馬艷芝，客紹英

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

不同柴胡種質(zhì)資源的ISSR和ITS序列分析

馬艷芝，客紹英

(唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 唐山 063000)

【目的】 利用ISSR標(biāo)記和ITS序列分析方法，對(duì)11份柴胡種質(zhì)進(jìn)行鑒定和親緣關(guān)系分析，為柴胡種質(zhì)資源利用和進(jìn)化分析提供理論依據(jù)。【方法】 以取自不同省份的11份柴胡干品為材料，提取其基因組DNA，進(jìn)行ISSR分析，利用DPS(V7.5)軟件計(jì)算遺傳距離，利用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建11份柴胡樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)，利用ITS引物對(duì)柴胡樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，利用DNAMAN軟件分析11份柴胡種質(zhì)的ITS序列，對(duì)其遺傳相似性進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】 從100條ISSR引物中篩選出21條擴(kuò)增譜帶清晰、多態(tài)性高的引物，利用這21條引物從11份柴胡樣品中共獲得185條擴(kuò)增條帶，其中156條條帶呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性條帶比例為84.3%。11份柴胡樣品間遺傳距離為0.458 8～0.782 2，表明這11份柴胡樣品間遺傳基礎(chǔ)較狹窄；聚類結(jié)果將11份柴胡樣品分成2大類，大部分來(lái)源相同或相近的柴胡樣品聚在一起。ITS序列分析結(jié)果表明， 11份柴胡樣品的ITS序列均長(zhǎng)321 bp,也可以分為2類，部分柴胡樣品存在同質(zhì)異名現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】 利用ITS技術(shù)或?qū)⑵渑cISSR標(biāo)記相結(jié)合對(duì)柴胡種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定和分析，可以提高柴胡種質(zhì)資源鑒定的準(zhǔn)確性和效率。

柴胡；ISSR；ITS；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；聚類分析

柴胡(Radix Bupleuri)已有2000年以上的藥用歷史，是最常用的藥用植物之一，可用于治療發(fā)熱、流感、胸部擴(kuò)張性疼痛、月經(jīng)紊亂等癥[1-2]，具有抗病毒感染、抗?jié)?、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和保肝等多種功效[3-7]。柴胡為傘形科(Umbelliferae)柴胡屬(BupleurumL．)植物，柴胡屬內(nèi)植物種類很多，全世界有200種左右[8]，是傘形科的一個(gè)大屬。據(jù)記載，我國(guó)共有柴胡屬植物41種、17個(gè)變種及7個(gè)變型[9]。包括柴胡屬在內(nèi)的傘形科植物的分類、鑒定一直是植物研究的熱點(diǎn)之一。由于柴胡分布范圍較廣(遍及我國(guó)東北、華北、西北、華東和華中)，加之對(duì)其種質(zhì)多樣性的復(fù)雜程度認(rèn)識(shí)不足，對(duì)種質(zhì)的描述界定也相對(duì)寬泛，因此柴胡種下的準(zhǔn)確分類、鑒定是一個(gè)比較困難的問(wèn)題。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為植物分類與鑒定提供了更多手段。目前，已有利用脂酶同工酶譜帶[10]、RAPD方法[11]及ITS序列分析[12-13]對(duì)柴胡屬不同種進(jìn)行鑒定的研究報(bào)道。對(duì)于柴胡而言，其野生資源日漸減少，栽培品種選育也迫在眉睫，因此借助分子標(biāo)記手段篩選柴胡育種材料，對(duì)其雜種后代進(jìn)行早期選擇鑒定[14]，可以減少育種的盲目性，加速育種進(jìn)程。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)標(biāo)記是由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等在1994年提出的，該標(biāo)記具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[15]，現(xiàn)已被廣泛用于植物群體遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等研究[16-17]。利用ISSR標(biāo)記可以對(duì)柴胡種質(zhì)進(jìn)行鑒定，明確其遺傳差異和親緣關(guān)系。高等植物中的rRNA基因(rDNA)是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，由18S rDNA、26S rDNA、5.8S rDNA和位于三者之間的基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列(Internal Transcribed Spacer)組成，聯(lián)結(jié)在一起為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其中ITS區(qū)由5.8S rDNA所分隔的ITS1和ITS2 2個(gè)片段組成。ITS序列變異較快，高度重復(fù)，且可以通過(guò)不等交換和基因轉(zhuǎn)換達(dá)到同步進(jìn)化，可以提供豐富的變異位點(diǎn)和信息點(diǎn)，所以被廣泛用于植物系統(tǒng)進(jìn)化和種質(zhì)鑒定研究[18]。本研究通過(guò)ISSR標(biāo)記和ITS序列分析，對(duì)11份柴胡種質(zhì)進(jìn)行鑒定，分析其親緣關(guān)系，以期為柴胡種質(zhì)資源利用和進(jìn)化分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試柴胡材料共11份，取自山西、河北等省(表1)，材料名稱為當(dāng)?shù)亓?xí)稱。

