李月靈, 金則新, 李鈞敏, 郭素民, 3, 管 銘

1 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海 200234 2 臺(tái)州學(xué)院生態(tài)研究所, 臺(tái)州 318000 3 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 臨汾 041004

接種土壤微生物對(duì)銅脅迫下海州香薷生長(zhǎng)及光合生理的影響

李月靈1, 2, 金則新2,*, 李鈞敏2, 郭素民2, 3, 管 銘2

1 上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 上海 200234 2 臺(tái)州學(xué)院生態(tài)研究所, 臺(tái)州 318000 3 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 臨汾 041004

采用框栽試驗(yàn)方法，模擬Cu脅迫條件下，探討接種土壤微生物對(duì)海州香薷(Elsholtziasplendens)生長(zhǎng)和光合生理的影響。結(jié)果表明：(1)在Cu脅迫下，海州香薷株數(shù)、株高、基徑、生物量、莖重比均顯著低于對(duì)照；與Cu脅迫相比，接種土壤微生物能顯著緩解Cu脅迫對(duì)海州香薷生長(zhǎng)的抑制作用，使植株的株數(shù)、株高、生物量、莖重比顯著提高。Cu脅迫下，接種土壤微生物均降低了植株體內(nèi)不同器官Cu含量，莖和葉Cu的累積量顯著減少，但對(duì)其它器官的Cu含量影響不顯著。(2)秋季，各處理的海州香薷的凈光合速率(Pn)日變化均呈“單峰”曲線，接種土壤微生物顯著提高了Cu脅迫下海州香薷的日均Pn、日均蒸騰速率(Tr)，而日均氣孔導(dǎo)度(Gs)、日均胞間CO2濃度(Ci)顯著降低。(3)Cu脅迫下，接種土壤微生物顯著提高了植株的最大凈光合速率(Pnmax)、光飽和點(diǎn)(LSP)、表觀量子效率(AQY)、最大羧化速率(Vcmax)、最大電子傳遞速率(Jmax)、磷酸丙糖利用率(TPU)，且使光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)顯著降低。表明接種土壤微生物通過(guò)提高光能利用率、利用弱光和碳同化能力來(lái)增強(qiáng)光合作用能力及有機(jī)物的積累，緩解Cu脅迫對(duì)海州香薷的毒害。因此，接種土壤微生物可促進(jìn)Cu脅迫下海州香薷的生長(zhǎng)，在重金屬污染土壤的植物修復(fù)中具有較好的應(yīng)用潛力。

海州香薷; 土壤微生物; 銅脅迫; 生長(zhǎng); 光合生理

近年來(lái)，礦區(qū)廢棄地等土壤重金屬污染日益成為全球環(huán)境污染治理的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)[1]。我國(guó)的重金屬尾礦堆存約60—80億t，且以每年3億t的數(shù)量增加，急需進(jìn)行生態(tài)修復(fù)。這些尾礦廢棄地保持水肥能力差、重金屬濃度過(guò)高、營(yíng)養(yǎng)元素貧瘠、生物不易成活[2]。銅(Cu)作為植物所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素和許多重要酶、結(jié)構(gòu)蛋白的必要成分，廣泛參與植物的各種生理代謝過(guò)程。但過(guò)量的Cu會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害，在形態(tài)上導(dǎo)致植株的存活率和生物量降低、延遲開(kāi)花和果實(shí)成熟時(shí)間以及籽粒的發(fā)育等，使植物產(chǎn)量下降[3- 4]；生理生化方面多表現(xiàn)為損害植物的光合作用[5]、細(xì)胞壁代謝[6]、抑制酶活性[7]、造成氧化還原作用失控，影響DNA以及生物膜的完整性[8]，最終導(dǎo)致植物退綠、枯萎，甚至死亡。土壤微生物在植物與土壤的相互反饋?zhàn)饔冒l(fā)揮著重要的作用，能響應(yīng)選擇壓力而發(fā)生快速改變，并進(jìn)一步反饋影響植物種群[9]。在非生物脅迫方面，一些研究發(fā)現(xiàn)很多共生的內(nèi)生真菌以及根際微生物與植物耐受或抵抗高溫、低溫、鹽漬、干旱等脅迫密切相關(guān)[10]。Lau等[11]利用模擬人工進(jìn)化方法發(fā)現(xiàn)土壤微生物可以緩解植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，從而改變天然選擇對(duì)植物種群的影響格局。已有研究表明，叢枝菌根真菌的根內(nèi)和根外菌絲能產(chǎn)生有機(jī)酸、糖蛋白球囊霉素等化學(xué)物質(zhì)，與重金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，幫助宿主植物減少對(duì)重金屬的吸收[12]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，本地病原菌的積累可能會(huì)抑制優(yōu)勢(shì)種后代的生長(zhǎng)，從而有利于其它植物幼苗的生長(zhǎng)固定[13]。事實(shí)上，微生物廣泛分布于重金屬污染土壤中，有些微生物具有很強(qiáng)的重金屬耐受性。這些微生物可通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)配體、釋放代謝分子(有機(jī)酸、Fe載體)[14- 15]、分泌生長(zhǎng)激素(IAA)[16]、促進(jìn)土壤P、K的可溶性[17- 18]和合成某些酶(ACC脫氫酶)[19]等直接或間接在植物生長(zhǎng)生理和對(duì)重金屬的吸收發(fā)揮作用。

