謝海霞等

摘 要 對(duì)海南島南部三亞、瓊海、陵水等南繁水稻產(chǎn)區(qū)市縣的病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)根據(jù)國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的10種主要水稻病毒設(shè)計(jì)特異PCR檢測(cè)引物，對(duì)23個(gè)疑似水稻病毒樣品進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明：海南南繁區(qū)水稻病毒病主要有2種，即由南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病和由水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）引起的水稻齒葉矮縮??；經(jīng)分子檢測(cè)鑒定了6例南方水稻黑條矮縮病樣品和14例水稻齒葉矮縮病樣品，檢出2個(gè)交叉復(fù)合感染的樣品，2種病樣的檢出率分別為 26.09%和60.87%，其余8種水稻病毒均未檢測(cè)到。研究結(jié)果表明，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁水稻種植區(qū)域需重點(diǎn)防治的病害對(duì)象。

關(guān)鍵詞 南繁 ；水稻 ；黑條矮縮病 ；齒葉矮縮病 ；分子鑒定

分類號(hào) S435.111.1

Abstract Circumstance of rice virus disease in southern Hainan island rice-planting areas including Sanya， Qionghai and Lingshui was investigated. Specific primers for 10 known rice virus species were designed for PCR tests. A total of 23 suspected virus-infected samples were tested. Molecular identification results showed that there were two major rice virus species existed in Hainan winter-breeding areas： southern rice black-streaked dwarf virus （SRBSDV） and rice ragged stunt virus （RRSV）. 6 SRBSDV-infected samples and 14 RRSV-infected samples were identified by PCR and sequencing methods. 2 samples were co-infected by both SRBSDV and RRSV. Infection rates of SRBSDV and RRSV were 26.09% and 60.87%， separately. The other 8 viruses were not detected. This study showed that SRBSDV and RRSV are key diseases in Hainan winter-breeding areas and should be carefully prevented.

Keywords Hainan winter-breeding areas ； rice ； SRBSDV ； RRSV ； molecular identification

中國(guó)已發(fā)現(xiàn)的水稻RNA病毒約有10種[1]，包括水稻黑條矮縮病毒（rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）、南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）、水稻瘤矮病毒（rice gall dwarf virus，RGDV）、水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）、水稻矮縮病毒（rice dwarf virus，RDV）、水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV）、水稻草矮病毒（rice grassy stunt virus，RGSV）、水稻東格魯球狀病毒（rice tungro spherical virus，RTSV）、水稻黃矮病毒（rice yellow stunt virus，RYSV）和水稻黃斑駁病毒（rice yellow mottle virus，RYMV）。由水稻病毒引起的水稻病毒病已成為影響水稻生產(chǎn)的主要病害。20世紀(jì)50年代水稻黑條矮縮病首次在中國(guó)被報(bào)道，90年代后在中國(guó)南方水稻產(chǎn)區(qū)流行，近年來(lái)呈逐年加重的趨勢(shì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。其中，南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）是在廣東、海南等地新發(fā)現(xiàn)的一種水稻病毒，主要由白背飛虱（Sogatellafurcifera）以持久性方式傳播[5-6]。此外，水稻齒葉矮縮病毒（rice ragged stunt virus，RRSV）是危害水稻生產(chǎn)的一種世界性病害，在中國(guó)、日本、菲律賓和東南亞地區(qū)都有報(bào)道。