1.2 試劑及儀器

提取DNA的試劑均為分析純，購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；ISSR PCR擴(kuò)增所用試劑均購(gòu)自大連寶生物公司；ITS PCR擴(kuò)增所用2×PCR Mix 購(gòu)自北京匯天東方科技有限公司；ITS PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。ISSR PCR 擴(kuò)增在Biometra公司的梯度PCR儀上進(jìn)行，ITS PCR 擴(kuò)增在BioRad公司MyCycler PCR儀上進(jìn)行。

1.3 柴胡DNA的提取

柴胡DNA的提取參照SDS法[11]，并有所改進(jìn)。取柴胡干品，用旋風(fēng)磨粉碎，取0.4 g柴胡粉末至2.0 mL離心管中，加入65 ℃預(yù)熱的SDS提取液900 μL，充分混勻后于65 ℃水浴30 min。加入等體積的苯酚/氯仿(V(苯酚)∶V(氯仿)=1∶1)混勻，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液；再加入等體積的氯仿/異戊醇(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，混勻，12 000 r/min離心10 min；吸取上清液，加入2倍體積的-20 ℃無(wú)水乙醇沉淀DNA，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗滌DNA 2次，室溫下晾干至透明，加200 μL TE使DNA完全溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。用分光光度?jì)測(cè)OD260和OD280，通過(guò)OD260/OD280值及1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA質(zhì)量。

1.4 ISSR擴(kuò)增檢測(cè)

100條ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的ISSR引物序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為：10× PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 20 ng，引物2 μL(0.1～0.5 μmol/L)，MgCl21.5 μL，dNTP 2 μL，TaqDNA聚合酶2 U，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，退火(47～54 ℃)1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，5 V/cm電壓條件下電泳45 min，EB(溴化乙錠)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果，同一引物、同一位點(diǎn)有擴(kuò)增條帶的記為“1”，無(wú)擴(kuò)增條帶的則記為“0”。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS(V7.5)計(jì)算遺傳距離，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

1.5 ITS的PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

1.5.1 ITS的PCR擴(kuò)增 ITS引物參考武瑩等[19]報(bào)道的序列設(shè)計(jì)，ITS-F：GGAAGTAAAAGTCG-TAACAAGG，ITS-R：GCTGCGTTCTTCANTCG-ATGC，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 80 ng，上、下游引物(20 mmol/L)各1 μL，用ddH2O補(bǔ)充反應(yīng)體系至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，10 ℃保溫。

1.5.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 為了提高分辨率，ITS PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。電泳采用北京六一廠DYY-7C型電泳儀和DYC-34A型電泳槽進(jìn)行，1×TAE電泳緩沖液，210 V電泳45 min。電泳完畢后用EB浸泡染色約10 min，凝膠成像系統(tǒng)下照相，記錄電泳結(jié)果。