海州香薷(Elsholtziasplendens)為唇形科(Labiatae)香薷屬(Elsholtzia)一年生草本植物，又名“銅草花”、“銅草”，為常見(jiàn)的Cu礦指示植物[20]。海州香薷野生資源十分豐富，廣泛分布于長(zhǎng)江中下游地區(qū)。其不僅全草入藥，有一定的藥用價(jià)值，而且具有廣布性、適應(yīng)性強(qiáng)、易繁殖等特點(diǎn)[21]，是一種有潛力的菌根修復(fù)植物[22- 23]。目前對(duì)微生物調(diào)控海州香薷耐性機(jī)制已有報(bào)道，主要涉及金屬硫蛋白的分泌[20]、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[18]、改變根際微環(huán)境[24]等方面。有關(guān)滅菌土壤中接種單一或是若干菌株對(duì)海州香薷的影響及其機(jī)制已有較多的研究，但對(duì)接種野外土壤微生物對(duì)海州香薷生長(zhǎng)和光合生理的影響未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以無(wú)污染區(qū)植物海州香薷為材料，分析Cu脅迫下接種野外土壤微生物對(duì)海州香薷生長(zhǎng)和光合生理參數(shù)的影響，試圖闡明：(1)Cu脅迫對(duì)海州香薷的影響如何？(2)滅菌條件下接種土壤微生物對(duì)海州香薷的生長(zhǎng)和光合生理影響如何？(3)接種土壤微生物如何改變由Cu脅迫所引起的海州香薷生長(zhǎng)和生理響應(yīng)？以期了解土壤微生物對(duì)海州香薷適應(yīng)重金屬脅迫的調(diào)節(jié)機(jī)制，為重金屬污染地區(qū)的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物海州香薷種子采自湖北紅安縣無(wú)污染地區(qū)(31°30.632′N(xiāo)、114°32.620′E)，海拔118 m。野外接種土壤采自湖北陽(yáng)新縣赤馬山銅礦(29°59.776′N(xiāo)、115°05.856′E)，海拔138 m。取樣后立刻將采集的土壤過(guò)1 mm篩，以除去土壤中的植物殘?bào)w、根系、土壤動(dòng)物及碎石雜質(zhì)等因素的影響。選取50 cm×40 cm×30 cm的塑料框，內(nèi)裝32.5 kg土壤(干重)，供試土壤經(jīng)過(guò)121 ℃滅菌2 h后的基質(zhì)(黑土∶砂石∶蛭石=6∶3∶1)。供試土壤的基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 土壤基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physical and chemical characteristics of soils

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

試驗(yàn)采用雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，接種與不接種土壤微生物以及添加與不添加Cu兩因素兩水平，共4個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，構(gòu)建24個(gè)試驗(yàn)單元，分別為對(duì)照(CK)、添加Cu(Cu脅迫)、接種土壤微生物(SM)、添加Cu+接種土壤微生物(Cu+SM)，在溫室中隨機(jī)擺放。土壤微生物接種參考Lau和Lennon[11]和Nie等[25]方法，于2012年5月上旬，采用5%(體積比)野外采集的土壤于95%基質(zhì)(黑土∶砂石∶蛭石=6∶3∶1)中，混勻后待用；以添加等體積經(jīng)121 ℃滅菌2 h后的土壤作為不接種土壤微生物處理。接種土壤微生物后進(jìn)行重金屬處理，采用添加CuSO4溶液至濃度1000 mg/kg土壤，以添加等體積的無(wú)菌水作為不添加重金屬處理。于2012年5月上旬對(duì)種子進(jìn)行殺菌處理后放在48孔穴盤(pán)中于溫室中萌發(fā)，待植物幼苗長(zhǎng)出6葉苗齡時(shí)，取相似大小的幼苗進(jìn)行移栽。于2012年6月下旬將幼苗隨機(jī)栽入基質(zhì)中，每隔4 cm栽種1株，每個(gè)塑料框內(nèi)共100株，所有植株按常規(guī)管理，保持水肥一致，于智能玻璃溫室中繼續(xù)培養(yǎng)。溫室培養(yǎng)條件：白天相對(duì)濕度為(70±10.5)%，晚上為(57±7.2)%，白天溫度為(30.0±5) ℃，夜間為(18.0±2) ℃，自然光照條件。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法1.3.1 土壤基本理化性質(zhì)

按土壤農(nóng)化常規(guī)分析法測(cè)定[26]。

1.3.2 形態(tài)及生物量測(cè)定

于2012年12月中旬植株衰老期，每個(gè)處理隨機(jī)選擇30個(gè)植株，用直尺測(cè)每個(gè)植物株高，基徑測(cè)定部位為高于土面2 cm處，每株用游標(biāo)卡尺交叉測(cè)定2次。

植物染毒處理176 d后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理植株的存活率，將植株的地上和地下部分分開(kāi)，用去離子水沖洗干凈，之后，將各部分分別放入紙袋中，于105 ℃殺青20 min，在80 ℃下烘干至恒重，每框?yàn)橐粋€(gè)重復(fù)，共6個(gè)重復(fù)。由于此時(shí)葉已脫落，每個(gè)處理中僅測(cè)定根、莖、花序生物量，計(jì)算其干重和莖重比、根重比等參數(shù)。

1.3.3 重金屬含量測(cè)定

將烘干至恒重的每個(gè)處理海州香薷根、莖、葉(收集掉落框內(nèi)的部分葉片)、花序及種子各個(gè)部分用粉碎機(jī)充分研磨混勻。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g粉碎樣品于消煮管中，用HNO3∶H2O2=3∶1在MARS 240/50 微波消解儀中消解，待完全消解后，蒸發(fā)去酸，用雙蒸水定容至50 mL。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Perkin Elmer Optima 2100DV, USA)測(cè)定Cu含量，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

