)育分析將這9個(gè)成員分為3組，每個(gè)成員對氮、磷、鉀和鐵的缺乏有不同的響應(yīng)，其中在高磷處理?xiàng)l件下，過表達(dá)基因能夠增加植株根和莖中磷的濃度，同時(shí)在大豆毛狀根中，能導(dǎo)致其他7個(gè)磷饑餓相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果為大豆耐低磷脅迫和磷高效利用的功能基因組和分子設(shè)計(jì)育種打下了基礎(chǔ)。

盡管同源克隆法在發(fā)掘磷效率相關(guān)基因時(shí)相對于傳統(tǒng)方法具有一定的優(yōu)越性。但是通過這種方法獲得真正有功能的磷效率基因仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。比如克隆得到的同源序列可能與目的磷效率基因無關(guān)；也可能只是與目的基因緊密連鎖等。因此，應(yīng)用這種方法要注意一些問題。首先，在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡可能考慮到出現(xiàn)的問題和目的基因的類別，如進(jìn)行PCR檢驗(yàn)時(shí)所設(shè)計(jì)引物是否會(huì)擴(kuò)增出非目的片段。其次，磷效率基因在植物中多成簇或以基因家族的形式存在，難以判斷克隆產(chǎn)物是否為目的基因片段。第三，一些新的磷效率相關(guān)基因可能不具有保守域結(jié)構(gòu)，而是新的編碼蛋白，用此方法不能得到目的基因。對于電子克隆而言，盡管這種方法在理論上已沒有什么障礙，且具有效率高、成本低、對實(shí)驗(yàn)條件要求低等特點(diǎn)，但是由于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，許多分析軟件的輸出結(jié)果存在較大的偏差，因此利用生物信息學(xué)進(jìn)行的“虛擬”克隆的結(jié)果尚需回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 抑制性差減雜交與基因芯片等方法獲得的大豆磷效率相關(guān)基因

抑制性差減雜交(Suppression subtractive hybridization , SSH)是用于分離在特定組織、特定發(fā)育階段或特定環(huán)境下表達(dá)的基因的方法。以其假陽性低、敏感性高、速度快、效率高等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)。SSH技術(shù)不需要目的基因的序列信息和位置信息，已在植物基因克隆中得到了廣泛應(yīng)用。Guo等[49]和Zhou等[50]從低磷誘導(dǎo)SSH文庫中篩選得到一個(gè)β-擴(kuò)張蛋白基因，該基因在低磷誘導(dǎo)的大豆根系中高效表達(dá)，且參與根尖的形態(tài)建成，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的根系細(xì)胞分裂與伸長明顯增加，從而使得轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長與磷素吸收也得到明顯改善。轉(zhuǎn)大豆缺磷處理使基因在根系和下胚軸中的表達(dá)量增加；缺磷條件下，基因通過參與植株根毛的伸長過程，從而影響植株的生長和磷吸收量。SSH技術(shù)也有局限性，只能用于兩個(gè)樣本的比較，只能篩選在對照樣本中不表達(dá)的基因，不能反應(yīng)表達(dá)量的差別。

基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段。2014年，Song等[23]根據(jù)基因芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一個(gè)在葉片大量表達(dá)的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因()，并對該基因的表達(dá)模式及功能進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在老葉中具有較高的表達(dá)量，其中在低磷脅迫處理15 d的大豆幼苗成熟葉、幼葉和側(cè)根中表達(dá)量極顯著增強(qiáng)，表明該基因可能參與地上部磷酸鹽的活化再轉(zhuǎn)移過程。進(jìn)一步在煙草中過表達(dá)該基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在低磷脅迫條件下顯著提高了植株的總干重、磷的利用效率和籽粒重量。雖然芯片技術(shù)本身也具有局限(如假陽性高、得到的cDNA片段也比較短)，但它是一種可以在大豆基因克隆中廣泛應(yīng)用且有效的方法。