目標(biāo)條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。T-載體采用pMD20-T載體，連接體系為：pMD20-T載體1 μL，回收產(chǎn)物2.5 μL，ddH2O 1.5 μL，Solution Ⅰ 5 μL，16 ℃連接30 min。連接后的載體利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α涂布在含氨芐青霉素(100 mg/L)的LB培養(yǎng)基(酵母提取物5 g，胰蛋白凍10 g，NaCl 10 g，瓊脂粉6 g，加蒸餾水至1 L)上，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個(gè)LB平板挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由深圳華大科技公司完成，序列分析采用DNAMAN軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物對(duì)11份柴胡的擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選，從中篩選出21條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好且重復(fù)性好的引物，其中多態(tài)性比率較高的引物有UBC810、UBC811、UBC814、UBC845、UBC859和UBC892(表2)。用這21條引物對(duì)11份供試柴胡材料進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得185條擴(kuò)增條帶，平均每條引物獲得7.4條條帶；在185條條帶中，有156條條帶為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比例為84.3%(表2)，表明這21條ISSR引物可以用于柴胡種質(zhì)資源遺傳多樣性的檢測(cè)。

2.2 基于ISSR引物對(duì)11份柴胡的聚類分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS(V7.5)計(jì)算遺傳距離，結(jié)果(表3)顯示，11份柴胡樣品間的遺傳距離比較小，在0.458 8～0.782 2，表明這些柴胡樣品之間的親緣關(guān)系差別不大。其中，10號(hào)與11號(hào)柴胡材料親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.458 8；其次為8號(hào)與9號(hào)柴胡材料，遺傳距離為0.478 3；2號(hào)與10號(hào)柴胡材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離為0.782 2。采用UPGMA方法對(duì)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，11份柴胡材料都聚在遺傳距離為0.46～0.71的類群中。在遺傳距離0.7處可將供試的11份柴胡樣品分成2大類，第1大類包括1、2、4、5、7、10和11號(hào)共7份材料，其中10號(hào)與11號(hào)材料親緣關(guān)系較近，4號(hào)與5號(hào)材料親緣關(guān)系較近；第2大類包括3、6、8和9號(hào)共4份材料，其中8號(hào)與9號(hào)材料親緣關(guān)系較近，3號(hào)與6號(hào)材料親緣關(guān)系較近。

注：表中各編號(hào)所示樣品與表1同。

Note:The numbers of the materials in the table1 were the same as table 1.

2.3 利用ITS引物對(duì)11份柴胡的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用ITS引物對(duì)11份柴胡樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2條清晰的條帶，其中一條帶長(zhǎng)244 bp，另一條帶長(zhǎng)321 bp(圖2)。將2條帶進(jìn)行切膠回收、測(cè)序，然后將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast檢索比對(duì)，結(jié)果顯示，長(zhǎng)244 bp條帶序列與真菌18S和5.8S核糖體RNA基因序列的相似性達(dá)99%，而長(zhǎng)321 bp的條帶序列與柴胡18S和5.8S核糖體RNA基因序列的相似性達(dá)98%，說(shuō)明321 bp條帶為柴胡樣品的ITS擴(kuò)增條帶，而244 bp的條帶則可能是柴胡干品中存在真菌污染等原因造成的。

利用DNAMAN軟件對(duì)11份柴胡樣品的ITS序列進(jìn)行分析，結(jié)果(圖3)顯示,這11份樣品的ITS序列均為321 bp，且序列相似性非常高，達(dá)97.5%，不同材料間ITS序列不存在插入/缺失，但包含一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)。依據(jù)ITS序列，11份柴胡樣品同樣被分為2大類，第1大類包括1、2、4、5、7、10和11號(hào)共7份材料，其中除1號(hào)樣品第199位點(diǎn)處為T堿基外，這7份材料的ITS序列完全相同(由于ITS-R引物包含1個(gè)兼并位點(diǎn)，所以ITS序列第309位點(diǎn)的差異不計(jì)算在內(nèi))；3、6、8和9號(hào)4份材料的ITS序列存在5處SNP位點(diǎn)94(A)、125(T)、157(T)、172(G)和228(T)，這5個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成單倍型(Haplotype)，將這4份材料歸入第2類(圖3)。