1.3.4 光合參數(shù)測(cè)定

光合參數(shù)于2012年11月上旬進(jìn)行測(cè)定，選擇晴朗的天氣，利用Li- 6400XT便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)(Li-Cor, USA)測(cè)定海州香薷葉片的光合指標(biāo)，從8:00—16:00每2 h測(cè)定1次。每個(gè)處理隨機(jī)選取3框，每框測(cè)定3株，每株取從上往下的第3對(duì)功能葉，取平均值，共3個(gè)重復(fù)。測(cè)定時(shí)選取長(zhǎng)勢(shì)相近的健康植株和充分伸展、無(wú)病蟲(chóng)害的健康葉。測(cè)定參數(shù)包括：凈光合速率(Pn, μmol m-2s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs, mmol m-2s-1)、胞間CO2濃度(Ci, μmol/mol)、蒸騰速率(Tr, mmol m-2s-1)等。

利用Li- 6400XT便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定植株的光合-光響應(yīng)曲線。每個(gè)處理隨機(jī)選取3框，每框測(cè)定3株，取平均值，共3個(gè)重復(fù)。使用人工光源進(jìn)行光誘導(dǎo)和光響應(yīng)測(cè)定，誘導(dǎo)光強(qiáng)約為2000 μmol m-2s-1，誘導(dǎo)時(shí)間約為15—30 min。光響應(yīng)測(cè)定條件控制：設(shè)置葉室溫度為25 ℃，以小鋼瓶?jī)?nèi)液態(tài)CO2為氣源，設(shè)置CO2濃度條件為400 μmol/mol，相對(duì)濕度為60%—70%。測(cè)定時(shí)設(shè)置光強(qiáng)梯度由高到低為2000、1500、1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、20和0 μmol m-2s-1。

利用Li- 6400XT便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)的紅藍(lán)光源設(shè)定葉室中以接近葉片飽和光強(qiáng)為測(cè)定光強(qiáng)1500 μmol m-2s-1，控制條件與光響應(yīng)相同，以小鋼瓶?jī)?nèi)液態(tài)CO2為氣源，設(shè)置CO2濃度梯度從1500、1200、1000、800、600、400、200、150、120、100、80、50 μmol/mol，每個(gè)CO2梯度最大等待時(shí)間為300 s。每個(gè)處理選取3框，每框測(cè)定3株，取平均值，共3個(gè)重復(fù)。由于海州香薷葉片較小不能完全填滿(mǎn)葉室，用掃描儀(Epson 1680)與分析軟件(WinFOLIA葉片分析系統(tǒng))測(cè)量出葉片的實(shí)際面積，然后將實(shí)測(cè)葉面積手動(dòng)輸入光合軟件重新計(jì)算獲得光合參數(shù)特征值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

光合-光響應(yīng)曲線采用新型的指數(shù)方程擬合[27]，表達(dá)式如下：

式中α、β、γ為3個(gè)與光強(qiáng)無(wú)關(guān)的系數(shù)；P(I)為凈光合速率，I為光合有效輻射(μmol m-2s-1)，Ic為光補(bǔ)償點(diǎn)(μmol m-2s-1)。通過(guò)該模型利用SPSS非線性回歸，得到相應(yīng)預(yù)測(cè)值Pv，繪制PAR-Pv曲線，計(jì)算出最大凈光合速率(Pnmax, μmol m-2s-1)、表觀量子效率(AQY, μmol/mol)、光飽和點(diǎn)(LSP, μmol m-2s-1)、光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP, μmol m-2s-1)及暗呼吸速率(Rd, μmol m-2s-1)等光合參數(shù)。

光合-CO2響應(yīng)曲線根據(jù)非直角曲線模型擬合，同時(shí)用Photosyn Assistant 1.1.2軟件對(duì)CO2響應(yīng)曲線進(jìn)行生化模型擬合，根據(jù)Farquhar等[28]、Long和Bernacchi[29]修正后生化模型，計(jì)算得到最大羧化速率(Vcmax, μmol m-2s-1)、最大電子傳遞速率(Jmax, μmol m-2s-1)、磷酸丙糖利用率(TPU, μmol m-2s-1)。

用SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較分析4個(gè)處理之間單因子對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的差異。用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)檢驗(yàn)添加Cu和接種土壤微生物的交互作用對(duì)海州香薷各參數(shù)的差異顯著性，顯著性檢驗(yàn)水平均設(shè)置為0.05。采用Excell和Origin 7.5對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析2.1 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷生長(zhǎng)的影響

Cu脅迫顯著抑制了海州香薷植株的生長(zhǎng)(圖1)。與對(duì)照相比，Cu脅迫處理顯著降低了植株的株數(shù)、株高和基徑，分別減少了31.5%、18.1%、12.5%。接種土壤微生物顯著提高了海州香薷的株數(shù)和株高，與對(duì)照相比分別增加了16.4%、13.5%，但對(duì)基徑的影響不顯著。與Cu脅迫相比，脅迫下接種土壤微生物顯著提高了植株的株數(shù)和株高，分別增加了20%、16.4%。

雙因素方差分析結(jié)果表明，Cu脅迫處理對(duì)海州香薷的株數(shù)(F=153.600,P<0.001)、株高(F=24.724,P=0.001)和基徑(F=7.680,P=0.024)的影響均達(dá)極顯著水平，接種土壤微生物處理僅對(duì)株高(F=13.729,P=0.006)和株數(shù)(F=32.670,P<0.001)有極顯著性影響，Cu脅迫和接種土壤微生物的交互作用對(duì)各指標(biāo)均無(wú)顯著影響。