2.4 其他方法獲得的大豆磷效率相關(guān)基因

除了以上主要方法外，近年來在大豆磷效率相關(guān)基因克隆和功能研究中還利用了一些其他的基因克隆方法如功能克隆方法，并且取得了一些研究進(jìn)展。

傳統(tǒng)的功能克隆方法屬于正向遺傳學(xué)的范疇，是根據(jù)已知基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物反推其核苷酸序列，再根據(jù)此序列設(shè)計(jì)探針或引物從cDNA文庫或者基因組文庫中篩選克隆，也可以制備產(chǎn)量抗體，從表達(dá)載體構(gòu)建的cDNA文庫中篩選相應(yīng)的克隆，進(jìn)而分離目的基因。如2001年Hegeman等[51]利用功能克隆方法從萌發(fā)的大豆子葉中得到了大豆中的一個(gè)植酸酶基因，分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列與其他植物中已知的紫色酸性磷酸酶基因序列的同源性較高，而與已報(bào)道的玉米或者微生物來源的植酸酶基因蛋白序列同源性較低；能夠在大豆幼苗子葉中特異表達(dá)，該基因轉(zhuǎn)入大豆懸浮細(xì)胞后，獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系具有較高的植酸酶活性。表明該基因可分解貯存在植株子葉中的植酸磷，為幼苗后期正常生長提供磷源，轉(zhuǎn)基因大豆細(xì)胞的植酸酶活性明顯提高。這種方法的局限性是只適用于克隆那些蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其相應(yīng)功能都已清楚的基因，無法克隆蛋白質(zhì)產(chǎn)物還不清楚的基因。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，表達(dá)譜測序技術(shù)成為功能基因發(fā)掘的重要手段。2013年，Xu等[52]利用小RNA和降解組測序技術(shù)對磷充分和磷缺乏條件下獲得的大豆葉片和根部的4個(gè)小RNA文庫和磷缺乏大豆根部的一個(gè)降解組文庫進(jìn)行測序。結(jié)果在低磷脅迫條件下，檢測到25個(gè)miRNAs被誘導(dǎo)和11個(gè)miRNAs受抑制。其中miR399受低磷脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，作用于靶基因和，作用位點(diǎn)在的5￠非編碼區(qū)和的編碼區(qū)。研究結(jié)果為闡明miRNAs在磷信號傳導(dǎo)中發(fā)揮的作用以及磷代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了有用的信息。

3 大豆磷效率基因研究的問題與展望

目前我國大豆生產(chǎn)形勢十分嚴(yán)峻，需求缺口及進(jìn)口量逐年增大，危及國家的糧食安全。僅靠土壤增施磷肥求高產(chǎn)的傳統(tǒng)途徑已不適應(yīng)當(dāng)今農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。發(fā)掘磷高效基因，提高大豆自身活化吸收土壤無效態(tài)磷的能力是生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要方向。采用常規(guī)育種手段與現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合的方法來實(shí)現(xiàn)磷高效基因的轉(zhuǎn)育，具有速度快、育種進(jìn)程短等優(yōu)點(diǎn)，因而越來越受到重視。然而，要實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因育種與常規(guī)育種的有效結(jié)合，分離和發(fā)掘新的、有功能的磷效率關(guān)鍵基因無疑是開展上述研究的重要前提。近10年來，大量磷效率相關(guān)QTL的定位為大豆磷高效分子育種奠定了良好的基礎(chǔ)，然而相對于模式植物來說，大豆磷效率相關(guān)基因的圖位克隆及育種應(yīng)用卻進(jìn)展緩慢，主要有以下幾個(gè)方面的原因：(1)缺少統(tǒng)一的磷效率評價(jià)指標(biāo)和篩選時(shí)期，難以準(zhǔn)確鑒定磷效率特異基因型；(2)定位研究所用的材料及群體遺傳基礎(chǔ)相對狹窄，難以找到可供育種利用的最有利等位基因；(3)QTL在染色體上的范圍較大，且基因組龐大，構(gòu)建高密度的分子標(biāo)記圖譜困難，QTL精細(xì)定位及圖位克隆難以實(shí)現(xiàn)；(4)大豆遺傳轉(zhuǎn)化率相對較低，導(dǎo)致基因的功能驗(yàn)證比較困難；(5)大多試驗(yàn)在溫室和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，缺少大田試驗(yàn)的驗(yàn)證，很少考慮表型與環(huán)境的互作，應(yīng)用于生產(chǎn)仍有一定距離。