3 討 論

3.1 不同柴胡樣品的同一性鑒定

在本研究中，11份柴胡樣品包括北柴胡、黑柴胡、31號(hào)柴胡和紅柴胡等多種材料，分別來(lái)源于7個(gè)省的10個(gè)不同地區(qū)，但I(xiàn)SSR結(jié)果顯示，這11份材料分為2大類，其中1號(hào)(黑柴胡，山西萬(wàn)榮)、2號(hào)(北柴胡，河北張家口)、4號(hào)(黑柴胡，甘肅隴西)、5號(hào)(北柴胡，河南盧氏)、7號(hào)(805柴胡，山東樂(lè)陵)、10號(hào)(黑柴胡，湖南邵東)和11號(hào)(紅柴胡，甘肅臨洮)聚為一類。ITS序列分析結(jié)果也顯示，這7份材料雖然產(chǎn)地不同，材料名稱也不相同，但除1號(hào)樣品有1處SNP位點(diǎn)外，7份材料的ITS序列完全一致，表明這7份柴胡樣品或者親緣關(guān)系非常近，或者存在同質(zhì)異名現(xiàn)象。

同質(zhì)異名現(xiàn)象在柴胡生產(chǎn)中普遍存在，這是由于柴胡自然分布廣泛，且不同地區(qū)之間相互引種，致使種質(zhì)親緣關(guān)系不清；同時(shí)由于各地柴胡習(xí)稱及民間用藥歷史和習(xí)慣不同，也導(dǎo)致柴胡在使用和栽培中產(chǎn)生種質(zhì)混亂的現(xiàn)象?！吨袊?guó)藥典》中載入的柴胡只有傘形科植物柴胡(B.chineseDC.)和狹葉柴胡(B.scorzonerifoliumWilld)，前者習(xí)稱“北柴胡”、“硬柴胡”等，后者習(xí)稱“南柴胡”、“軟柴胡”或“紅柴胡”等，但生產(chǎn)中如錐葉柴胡(B.bicaule)、銀州柴胡(B.yinchowense)、黑柴胡(B.smithii)和柴首(B.chaishoui)等20多種植物在不同地區(qū)也被當(dāng)作柴胡藥用。北柴胡主要分布于河北、河南、山東、吉林、遼寧、甘肅、陜西等省，黑柴胡主要產(chǎn)自內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、青海等省，在地理分布上黑柴胡與北柴胡較接近，在生產(chǎn)中容易混淆。由于紅柴胡與北柴胡均是《中國(guó)藥典》記載的正品柴胡藥材，所以在藥品生產(chǎn)中常被混用而不加區(qū)別，這也造成紅柴胡和北柴胡容易相互混淆。從遺傳學(xué)角度講，北柴胡、紅柴胡與黑柴胡間的親緣關(guān)系也非常接近。宋蕓等[20]對(duì)6種柴胡屬植物的核型分析結(jié)果顯示,北柴胡、紅柴胡與黑柴胡間的親緣關(guān)系較近，其染色體數(shù)均為2n=12，且紅柴胡與北柴胡核型近似系數(shù)達(dá)到0.992，核型進(jìn)化距離最小(0.008)，表明北柴胡與紅柴胡的親緣關(guān)系非常近，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同。