圖1 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷生長(zhǎng)的影響

2.2 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷生物量的影響

不同處理對(duì)海州香薷影響的生物量指標(biāo)見(jiàn)表2。Cu脅迫處理顯著降低了植株的根、莖、花序生物量、單株生物量、總生物量以及莖重比，與對(duì)照相比分別下降了33.0%、38.5%、34.1%、20.5%、36.5%和9.6%。接種土壤微生物使植株的根、莖、花序生物量、單株生物量、總生物量、莖重比較對(duì)照分別增加了22.1%、40.8%、11.4%、11.6%、31.7%和7.0%。而接種土壤微生物使Cu脅迫下植株的根、莖、花序生物量、單株生物量、總生物量、莖重比相對(duì)脅迫下顯著增加，分別提高了32.2%、38.1%、39.9%、16.7%、37.1%和6.7%。

雙因素方差分析結(jié)果表明，Cu脅迫處理、接種土壤微生物處理對(duì)植株的根、莖、花序生物量、單株生物量、總生物量、莖重比均有極顯著性影響，而對(duì)根重比沒(méi)有顯著性影響。接種土壤微生物和Cu脅迫交互作用對(duì)各個(gè)生物量指標(biāo)均未達(dá)顯著水平。

表2 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷生物量的影響Table 2 Effects of soil microbe inoculation on the biomass of E. splendens under copper stress

2.3 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷體內(nèi)Cu含量分布的影響

由表3可知，海州香薷各部位的Cu含量分布差異變化幅度較大。添加Cu處理中，植物Cu含量在器官含量分別為：根>葉>莖>花序；而在未添加Cu處理中，海州香薷地上部Cu含量均處于正常植物Cu含量范圍內(nèi)(5—20 mg/kg)。與對(duì)照相比，Cu脅迫下海州香薷植株各部位的Cu含量均顯著增加，其中根、葉、莖、種子分別提高了31.5倍、30.6倍、7.0倍、14.0倍。與對(duì)照相比，接種土壤微生物對(duì)海州香薷各部分差異不顯著。接種土壤微生物顯著降低了植株地上部分Cu含量，葉和莖Cu含量分別比Cu脅迫處理降低了50.3%、35.1%，而其對(duì)根部含量的差異不顯著。

雙因素方差分析結(jié)果表明，Cu脅迫處理對(duì)植株各個(gè)器官Cu含量分布均有極顯著性影響，接種土壤微生物處理對(duì)植株的莖和葉達(dá)到極顯著水平，而Cu脅迫和接種土壤微生物交互作用對(duì)海州香薷的根、莖、葉也有顯著性影響。

表3 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷體內(nèi)Cu含量分布的影響Table 3 Effects of soil microbe inoculation on heavy metal contents of E. splendens under copper stress

2.4 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合作用參數(shù)的影響

由圖2可看出，不同處理海州香薷的凈光合速率(Pn)日變化均呈“單峰型”曲線，且峰值均出現(xiàn)在12:00左右，分別為6.19、4.37、3.80、3.03 μmol m-2s-1。添加Cu處理，在各時(shí)間段植株的Pn均顯著低于對(duì)照；除16:00外，其它時(shí)間段接種土壤微生物的Pn均顯著高于對(duì)照。各處理之間植株的日均Pn值表現(xiàn)為SM>CK>Cu+SM>Cu。雙因素方差分析結(jié)果表明，接種土壤微生物以及添加Cu處理對(duì)植株的日均Pn作用均極顯著，但兩者的交互作用未達(dá)到顯著影響。

圖2 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)日變化的影響

海州香薷的氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)的日變化曲線與其Pn日變化基本相似，呈“單峰型”，且峰值均出現(xiàn)在12:00左右(圖2)。單一接種土壤微生物后，植株的Gs和Tr在各個(gè)時(shí)間段顯著高于其它3個(gè)處理。各處理之間植株的日均Gs值大小順序?yàn)镾M>CK>Cu>Cu+SM，而日均Tr為SM>CK>Cu+SM>Cu。雙因素方差分析結(jié)果表明，接種土壤微生物以及添加Cu處理對(duì)植株的日均Gs和日均Tr均達(dá)到極顯著影響，且兩者的交互作用均作用極顯著。

各個(gè)處理的海州香薷胞間CO2濃度(Ci)日變化見(jiàn)圖2，其變化規(guī)律與Pn日變化相反，呈“V型”曲線。添加Cu處理的Ci在各個(gè)時(shí)間段均顯著高于對(duì)照。各處理之間植株的日均Ci值表現(xiàn)為Cu>SM>Cu+SM>CK。雙因素方差分析結(jié)果表明，接種土壤微生物以及添加Cu處理對(duì)植株的日均Ci均作用顯著，且兩者的交互作用也達(dá)到極顯著影響。

2.5 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合-光響應(yīng)參數(shù)的影響

從海州香薷葉片光合-光響應(yīng)曲線可以看出(圖3)，總體上各處理之間曲線變化很相似。隨著光合有效輻射的增強(qiáng)，Pn均呈先增加后趨向穩(wěn)定。

表5為不同處理下海州香薷光合-光響應(yīng)特征值。Cu脅迫下海州香薷最大凈光合速率(Pnmax)、光飽和點(diǎn)(LSP)、表觀量子效率(AQY)、暗呼吸速率(Rd)分別比對(duì)照下降了57.0%、7.0%、30.6%、18.7%，而光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)提高了16.1%。而接種土壤微生物條件下Pnmax、LSP、AQY、Rd均有不同程度的提高，與對(duì)照相比分別增加了2.8%、19.9%、41.9%、11.1%，而LCP則減少了22.5%。與Cu脅迫相比，脅迫下接種土壤微生物使植株的Pnmax、AQY顯著增加，分別提高了84.7%、31.7%，而LCP則下降26.6%，差異顯著。