因此，為克服上述問題，加速大豆磷高效育種進(jìn)程，需要快速準(zhǔn)確地獲得磷高效主效基因，充分了解磷效率關(guān)鍵基因的功能和分子機(jī)制，明確其作用機(jī)理，篩選出可用于育種實(shí)踐的磷高效功能基因，加快這些候選基因的轉(zhuǎn)化應(yīng)用及育種進(jìn)程。首先，應(yīng)在大豆苗期磷效率QTL連鎖分析的基礎(chǔ)上，對田間大豆花莢期耐低磷性開展更為廣泛的定位研究，鑒定QTL的穩(wěn)定性和與環(huán)境的互作效應(yīng)；其次，要拓寬種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)，如加入野生豆和地方性種質(zhì)資源等，利用基于自然群體進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析或連鎖分析與關(guān)聯(lián)分析相互結(jié)合，快速實(shí)現(xiàn)主效QTL的精細(xì)定位與圖位克隆，發(fā)掘蘊(yùn)藏于種質(zhì)資源基因組中最有利的耐低磷等位基因；最后，基于對所克隆基因功能的認(rèn)識，采用分子標(biāo)記輔助選擇將優(yōu)良等位基因聚合到優(yōu)良遺傳背景中，通過全基因組設(shè)計(jì)創(chuàng)造出集中眾多優(yōu)良基因、性狀得到明顯改良的新種質(zhì)或新品種。將來會(huì)有多種類型的磷高效基因應(yīng)用于生產(chǎn)，打破土壤中磷的“遺傳學(xué)缺乏”，低磷脅迫對大豆乃至其他作物生產(chǎn)的影響有望得到有效解決。

[1] 曾憲坤. 磷的農(nóng)業(yè)化學(xué) (Ⅱ). 磷肥與復(fù)肥, 1999, 14(2): 63–69.

[2] 尹遜霄, 華珞, 張振賢, 滑麗萍, 高娟. 土壤中磷素的有效性及其循環(huán)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 26(3): 95–101.

[3] Wang XR, Wang YX, Tian J, Lim BL, Yan XL, Liao H. Overexpressingenhances phosphorus efficiency in soybean., 2009, 151(1): 233–240.

[4] Yan XL, Wu P, Ling HQ, Xu GH, Xu FS, Zhang QF. Plant nutriomics in China: an overview., 2006, 98(3): 473–482.

[5] 方陵生. 磷肥過度使用之警示. 世界科學(xué), 2010, (11): 6, 5.

[6] Behrendt H, Boekhold A. Phosphorus saturation in soils and ground waters., 1993, 4(4): 233–243.

[7] Oelkers EH, Valsami–Jones E. Phosphate Mineral Reactivity and Global Sustainability., 2008, 4(2): 83–87.

[8] Mihelcic JR, Fry LM, Shaw R. Global potential of phosphorus recovery from human urine and feces., 2011, 84(6): 832–839.

[9] 李喜煥, 常文鎖, 張彩英. 中國大豆磷素營養(yǎng)及磷高效品種篩選最新進(jìn)展. 大豆科學(xué), 2011, 30(2): 322–327.

[10] 任海紅, 劉學(xué)義, 李貴全. 大豆耐低磷脅迫研究進(jìn)展. 分子植物育種, 2008, 6(2): 316–322.

[11] 丁洪, 李生秀, 郭慶元, 張學(xué)江, 徐巧珍. 酸性磷酸酶活性與大豆耐低磷能力的相關(guān)研究. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 1997, 3(2): 123–128.

[12] 徐青萍, 羅超云, 廖紅, 嚴(yán)小龍, 年海. 大豆不同品種對磷脅迫反應(yīng)的研究. 大豆科學(xué), 2003, 22(2): 108–114.

[13] Wang LD, Liao H, Yan XL, Zhuang BC, Dong YS. Genetic variability for root hair traits as related to phosphorus status in soybean., 2004, 261(1–2): 77–84.

[14] Li YD, Wang YJ, Tong YP, Gao JG, Zhang JS, Chen SY. QTL mapping of phosphorus deficiency tolerance in soybean (L. Merr.)., 2005, 142(1–2): 137–142.

[15] 耿雷躍, 崔士友, 張丹, 邢邯, 蓋鈞鎰, 喻德躍. 大豆磷效率QTL定位及互作分析. 大豆科學(xué), 2007, 26(4): 460–466.

[16] 崔世友, 耿雷躍, 孟慶長, 喻德躍. 大豆苗期耐低磷性及其QTL定位. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(3): 378–383.

[17] Zhang D, Cheng H, Geng LY, Kan GZ, Cui SY, Meng QC, Gai JY, Yu DY. Detection of quantitative trait loci for phosphorus deficiency tolerance at soybean seedling stage., 2009, 167(3): 313–322.

[18] Mengel K, Kirkby EA,Kosegarten H, Appel T. Principles of Plant Nutrition. International Potash. Institute, Berne, Switzerland: Kluwer Academic Publishers, 2001.

[19] Zhang D, Liu C, Cheng H, Kan G, Cui S, Meng Q, Gai J, Yu D. Quantitative trait loci associated with soybean tolerance to low phosphorus stress based on flower and pod abscission., 2010, 129(3): 243–249.