三島柴胡(B.falcatum)也叫“31號(hào)柴胡”、“川島柴胡”和“黃柴胡”等，原產(chǎn)于日本及朝鮮等地，于20世紀(jì)80年代引入我國(guó)，現(xiàn)在甘肅、陜西等地有較大規(guī)模種植，其主要成分及藥理與國(guó)產(chǎn)柴胡基本相同。因其形狀與其他柴胡特別是北柴胡較相似，故容易引起混淆，但三島柴胡體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=26，從核型分析結(jié)果看，三島柴胡與黑柴胡核型近似系數(shù)較小(0.479 4)，核型進(jìn)化距離較大(0.735 2)，故三島柴胡與黑柴胡的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[20]。本試驗(yàn)中3號(hào)(31號(hào)柴胡)、6號(hào)(黃柴胡)、8號(hào)(三島柴胡)和9號(hào)(31號(hào)柴胡)柴胡樣品同屬三島柴胡，只是習(xí)稱不同而已， ISSR試驗(yàn)結(jié)果中這4份材料聚在同一類，且這4份柴胡樣品的ITS序列相同，與北柴胡的ITS序列存在較大差異。

3.2 分子檢測(cè)在柴胡種質(zhì)資源鑒定中的有效性

由于柴胡屬植物種類多，分布廣泛，表型特征相似度高，因此存疑類群較多，屬下種間分類不清，給柴胡屬植物資源鑒定和利用造成了較大困難[21]。雖然前人已從形態(tài)學(xué)[22-23]、植物化學(xué)[24-25]等方面開(kāi)展了很多工作，認(rèn)為葉片、果實(shí)形態(tài)和解剖學(xué)特征以及類群間某些化學(xué)成分的差異可作為區(qū)分不同柴胡種質(zhì)資源的依據(jù)，但由于柴胡從野生種到栽培種的變化過(guò)程中，通常是農(nóng)戶自種自繁，沒(méi)有明確的種子、種苗來(lái)源，不同地區(qū)的種質(zhì)也是隨意引種種植，留種過(guò)程缺乏去雜除劣措施，這就造成不同種質(zhì)相互混雜。另外，由于柴胡為異花授粉植物，柴胡種質(zhì)常常是遺傳背景混雜的群體，不同個(gè)體間形態(tài)也常表現(xiàn)出一定的差異[26]。邵天玉等[27]發(fā)現(xiàn)，按照植物志的描述，不同種質(zhì)來(lái)源的柴胡樣品確實(shí)都只能歸屬于北柴胡(B.chinense)這一大類群，然而它們?cè)谏飳W(xué)特性等方面卻存在很大差異。所以，僅使用形態(tài)學(xué)等方法區(qū)分不同柴胡種質(zhì)是不準(zhǔn)確的。因此柴胡種質(zhì)資源的鑒定對(duì)柴胡種質(zhì)的利用、育種和生產(chǎn)，以及充分利用活性成分不同的各種質(zhì)柴胡進(jìn)行藥劑生產(chǎn)具有重要意義。

張永剛等[28]認(rèn)為，有些柴胡屬種質(zhì)雖然在生物學(xué)分類上屬于同一類，但它們?cè)诜肿铀缴先源嬖谳^大差異，這是遺傳與環(huán)境交互作用的結(jié)果。因此，利用分子檢測(cè)手段可以更有效地區(qū)分種間差異，為柴胡種質(zhì)鑒定、篩選、培育和野生資源保護(hù)利用提供可靠的依據(jù)。ISSR是一種操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性高的分子標(biāo)記技術(shù)，可以很好地揭示柴胡種質(zhì)資源的多態(tài)性。隋春等[14]建立了適于柴胡的ISSR分析體系，并采用ISSR技術(shù)分析了3份柴胡栽培種質(zhì)個(gè)體間及種間的差異。白楊[29]以三島柴胡和銀川柴胡為對(duì)照，采用ISSR技術(shù)標(biāo)記不同產(chǎn)地柴胡的DNA，分析了不同產(chǎn)地、不同品種柴胡的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及其與藥材品質(zhì)的相關(guān)性。武瑩等[19]通過(guò)對(duì)北柴胡、狹葉柴胡、竹葉柴胡、黑柴胡以及柴胡近緣屬植物孜然芹的序列ITS分析表明，ITS1和ITS2序列信息位點(diǎn)豐富，不同種類的柴胡均可檢測(cè)到特異性的變異位點(diǎn)。同時(shí)，還有學(xué)者利用ITS序列分析技術(shù)，對(duì)來(lái)源于歐洲西南部和非洲西北部的32個(gè)柴胡種質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究[13]。由于ITS技術(shù)是直接對(duì)柴胡樣品的rDNA序列進(jìn)行測(cè)定，其檢測(cè)準(zhǔn)確性比ISSR標(biāo)記有了更進(jìn)一步的提高，所以利用ITS技術(shù)或者將其與ISSR標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行柴胡種質(zhì)資源的鑒定工作，可有效地提高柴胡種質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性和效率。