表4 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合作用參數(shù)日均值的影響Table 4 Effects of soil microbe inoculation on the daily mean value of photosynthetic parameters of E. splendens under copper stress

表5 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合-光響應(yīng)特征參數(shù)的影響Table 5 Effects of soil microbe inoculation on the light response parameters of E. splendens under copper stress

雙因素方差分析結(jié)果表明，Cu脅迫、接種土壤微生物處理對(duì)海州香薷光合-光響應(yīng)指標(biāo)均影響顯著，而Cu脅迫和接種土壤微生物交互作用僅對(duì)Pnmax、LSP影響顯著。

2.6 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合- CO2響應(yīng)參數(shù)的影響

海州香薷葉片的光合- CO2響應(yīng)如圖4所示，植物葉片的Pn均隨著胞間CO2濃度的增加而增加。0—200 μmol/mol范圍內(nèi)，4種處理下植株葉片的Pn上升的幅度較小，隨著胞間CO2濃度的增加，Pn增加速度上升，幾乎呈線性增長(zhǎng)。當(dāng)達(dá)到CO2飽和點(diǎn)后，Pn開(kāi)始趨于穩(wěn)定。當(dāng)CO2濃度大于200 μmol/mol時(shí)，Pn曲線的大小順序?yàn)椋篠M>CK>Cu+SM>Cu。

Cu脅迫處理顯著降低了植株的CO2響應(yīng)參數(shù)，與對(duì)照相比最大羧化速率(Vcmax)、最大電子傳遞速率(Jmax)、磷酸丙糖利用率(TPU)分別減少了49.9%、46.5%、41.5%。接種土壤微生物使植株的Vcmax、Jmax、TPU較對(duì)照分別增加了18.5%、17.6%、19.5%。與Cu脅迫相比，脅迫下接種土壤微生物顯著提高了植株的Vcmax、Jmax、TPU，分別增加了47.7%、46.6%、48.3%。

Cu脅迫處理、接種土壤微生物處理對(duì)海州香薷光合-CO2響應(yīng)指標(biāo)均影響極顯著，而Cu脅迫和接種土壤微生物交互作用各個(gè)指標(biāo)均未達(dá)到顯著影響。

圖3 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合-光響應(yīng)曲線的影響

圖4 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合-CO2響應(yīng)曲線的影響Fig.4 Effects of soil microbe inoculation on the net photosynthetic rate-intercellular CO2 concentration curves of E. splendens under copper stress圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05, n=3)

表6 接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下海州香薷光合-CO2響應(yīng)參數(shù)的影響Table 6 Effects of soil microbe inoculation on the CO2 response parameters of E. splendens under copper stress

3 討論

在環(huán)境脅迫下，植物會(huì)通過(guò)改變其形態(tài)和生理特性以及生活史對(duì)策來(lái)適應(yīng)環(huán)境的資源限制[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同處理對(duì)海州香薷的生物量有較大的影響，Cu脅迫下海州香薷株高、基徑、株數(shù)、生物量均顯著低于對(duì)照，但根生物量的減小程度低于莖生物量，根重比略有增加，這可能是重金屬影響了植物對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收，作為補(bǔ)償植株根系獲得較多的生長(zhǎng)，根重比的增加可以在根系中積累相對(duì)較多的重金屬，有助于緩解對(duì)地上部分的毒害作用[24]。接種土壤微生物對(duì)Cu脅迫下植株的株高、株數(shù)和各器官生物量均有促進(jìn)作用，有效地緩解了Cu脅迫導(dǎo)致的植株莖、根生物量的下降程度，莖重比增加較快。說(shuō)明Cu脅迫下海州香薷接種土壤微生物后植物根際微環(huán)境發(fā)生改變，提高了植株的存活率，有利于海州香薷光合產(chǎn)物的積累，促進(jìn)了莖、根的生長(zhǎng)，其中對(duì)莖的促生作用更大。

當(dāng)Cu在植物體內(nèi)達(dá)到一定程度時(shí)，它會(huì)破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)與功能，使光合色素降解，影響光合作用電子傳遞鏈和PSⅡ光反應(yīng)，導(dǎo)致光合器官結(jié)構(gòu)受損以及光合作用系統(tǒng)等生理生化過(guò)程發(fā)生紊亂，最終使植物光合產(chǎn)物減少、生長(zhǎng)受到限制[31- 32]。Cambrollé等[33]對(duì)Cu耐受性植物L(fēng)imoniastrummonopetalum研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的Cu濃度顯著降低了凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)和葉綠素含量，并對(duì)光系統(tǒng)光產(chǎn)生了不可恢復(fù)的損傷，但對(duì)胞間CO2濃度(Ci)沒(méi)有顯著影響。朱光燦等[34]研究結(jié)果表明，低溫脅迫下接種叢枝菌根真菌使玉米(Zeamays)葉片的Pn、蒸騰速率(Tr)、Gs顯著增強(qiáng)，而Ci低于非菌根植株。本研究中，海州香薷有著相似的光合生理響應(yīng)，與Cu脅迫相比，脅迫下接種土壤微生物顯著提高了海州香薷日均Pn的和日均Tr，而日均Gs、日均Ci則下降。因?yàn)楣夂献饔檬敲复俜磻?yīng)，Cu在葉肉細(xì)胞過(guò)量的積累會(huì)導(dǎo)致參與光合作用的相關(guān)酶活性降低，降低了葉肉細(xì)胞的光合能力，使CO2的同化利用率降低。接種土壤微生物后，降低了植株對(duì)Cu的吸收和向地上部位轉(zhuǎn)運(yùn)，使根系細(xì)胞壁上固定的Cu含量下降，同時(shí)減少了地上部位Cu含量，從而減輕過(guò)多Cu對(duì)胞質(zhì)生理生化代謝傷害，使得葉肉細(xì)胞的光合能力有一定提高，即內(nèi)部Rubisco酶活性和光合構(gòu)件等非氣孔因素的改善，有利于胞間CO2原料的利用，使植株的光合速率加快。