南繁是指每年9月至次年5月在海南省南部的三亞、樂(lè)東、陵水等地從事農(nóng)作物品種選育、種子生產(chǎn)和種質(zhì)鑒定等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)有30個(gè)?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）的550多家單位近5 000名科技人員云集于海南南繁區(qū)域開展育種工作。南繁育種區(qū)域聚集了豐富的水稻種質(zhì)資源，為水稻品種選育提供了優(yōu)良的育種材料，已成為中國(guó)水稻育制種的“綠色基因庫(kù)”[7]。然而，由于南繁區(qū)水稻育種材料的匯聚和擴(kuò)散，南繁區(qū)域也極易于成為水稻病毒病害傳播和擴(kuò)散的源頭，對(duì)南繁水稻種業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了潛在的威脅。但目前尚未見(jiàn)關(guān)于南繁區(qū)水稻病毒病害的報(bào)道。鑒于此，本研究調(diào)查和鑒定了海南省三亞、陵水、瓊海等水稻種植區(qū)域的病毒為害情況，為防治和控制南繁區(qū)水稻病毒的為害和傳播提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2014年1月，在海南島南繁區(qū)域（包括三亞、陵水、瓊海等縣市水稻產(chǎn)區(qū)）共采集23份水稻疑似病毒病害樣品（表1），每份樣品采集水稻葉片3～5片，編號(hào)和記錄后置于冰袋中保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道獲得水稻病毒PCR檢測(cè)引物信息（表2），或通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢獲得水稻病毒的mRNA序列信息，利用Primer3軟件（http：//primer3.ut.ee/），采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)計(jì)獲得PCR檢測(cè)引物序列（表2）。

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Plant RNA Extraction kit試劑盒（TianGen Biotech）提取水稻葉片總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA的完整性，用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermantas）將總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用作PCR反應(yīng)的模板。

1.2.3 PCR檢測(cè)

分別用表2中的引物對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：模板cDNA 1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，Ex-Taq 0.25 μL，10× Buffer 2 μL，10 mmol/L 正反引物各0.5 μL，加ddH2O至總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s， 50℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，取8 μL產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 克隆轉(zhuǎn)化

采用DNA回收試劑盒（Sangon）回收PCR產(chǎn)物，將其連接到pMD18-T載體上，12 h后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；12～16 h后，挑取平板上的單菌落接種于含有0.1%氨芐的LB培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)8 h，然后使用克隆載體通用引物M13-47和RV-M進(jìn)行菌液PCR；反應(yīng)結(jié)束后取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；挑取陽(yáng)性克隆送上海Sangon公司測(cè)序。

1.2.5 序列測(cè)定和同源性比較

將測(cè)序結(jié)果去除低質(zhì)量序列和污染序列后，登錄GenBank進(jìn)行BLASTn比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.

cgi），通過(guò)序列相似性比較，判斷來(lái)源病毒物種名稱。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻總RNA的提取

經(jīng)提取獲得23個(gè)水稻葉片樣品的總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA主要集中于100、750、1 500 bp 三個(gè)條帶長(zhǎng)度，RNA質(zhì)量較好（OD260/OD280≈2.0），符合RT-PCR試驗(yàn)的要求（圖1）。

2.2 RT-PCR檢測(cè)

獲得樣品總RNA后，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用所獲得的PCR引物（表2）對(duì)23個(gè)疑似病毒樣品依次進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，除SRBSDV和RRSV檢測(cè)呈陽(yáng)性以外，其它病毒引物檢測(cè)都為陰性（圖2，3）。

應(yīng)用南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）引物檢測(cè)樣品時(shí)，其中NFR3、NFR7、NFR8、NFR9、NFR16、NFR19共6例樣品的檢測(cè)顯示為陽(yáng)性，在600 bp目標(biāo)區(qū)域有明顯的PCR產(chǎn)物條帶（圖2）。23例疑似病害樣品中，南方水稻黑條矮縮病毒檢出率為26.09%。而應(yīng)用水稻齒葉矮縮病毒（RRSV）引物檢測(cè)樣品時(shí)，其中NFR2、NFR3、NFR4、NFR5、NFR9、NFR10、NFR12、NFR13、NFR14、 NFR15、NFR20、NFR21 、NFR22、NFR23共14例樣品的檢測(cè)顯示為陽(yáng)性，在700 bp目標(biāo)區(qū)域有明顯的PCR產(chǎn)物條帶（圖3）。23例疑似病害樣品中，水稻齒葉矮縮病毒檢出率達(dá)60.87%。檢測(cè)結(jié)果顯示，NFR3和NFR9 2例樣品在SRBSDV和RRSV引物檢測(cè)中均呈陽(yáng)性，可能同時(shí)交叉感染這2種病毒（圖2，3）。