[1] Chen F P,Kung Y Y,Chen Y C,et al.Frequency and pattern of Chinese herbal medicine prescriptions for chronic hepatitis in Taiwan [J].J Ethnopharmacol,2008,117(1):84-91.

[2] Ikegami F,Sumino M,Fujii Y,et al.Pharmacology and toxicology ofBupleurumroot-containing Kampo medicines in clinical use [J].Hum Exp Toxicol,2006,25(8):481-494.

[3] Cheng P W,Ng L T,Chiang L C,et al.Antiviral effects of saikosaponins on human corona virus 229Einvitro[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2006,33(7):612-616.

[4] Matsumoto T,Sun X B,Hanawa T,et al.Effect of the antiulcer polysaccharide fraction fromBupleurumfalcatumL. on the healing of gastric ulcer induced byacetic acid in rats [J].Phytother Res,2002,16(1):91-93.

[5] Su J K,Lee Y J,Kim B M,et al.Effect ofBupleuriRadix extracts on the toxicity of 5-fluorouracil in HepG2 hepatoma cells and normal human lymphocytes [J].Basic Clin Pharmacol Toxicol,2008,103(4):305-313.

[6] Wang Z,Li H,Xu H,et al.Beneficial effect ofBupleurumpolysaccharides on autoimmune disease induced by Campylobacter jejuni in BALB/c mice [J].J Ethnopharmacol,2009,124(3):481-487.

[7] Zhao R Z,Yuan D,Liu S J,et al.Liver targeting effect of vinegar-bakedBupleuriRadix on rhein in rats [J].J Ethnopharmacol,2010,132(2):421-428.

[8] 譚玲玲,陳 瑩,蔡 霞,等.北柴胡的生物學(xué)及化學(xué)成分的研究進(jìn)展 [J].中草藥,2005,36(9):1431-1433.

Tan L L,Chen Y,Cai X,et al.Research progress on the biological and chemical components ofBupleurumchinenseDC. [J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2005,36(9):1431-1433.(in Chinese)

[9] 舒 璞,袁昌齊,佘孟蘭,等.中國(guó)柴胡屬藥用植物的數(shù)量分類研究(1) [J].西北植物學(xué)報(bào),1998,18(2):277-283.

Shu P,Yuan C Q,She M L,et al.Numerical taxonomy of medicinalBupleurumspecies in China [J]. Acta Bot Boreal-Occident Sin,1998,18(2):277-283.(in Chinese)

[10] 丁 銳,李利華.利用脂酶鑒定柴胡及其親緣關(guān)系的研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(13):2983.

Ding R,Li L H.Study on the identification ofBupleurumL.variety with esterase and its relationships [J].Journal of Anhui Agri Sci,2006,34(13):2983.(in Chinese)

[11] 梁之桃,秦民堅(jiān),王崢濤,等.柴胡屬5種植物RAPD分析與分類鑒定 [J].中草藥,2002,33(12):1117.

Liang Z T,Qin M J,Wang Z T,et al.Identification ofBupleurumL.plants by RAPD technology [J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2002,33(12):1117.(in Chinese)

[12] 武 瑩.柴胡ITS序列研究、藥源調(diào)查及商品鑒定 [D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2005.