光飽和點(diǎn)(LSP)與光補(bǔ)償點(diǎn)(LCP)是反映植物對(duì)強(qiáng)光和弱光利用能力的指標(biāo)。一般植物的LSP與LCP均較低是典型的陰性植物，反之為陽(yáng)性植物[35]。非脅迫條件下海州香薷的LSP大于1500 μmol m-2s-1，為陽(yáng)性植物。Cu脅迫往往能降低植物的最大凈光合速率(Pnmax)、LSP，增加LCP[36]。Shi等[37]甜菜(Betavulgaris)的生長(zhǎng)和光合效率研究發(fā)現(xiàn)，接種Acinetobacterjohnsonii細(xì)菌可有效促進(jìn)植株LSP、表觀量子效率(AQY)的提高，且LCP顯著降低。本研究中，單一接種土壤微生物處理顯著增加了海州香薷的LSP，而Cu脅迫下接種土壤微生物使LCP顯著下降。說(shuō)明接種土壤微生物使得海州香薷對(duì)光能利用范圍變寬，增加了其對(duì)光環(huán)境的適應(yīng)能力，尤其是Cu脅迫下植株對(duì)弱光利用的能力提高，從而增加了葉片對(duì)光能利用率以及Pn。AQY反映了植物光合作用對(duì)光的利用效率[38]，4個(gè)處理中Cu脅迫下植株的AQY顯著低于對(duì)照，而接種土壤微生物顯著提高了脅迫下海州香薷的AQY，表明接種土壤微生物條件下，海州香薷捕獲光量子用于光合器官的能力得到了提高。且Cu脅迫下接種土壤微生物植株的Pnmax顯著增加，而暗呼吸速率(Rd)卻偏低，這時(shí)植株產(chǎn)生的光合產(chǎn)物較高，而對(duì)光合產(chǎn)物消耗較低，有助于植株在不利環(huán)境條件下更多的物質(zhì)積累。說(shuō)明土壤微生物通過(guò)提高Pnmax、AQY和降低LCP等途徑來(lái)改善海州香薷的光合作用，使植株在脅迫條件下的光合能力得到提升。

CO2是植物進(jìn)行光合作用的基本底物，其濃度大小影響著植物的光合速率。最大羧化效率(Vcmax)的大小主要受到核酮糖- 1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的活性、數(shù)量的影響,而Rubisco是植物光合作用固定CO2的關(guān)鍵調(diào)控酶，反映了植物對(duì)CO2的利用能力[39]。最大電子傳遞速率(Jmax)為RuBP再生的電子傳遞速率，代表著RuBP再生能力。對(duì)高丹草(Sorghum×S.sudanes)和紫花苜蓿(Medicagosativa)不同濃度Cu處理的水培試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cu脅迫導(dǎo)致Gs、Vcmax、Jmax、磷酸丙糖利用率(TPU)值的下降，最終導(dǎo)致凈光合速率降低[40]。本實(shí)驗(yàn)中，Cu脅迫處理，海州香薷葉片的Vcmax、Jmax、TPU值顯著降低，但脅迫下接種土壤微生物顯著增加了植株Vcmax、Jmax、TPU值。說(shuō)明植株在光合作用過(guò)程中催化RuBP固定CO2的Rubisco的活性和數(shù)量明顯增加，較高的電子傳遞速率促進(jìn)了光合磷酸化作用和NADPH的合成，從而使RuBP再生能力得到了提高，這些特性有利于它們充分利用光能進(jìn)行碳同化。

綜上所述，在Cu脅迫下海州香薷植株的生長(zhǎng)、生物量均受到了一定程度的抑制。接種土壤微生物有效緩解了Cu脅迫對(duì)海州香薷植株的抑制作用，可通過(guò)提高植株的存活率，降低光補(bǔ)償點(diǎn)和增加表觀量子效率、最大羧化速率、最大電子傳遞速率、磷酸丙糖利用率，從而減輕Cu對(duì)胞質(zhì)生理生化代謝過(guò)程的傷害，提高植株的光合能力，促進(jìn)植株的株高的生長(zhǎng)，最終提高海州香薷耐受Cu脅迫的能力。

[1] Li J M, Jin Z X, Gu Q P. Effect of plant species on the function and structure of the bacterial community in the rhizosphere of lead-zinc mine tailings in Zhejiang, China. Canadian Journal of Microbiology, 2011, 57(7): 569- 577.

[2] 沈章軍, 孫慶業(yè), 田勝尼. 銅尾礦自然定居白茅對(duì)體內(nèi)氮磷的適時(shí)分配及葉片氮磷代謝調(diào)節(jié)酶活性動(dòng)態(tài). 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 36(2): 159- 168.

[3] Kovácˇik J, Klejdus B, Hedbavny′ J, Bacˇkor M. Effect of copper and salicylic acid on phenolic metabolites and free amino acids inScenedesmusquadricauda(Chlorophyceae). Plant Science, 2010, 178(3): 307- 311.

[4] Brun L A, Le Corff J, Maillet J. Effects of elevated soil copper on phenology, growth and reproduction of five ruderal plant species. Environmental Pollution, 2003, 122(3): 361- 368.

[5] Vinit-Dunand F, Epron D, Alaoui-Sossé B, Badot P M. Effects of copper on growth and on photosynthesis of mature and expanding leaves in cucumber plants. Plant Science, 2002, 163(1): 53- 58.