2.3 病毒序列鑒定

通過(guò)對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定，獲得了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列信息，并將其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn比對(duì)（表3）。鑒定結(jié)果顯示，14例樣品為水稻齒葉矮縮病毒感染，6例樣品為南方水稻黑條矮縮病毒感染，其中NFR3和NFR9 2例樣品同時(shí)感染了上述2種病毒。結(jié)果表明，危害南繁區(qū)域水稻的水稻齒葉矮縮病毒為同一種（序列號(hào)：GQ329711.1），與此同時(shí)，可能存在多個(gè)危害南繁區(qū)域水稻的南方水稻黑條矮縮病毒變種。

3 討論

本研究基于已知的10種水稻RNA病毒設(shè)計(jì)了RT-PCR引物，對(duì)從南繁區(qū)采集的23個(gè)疑似病害樣品進(jìn)行檢測(cè)，獲得南方水稻黑條矮縮病毒感染樣品6例、水稻齒葉矮縮病毒感染樣品14例，其中有2例是復(fù)合感染的樣品，沒(méi)有檢測(cè)到其余8種水稻病毒侵染的樣品。已知的10種水稻RNA病毒基因組均屬于雙鏈RNA（dsRNA）類型，在病毒感染的不同時(shí)期寄主體內(nèi)的病毒dsRNA含量發(fā)生變化，因此在提取疑似病樣的總RNA時(shí)，難以獲得一些病毒dsRNA含量較低的RNA樣品，導(dǎo)致PCR檢測(cè)呈陰性。此外，除已報(bào)道的10種水稻RNA病毒以外，可能存在未知的病毒種類，由于缺少基因組信息，因此還無(wú)法通過(guò)PCR檢測(cè)到。

本研究結(jié)果顯示，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是中國(guó)南繁區(qū)域危害水稻的2種主要病毒。近年來(lái)，南方水稻黑條矮縮病毒已成為危害中國(guó)水稻生產(chǎn)的重要病毒，主要在以種植秈稻為主的長(zhǎng)江以南地區(qū)為害水稻，在南方的13個(gè)省份均有報(bào)道，造成了嚴(yán)重的損失[15]。水稻黑條矮縮病毒主要在長(zhǎng)江流域水稻種植區(qū)域發(fā)生為害，尤其在江蘇地區(qū)，水稻黑條矮縮病毒幾乎遍布全省[3]。據(jù)報(bào)道，這2種病毒可侵染常規(guī)粳稻、常規(guī)秈稻、雜交粳稻、雜交秈稻、常規(guī)糯稻等，生產(chǎn)中尚未見(jiàn)對(duì)這2種病毒高抗的水稻類型或品種[11，15-16]。據(jù)報(bào)道，由于水稻齒葉矮縮病毒病害發(fā)病率普遍較低，未廣泛流行，導(dǎo)致該病未得到重視。但是，該病近年在中國(guó)南方局部地區(qū)已造成比較嚴(yán)重的損失，有流行爆發(fā)的可能[16]。

鑒于中國(guó)海南南繁區(qū)域水稻育種材料來(lái)源廣泛且易于擴(kuò)散的特殊性，亟待加強(qiáng)對(duì)水稻病毒的檢測(cè)和檢疫。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南方水稻黑條矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒是南繁區(qū)域目前需要重點(diǎn)防控的病害對(duì)象，南繁區(qū)域發(fā)現(xiàn)的南方水稻黑條矮縮病毒的多樣性較高，可能存在多個(gè)變種。鑒于病毒極易產(chǎn)生變異而導(dǎo)致防治困難的特點(diǎn)，建議南繁區(qū)域科研單位重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)上述2種病毒的檢疫和檢測(cè)，預(yù)防水稻病毒病的大規(guī)模為害。在本研究基礎(chǔ)上，筆者分別研發(fā)了用于快速檢測(cè)和鑒定南方水稻黑條矮縮病毒、水稻齒葉矮縮病毒的分子檢測(cè)試劑盒（待發(fā)表），為南繁區(qū)域水稻病毒的檢測(cè)和防疫提供技術(shù)支持。

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