Wu Y.ITS analysis,pharmacognostical identification and com-modity identification ofBupleurum[D].Beijing:Beijing University of Chinese Medicine,2005.(in Chinese)

[13] Neves S S,Watson M F.Phylogenetic relationships inBupleurum(Apiaceae) based on nuclear ribosomal DNA ITS sequence data [J].Ann Bot,2004,93:379-398.

[14] 隋 春,魏建和,陳士林,等.柴胡ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 [J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(8):1837-1839.

Sui C,Wei J H,Chen S L,et al.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system ofBupleurumchinense[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2008,19(8):1837-1839.(in Chinese)

[15] Azevedo A L,Costa P P,Machado M A,et al.High degree of genetic diversity among genotypes of the forage grassBrachiariaruiziziensis(Poaccae) detected with ISSR markers [J].Genet Mol Res,2011,10(4):3530-3538.

[16] Phong D T,Hien V T,Thanh T T,et al.Comparison of RAPD and ISSR makers for assessment of genetic diversity among endangered rareDalbergiaoliveri(Fabaceae) genotypes in Vietnam [J].Genet Mol Res,2011,10(4):2382-2393.

[17] Zhang X G,Han T,He Z G,et al.Genetic diversity ofCentellaasiaticain China analyzed by inter-simple sequence repeat (ISSR) makers:Combination analysis with chemical diversity [J].J Nat Med,2012,66(1):241-247.

[18] 王建波,張文駒,陳家寬.核rDNA的ITS序列在被子植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的應(yīng)用 [J].植物分類學(xué)報(bào),1999,37(4):407-416.

Wang J B,Zhang W J,Chen J K.Application of ITS sequences of nuclear rDNA in phylogenetic and evolutionary studies of angiosperms [J].Acta Phytotaxonomica Sinica,1999,37(4):407-416.(in Chinese)

[19] 武 瑩,劉春生,劉玉法,等.5種習(xí)用柴胡的ITS序列鑒別 [J].中國(guó)中藥雜志,2005,30(10):732-734.

Wu Y,Liu C S,Liu Y F,et al.ITS sequence identification ofBupleuriRadix [J].China Journal of Chinese Materia Medica，2005,30(10):732-734.(in Chinese)

[20] 宋 蕓,喬永剛,吳玉香.6種柴胡屬植物核型似近系數(shù)聚類分析 [J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(8):1157-1160.

Song Y,Qiao Y G,Wu Y X.Clustering analysis of karyotype resemblance-near coefficient for 6Bupleurumspecies [J].China Journal of Chinese Materia Medica,2012,37(8):1157-1160.(in Chinese)

[21] 梁乾隆,王長(zhǎng)寶,馬祥光,等.中國(guó)柴胡屬染色體數(shù)目和核型研究 [J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2013,31(1):11-22.

Liang Q L,Wang C B,Ma X G,et al.Chromosomal study on ChineseBupleurumL.(Apiaceae) [J].Plant Science Journal,2013,31(1):11-22.(in Chinese)

[22] Liu M,Shi L,Wyk B V,et al.Fruit anatomy of the genusBupleurum(Apiaceae) in northeastern China and notes on systematic implications [J].South Afr J Bot,2003,69:151-157.

[23] Wang P L,Fu F D.Pollen morphology ofBupleurumL.from Sino-Himalaya and its systematic significance [J].Chin J Appl Environ Biol,1995,1(1):34-43.

[24] 郭濟(jì)賢,潘勝利,李 穎,等.中國(guó)柴胡屬19種植物揮發(fā)油化學(xué)成分的研究 [J].上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1990,17(4):279-282.

Guo J X,Pan S L,Li Y,et al.Study on chemical constituents of volatile oil from 19Bupleurumspecies [J].Journal of Shanghai Medical University,1990,17(4):279-282.(in Chinese)

[25] 張義玲,馮成強(qiáng),孟繁蘊(yùn),等.藥用柴胡屬植物產(chǎn)地與化學(xué)成分相關(guān)性研究 [J].生命科學(xué)研究,2006,10(4):86-89.