[20] Zhang D, Song H, Cheng H, Hao D, Wang H, Kan G, Jin H, Yu D. The Acid Phosphatase-Encoding GeneContributes to Soybean Tolerance to Low-Phosphorus Stress., 2014, 10(1): e1004061.

[21] Liang Q, Cheng XH, Mei MT, Yan XL, Liao H. QTL analysis of root traits as related to phosphorus efficiency in soybean., 2010, 106(1): 223–234.

[22] King KE, Lauter N, Lin SF, Scott MP, Shoemaker RC. Evaluation and QTL mapping of phosphorus concentration in soybean seed., 2013, 189(2): 261–269.

[23] Song HN, Yin ZT, Chao MN, Ning LH, Zhang D, Yu DY. Functional properties and expression quantitative trait loci for phosphate transporterin soybean.,, 2014, 37(2): 462–472.

[24] Peters JL, Cnudde F, Gerats T. Forward genetics and map-based cloning approaches., 2003, 8(10): 484–491.

[25] Gamuyao R, Chin J H, Pariasca-Tanaka J,Pesaresi P, Catausan S, Dalid C, Slamet-Loedin I, Tecson-Mendoza EM, Wissuwa M, Heuer S. The protein kinasefrom traditional rice confers tolerance of phosphorus deficiency., 2012, 488(7412): 535–539.

[26] 李子銀, 陳受宜. 水稻抗病基因同源序列的克隆、定位及其表達(dá). 科學(xué)通報(bào), 1999, 44(7): 727–733.

[27] Li J, Hegeman CE, Hanlon RW, Lacy GH, Denbow DM, Grabau EA. Secretion of active recombinant phytase from soybean cell-suspension cultures., 1997, 114(3): 1103–1111.

[28] Li GL, Yang SH, Li MG, Qiao YK, Wang JH. Functional analysis of an Aspergillus ficuum phytase gene inand its root-specific, secretory expression in transgenic soybean plants., 2009, 31(8): 1297–1303.

[29] Gillman JD, Pantalone VR, Bilyeu K. The low phytic acid phenotype in soybean line CX1834 is due to mutations in two homologs of the maize low phytic acid gene., 2009, 2(2): 179–190.

[30] Wu B, Li XH, Liu C, Wang YJ, Li WL, Chang WS, Zhang CY. Genetic transformation and function analysis of transcription factorin soybean., 2013, 32(3): 302–305.

[31] 王軍衛(wèi), 侯立江, 李登, 程春明, 王瑞珍, 趙現(xiàn)偉, 趙朝森. 野生大豆紫色酸性磷酸酶基因的克隆及分析. 大豆科學(xué), 2013, 32(5): 596–600.

[32] Li XH, Wu B, Kong YB, Zhang CY., a novel transcription factor gene, is involved in conferring soybean tolerance to phosphate starvation., 2014, 13(1): 926–937.

[33] 鐘磊, 喬亞科, 喬瀟, 李桂蘭, 王林紅, 劉晨光. 轉(zhuǎn)基因大豆在低磷脅迫下的表現(xiàn). 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 27(7): 1041–1047.

[34] Liang CY, Pi?eros MA, Tian J, Yao ZF, Sun LL, Liu JP, Shaff J, Coluccio A, Kochian LV, Liao H. Low pH, aluminum, and phosphorus coordinately regulate malate exudation throughto improve soybean adaptation to acid soils., 2013, 161(3): 1347–1361.

[35] Kong YB, Li XH, Ma J, Li WL, Yan GJ, Zhang CY., a novel purple acid phosphatase gene isolated from soybean (), enhanced extracellular phytate utilization in., 2014, 33(4): 655–667.

[36] Shen H, Chen JH, Wang ZY, Yang CY, Sasaki T, Yamamoto Y, Matsumoto H, Yan XL. Root plasma membrane H-ATPaseis involved in the adaptation of soybean to phosphorus starvation., 2006, 57(6): 1353–1362.

[37] Shen H, He LF, Sasaki T, Yamamoto Y, Zheng SJ, Ligaba A, Yan XL, Ahn SJ, Yamaguchi M, Sasakawa H. Citrate secretion coupled with the modulation of soybean root tip under aluminum stress. Up-regulation of transcription, translation, and threonine-oriented phosphorylation of plasma membraneH-ATPase., 2005, 138(1): 287–296.