[6] Bhakuni G, Dube B K, Sinha P, Chatterjee C. Copper stress affects metabolism and reproductive yield of chickpea. Journal of Plant Nutrition, 2009, 32(4): 703- 711.

[7] Lombardi L, Sebastiani L. Copper toxicity inPrunuscerasifera: growth and antioxidant enzymes responses ofinvitrogrown plants. Plant Science, 2005, 168(3): 797- 802.

[8] Andre C M, Larondelle Y, Evers D. Dietary antioxidants and oxidative stress from a human and plant perspective: a review. Current Nutrition and Food Science, 2010, 6(1): 2- 12.

[9] Lambers H, Mougel C, Jaillard B, Hinsinger P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: an evolutionary perspective. Plant and Soil, 2009, 321(1/2): 83- 115.

[10] Rodriguez R J, Henson J, Van Volkenburgh E, Hoy M, Wright L, Beckwith F, Kim Y O, Redman R S. Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis. The ISME Journal, 2008, 2(4): 404- 416.

[11] Lau J A, Lennon J T. Evolutionary ecology of plant-microbe interactions: soil microbial structure alters selection on plant traits. New Phytologist, 2010, 192(1): 215- 224.

[12] Khan A G. Role of soil microbes in the rhizospheres of plants growing on trace metal contaminated soils in phytoremediation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2005, 18(4): 355- 364.

[13] Hyatt L A, Rosenberg M S, Howard T G, Bole G, Fang W, Anastasia J, Brown K, Grella R, Hinman K, Krkudziel J P, Gurevitch J. The distance dependence prediction of the Janzen-Connell hypothesis: a meta-analysis. Oikos, 2003, 103(3): 590- 602.

[14] Hallberg K B, Johnson D B. Microbiology of a wetland ecosystem constructed to remediate mine drainage from a heavy metal mine. Science of the Total Environment, 2005, 338(1/2): 53- 66.

[15] Burd G I, Dixon D G, Glick B R. Plant growth-promoting bacteria that decrease heavy metal toxicity in plants. Canadian Journal of Microbiology, 2000, 46(3): 237- 245.

[16] Patten C L, Glick B R. Role ofPseudomonasputidaindoleacetic acid in development of the host plant root system. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(8): 3795- 3801.

[17] 羅巧玉, 王曉娟, 林雙雙, 李媛媛, 孫莉, 金樑. AM真菌對(duì)重金屬污染土壤生物修復(fù)的應(yīng)用與機(jī)理. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 33(13): 3898- 3906.

[18] Wang F Y, Lin X G, Yin R, Wu L H. Effects of arbuscular mycorrhizal inoculation on the growth ofElsholtziasplendensandZeamaysand the activities of phosphatase and urease in a multi-metal-contaminated soil under unsterilized conditions. Applied Soil Ecology, 2006, 31(1/2): 110- 119.

[19] Glick B R, Cheng Z Y, Czarny J, Duan J. Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria. European Journal of Plant Pathology, 2007, 119(3): 329- 339.

[20] Qian M, Li X D, Shen Z G. Adaptive copper tolerance inElsholtziahaichowensisinvolves production of Cu-induced thiol peptides. Plant Growth Regulation, 2005, 47(1): 65- 73.

[21] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志. 北京: 科學(xué)出版社, 1977, 66: 342- 343.

[22] Ke W S, Xiong Z T, Chen S J, Wang Z H. Differences of Cu accumulation and Cu-induced ATPase activity in roots of two populations ofElsholtziahaichowensisSun. Environmental Toxicology, 2008, 23(2): 193- 199.

[23] Yang R Y, Zan S T, Tang J J, Chen X, Zhang Q. Variation in community structure of arbuscular mycorrhizal fungi associated with a Cu tolerant plant-Elsholtziasplendens. Applied Soil Ecology, 2010, 44(3): 191- 197.

[24] 駱永明. 重金屬污染土壤的香薷植物修復(fù)研究. 北京: 科學(xué)出版社, 2012: 14- 99.

[25] Nie M, Wang Y J, Yu J Y, Xiao M, Jiang L F, Yang J, Fang C M, Chen J K, Li B. Understanding plant-microbe interactions for phytoremediation of petroleum-polluted soil. PLoS One, 2011, 6(3): 17961.

[26] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社, 1999: 24- 214.

[27] Ye Z P. A new model for relationship between irradiance and the rate of photosynthesis inOryzasativa. Photosynthetica, 2007, 45(4): 637- 640.

[28] Farquhar G D, von Caemmerer S, Berry J A. A biochemical model of photosynthetic CO2assimilation in leaves of C3species. Planta, 1980, 149(1): 78- 90.

[29] Long S P, Bernacchi C J. Gas exchange measurements, what can they tell us about the underlying limitations to photosynthesis? Procedures and sources of error. Journal of Experimental Botany, 2003, 54(392): 2393- 2401.

[30] Coomes D A, Grubb P J. Colonization, tolerance, competition and seed-size variation within functional groups. Trends in Ecology and Evolution, 2003, 18(6): 283- 291.

[31] Mallick N, Mohn F H. Use of chlorophyll fluorescence in metal-stress research: a case study with the green microalgaScenedesmus. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2003, 55(1): 64- 69.

[32] Perales-Vela H V, González-Moreno S, Montes-Horcasitas C, Caňizares-Villanueva R O. Growth, photosynthetic and respiratory responses to sub-lethal copper concentrations inScenedesmusincrassatulus(Chlorophyceae). Chemosphere, 2007, 67(11): 2274- 2281.

[33] Cambrollé J, Mancilla-Leytón J M, Muoz-Vallés S, Figueroa-Luque E, Luque T, Figueroa M E. Effects of copper sulfate on growth and physiological responses ofLimoniastrummonopetalum. Environmental Science and Pollution Research International, 2013, 20(12): pp8839- 8847.