Zhang Y L,Feng C Q,Meng F Y,et al.Correlation of origin and chemical composition ofBupleurum[J].Life Science Research,2006,10(4):86-89.(in Chinese)

[26] 隋 春,魏建和,王躍虎,等.柴胡栽培種質(zhì)遺傳混雜的ISSR分析 [J].新疆大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,24(S):227-230.

Sui C,Wei J H,Wang Y H,et al.Diversities study on intra- and inter-Bupleurumcultivated germplasms using ISSR molecular markers [J].Journal of Xinjiang University:Natural Science Edition,2007,24(S):227-230.(in Chinese)

[27] 邵天玉,樸 錦,呂龍石.北柴胡和狹葉柴胡的過(guò)氧化物酶及酯酶同工酶分析 [J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2007,29(2):115-118.

Shao T Y,Piao J,Lü L S.Analysis ofBupleurumchinenseDC andBupleurunscorzonerifoliumWilld’s peroxidase and esterase isodynamic [J].Journal of Agricultural Science Yan-bian University,2007,29(2):115-118.(in Chinese)

[28] 張永剛,韓 梅,劉翠晶,等.RAPD分析野生和栽培柴胡親緣關(guān)系 [J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(6):574-576.

Zhang Y G,Han M,Liu C J,et al.Genetic relationship analysis of wild and cultivatedBupleurumwith RAPD marker [J].Journal of Nanjing University of TCM,2012,28(6):574-576.(in Chinese)

[29] 白 楊.不同產(chǎn)地柴胡的ISSR分子標(biāo)記及品質(zhì)研究 [D].武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院,2008.

Bai Y.Study of ISSR molecular marker and quality ofBupleurumfrom different producing areas [D].Wuhan:Hubei College of Traditional Chinese Medicine,2008.(in Chinese)

ISSR-PCR and ITS sequence analysis ofBupleurumgermplasm resources

MA Yan-zhi,KE Shao-ying

(DepartmentofLifeSciences,TangshanTeacher’sCollege,Tangshan,Hebei063000,China)

【Objective】 This paper aimed to identify and analyze germplasm resources of 11Bupleurumvarieties using ISSR-PCR and ITS sequence analysis methods,which would provide a theoretical basis for resource utilization and evolution analysis ofBupleurumgermplasm.【Method】 DNA samples were extracted from 11 dryBupleurumcultivars.With ISSR-PCR,genetic similarity coefficients (GS) were calculated by DPS software and cluster analysis was conducted by UPGMA.The ITS sequences of 11Bupleurumcultivars were obtained after PCR and sequencing and the DNAMAN software was employed to align the ITS sequences.The genetic similarity was also identified.【Result】 21 out of 100 primers with clear amplification spectrum and high polymorphism were selected,and a total of 185 fragments were amplified,among which 156 fragments were polymorphic with a ratio of 84.3%.The GS varied from 0.458 8 to 0.782 2,indicating that the genetic diversity of these cultivars was relatively low.Both UPGMA cluster and ITS sequence analysis showed that the tested 11Bupleurumcultivars could be divided into two categories.The average sequence length of the samples was 321 bp.Some cultivars were homogeneous.【Conclusion】 Using ITS and ISSR methods increased the accuracy and efficiency ofBupleurumgermplasm resources analysis.

BupleurumL.;ISSR;ITS;germplasm resources;genetic diversity;cluster analysis

2014-06-11

國(guó)家科技部子課題項(xiàng)目(2011BAI07B05-4)；河北省科技廳項(xiàng)目(10965511D)；唐山市科技重大項(xiàng)目(12130203A)；唐山師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目(11A01)

馬艷芝(1977-)，女，河北唐山人，副教授，碩士，主要從事藥用植物與生物技術(shù)研究。E-mail：mayanzhiwxd@163.com

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.020

S567.7+9

A

1671-9387(2015)01-0193-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.020.html