[38] 郭麗. 大豆苗期磷代謝生理參數(shù)和大豆新型植酸酶基因 ()克隆[學(xué)位論文].保定: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[39] 郭麗, 趙玉新, 張樹華, 張海娜, 肖凱. 超表達(dá)大豆植酸酶基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草植株利用有機(jī)態(tài)磷能力的影響. 中國科技論文在線, 2009.

[40] Wu ZY, Zhao JM, Gao RF, Hu GJ, Gai JY, Xu GH, Xing H. Molecular cloning, characterization and expression analysis of two members of thefamily of phosphate transporters in., 2011, 6(6): e19752.

[41] Tamura Y, Kobae Y, Mizuno T, Hata S. Identification and expression analysis of arbuscular mycorrhiza-inducible phosphate transporter genes of soybean.,, 2011, 76(2): 309–313.

[42] Li CC, Gui SH, Yang T, Walk T, Wang XR, Liao H. Identification of soybean purple acid phosphatase genes and their expression responses to phosphorus availability and symbiosis.,2012, 109(1): 275–285.

[43] Qin L, Zhao J, Tian J, Chen LY, Sun ZA, Guo YX, Lu X, Gu M, Xu GH, Liao H. The high-affinity phosphate transporterregulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean., 2012, 159(4): 1634–1643.

[44] Qin L, Guo YX, Chen LY, Liang RK, Gu M, Xu GH, Zhao J, Walk T, Liao H. Functional characterization of 14family genes in yeast and their expressions in response to nutrient starvation in soybean., 2012, 7(10): e47726.

[45] Fan CM, Wang X, Hu RB, Wang YH, Xiao CW, Jiang Y, Zhang XM, Zheng CY, Fu YF. The pattern ofgenes evolutionary divergence inL., 2013, 13(1): 48.

[46] Singh P, Punjabi M, Jolly M, Rai RD, Sachdev A. Characterization and expression of codon optimized soybean phytase gene in., 2013, 50(6): 537–547.

[47] Yao ZF, Tian J, Liao H. Comparative characterization ofmembers reveals thatGmSPXis involved in phosphate homeostasis in soybean., 2014, 114 (3): 477–488.

[48] 王冬冬, 朱延明, 李勇, 李杰, 柏錫. 電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 37(3): 403–408.

[49] Guo WB, Zhao J, Li XX, Qin L, Yan XL, Liao H. A soybean β-expansin geneintrinsically involved in root system architecture responses to abiotic stresses., 2011, 66(3): 541–552.

[50] Zhou J, Xie JN, Liao H, Wang XR. Overexpression of β-expansin geneimproves phosphorus efficiency in soybean., 2014, 150(2): 194–204.

[51] Hegeman CE, Grabau EA. A novel phytase with sequence similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of germinating soybean seedlings., 2001, 126(4): 1598–1608.

[52] Xu F, Liu Q, Chen LY, Kuang JB, Walk T, Wang JX, Liao H. Genome-wide identification of soybean microRNAs and their targets reveals their organ-specificity and responses to phosphate starvation., 2013, 14(1): 66.

(責(zé)任編委: 吳為人)

Mapping and cloning of low phosphorus tolerance genes in soybeans

Dan Zhang1, Haina Song2, Hao Cheng3, Deyue Yu3

Soybean is a major source of edible oil and phytoprotein. Low phosphorus available in soil is an important factor limiting the current soybean production. Effective ways to solve the problem include identification of germplasms and genes tolerant to low-phosphorus stress, and cultivation of soybean varieties with high phosphorus efficiency. Recently many researches have been carrying out investigations to map and clone genes related to phosphorus efficiency in soybeans. However, due to the complexity of the soybean genome and little knowledge of functional genes, it has been difficult to understand the mechanism of soybean tolerance to low phosphorus. Although quantitative trait locus (QTL) mapping related to low phosphorus tolerance has made some progress, it remains elusive to obtain accurate candidate genes for molecular breeding applications, due to the limited accuracy of QTL. Even for the cloned soybean low phosphorus tolerance genes, the molecular mechanisms are largely unknown, further limiting the application to breeding. In this review, we summarize the progresses on mapping, cloning and functional characterization of soybean low phosphorus tolerance genes.

soybean; low phosphorus tolerance; gene mapping; molecular breeding

2014-07-18;

2014-09-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31301336, 31370034)資助

張丹，博士，副教授，研究方向：植物分子遺傳與育種。E-mail: zhangdan8006@163.com

喻德躍，博士，教授，研究方向：植物分子遺傳與育種。E-mail: dyyu@njau.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-244

2014-12-24 9:50:27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141224.0950.001.html