[34] 朱先燦, 宋鳳斌, 徐洪文. 低溫脅迫下叢枝菌根真菌對(duì)玉米光合特性的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 21(2): 470- 475.

[35] 蔣高明, 常杰, 高玉葆, 李永庚. 植物生理生態(tài)學(xué). 北京: 高等教育出版社, 2004: 65- 66.

[36] 朱喜峰, 鄒定輝, 簡(jiǎn)建波, 陳偉洲, 劉慧慧, 杜虹. 龍須菜對(duì)重金屬銅脅迫的生理響應(yīng). 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 20(6): 1438- 1444.

[37] Shi Y W, Luo K, Li C. Growth and photosynthetic efficiency promotion of sugar beet (BetavulgarisL.) by endophytic bacteria. Photosynthesis Research, 2010, 105(1): 5- 13.

[38] 徐興利, 金則新, 何維明, 王興龍, 車(chē)秀霞. 不同增溫處理對(duì)夏蠟梅光合特性和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 32(20): 6343- 6353.

[39] Ichikawa K, Miyake C, Iwano M, Sekine M, Shinmyo A, Kato K. Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit translation is regulated in a small subunit-independent manner in the expanded leaves of tobacco. Plant and Cell Physiology, 2008, 49(2): 214- 225.

[40] 王瑞剛, 唐世榮, 郭軍康, 趙玉杰, 宋正國(guó). 銅脅迫對(duì)高丹草和紫花苜蓿生長(zhǎng)和光合特性的影響. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2010, 19(12): 2922- 2928.

Effects of soil microbe inoculation on the growth and photosynthetic physiology ofElsholtziasplendensunder copper stress

LI Yueling1, 2, JIN Zexin2,*, LI Junmin2, GUO Sumin2, 3, GUAN Ming2

1SchoolofLifeandEnvironmentScience,ShanghaiNormalUniversity,Shanghai200234,China2InstituteofEcology,TaizhouUniversity,Taizhou318000,China3SchoolofLifeSciences,ShanxiNormalUniversity,Linfen041004,China

Phytoremediation, an emerging cost effective and ecologically benign technology for the decontamination of soils, is the use of plants and their associated microbes for environmental cleanup. The efficiency of phytoremediation depends mostly on the establishment of robust plant-microbe interactions.Elsholtziasplendensis a Labiatae plant well known for its high copper tolerance, which is widely distributed on copper deposits as well as non-contaminated areas. It has been considered for the phytoremediation of copper polluted soils; however, little is known about the role of the soil microbe community in the roots ofE.splendensin adapting the non-contaminated plants to copper stress. In order to evaluate the effects of inoculation with soil microbes on the copper tolerance ofE.splendens, this experiment studied the effect of inoculation with soil microbes on the seedling dry weight, plant morphology, survival rate, copper content and leaf gas exchange parameters ofE.splendensunder copper stress using a mesocosm system. The experiment included four soil treatments: the addition of copper (copper stress); soil microbe inoculation; addition of copper and soil microbe inoculation; and no additional copper or soil microbe inoculation (control). The results were as follows: (1) The plant number, plant height, basal diameter, biomass, and stem weight ratio ofE.splendensunder copper stress were lower than in the control. Inoculation with soil microbes significantly increased the plant number, plant height, biomass, and stem weight ratio ofE.splendensunder copper stress, indicating an alleviation effect on the inhibition of copper on the growth ofE.splendens. Compared with the control, the copper content of roots, stems, leaves, inflorescences and seeds were increased under copper stress. Under copper stress, soil microbe inoculation significantly decreased copper content in the stem and leaf organs ofE.splendens, but did not markedly affect copper content in the other organs. (2) In autumn, the diurnal variation in net photosynthetic rate (Pn) in the leaves ofE.splendensunder all treatments took on a one-peak curve. Inoculation with soil microbes significantly increased the daily meanPnand daily mean transpiration rate (Tr), and significantly decreased the daily mean stomatal conductance and daily mean intercellular CO2concentration (Ci) ofE.splendensunder copper stress. (3) Under copper stress, the maximum net photosynthetic rate (Pnmax), light saturation point (LSP), apparent quantum yield (AQY), maximum rate of carboxylation (Vcmax), maximum rate of electron transport (Jmax) and the triose phosphate use rate (TPU) ofE.splendenssignificantly decreased, while the light compensation point (LCP) significantly increased. Inoculation with soil microbes significantly increased thePnmax, LSP, AQY,Vcmax,Jmaxand TPU, but decreased the LCP. In conclusion, inoculation with soil microbes can effectively alleviate the damage of copper stress toE.splendensby increasing the photosynthetic ability, enhancing the light energy utilization and carbon assimilation and promoting the accumulation of organic matter. Inoculation with soil microbes can increase the growth of plants under copper stress, which could have potential applications in the phytoremediation of soils contaminated with heavy metals.

Elsholtziasplendens; soil microbe; copper stress; growth; photosynthetic physiology

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY12C03002)

2013- 08- 21;

2014- 07- 02

10.5846/stxb201308212125

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jzx@tzc.edu.cn

李月靈, 金則新, 李鈞敏, 郭素民, 管銘.接種土壤微生物對(duì)銅脅迫下海州香薷生長(zhǎng)及光合生理的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(12):3926- 3937.

Li Y L, Jin Z X, Li J M, Guo S M, Guan M.Effects of soil microbe inoculation on the growth and photosynthetic physiology ofElsholtziasplendensunder copper stress.Acta Ecologica Sinica,2015,35(12):3926- 3937.