王 超，金宏麗，王化磊，楊松濤，夏咸柱

西方馬腦炎（western equine encephalitis,WEE）是由西方馬腦炎病毒（western equine encephalitis virus,WEEV）感染引起，經(jīng)蚊蟲傳播的急性人獸共患病毒性疾病。該病具有傳染性強、發(fā)病率及病死率高等特點。WEEV于1930年首次從美國加州默克郡的病馬腦內分離，目前WEE主要分布于北美洲的加拿大、美國以及南美洲的巴西、阿根廷、墨西哥、秘魯、智利和烏拉圭等國。此病在北美呈地方性流行，以不規(guī)則的間隔時間在馬和人群中流行[1]。我國于1990年首次從新疆維吾爾自治區(qū)烏蘇縣的赫坎按蚊和博樂縣的全溝硬蜱中分離到WEEV[2]。呂新軍等[3]在我國青海省、甘肅省、黑龍江省、河南省、湖北省、安徽省、湖南省、寧夏回族自治區(qū)及新疆維吾爾自治區(qū)進行人體血清調查，發(fā)現(xiàn)除寧夏回族自治區(qū)、黑龍江省和湖北省未發(fā)現(xiàn)WEEV抗體陽性血清外，其余地區(qū)均存在WEEV抗體陽性血清，WEEV抗體陽性率達到2.71%。最近幾年我國多地出現(xiàn)不明原因腦炎病例，疑與WEEV有關，提示W(wǎng)EEV存在于我國，且有暴發(fā)流行的可能。

因WEEV感染人和馬后可導致極其嚴重的負面影響，受感染的人和馬也存在跨國傳染的可能性[4]，在全球引起了廣泛關注，發(fā)生疫情后必須向世界動物衛(wèi)生組織申報[5]。此外，WEEV被視為一種潛在的生物戰(zhàn)劑（生物恐怖劑）[6-7]。目前WEE尚無獲批疫苗或有效抗病毒藥物，研發(fā)有效疫苗用于相關人群的免疫預防顯得尤其重要。本文就疫苗研究進展進行綜述。

1 滅活疫苗

目前，基于福爾馬林滅活WEEV制備的滅活疫苗是一種試驗中新藥，僅適用于馬和實驗室工作人員的預防免疫[8]。長期試驗表明：3次免疫后僅有50%的個體產(chǎn)生了有效免疫應答，且免疫后1年僅有20%的個體仍存在特異性免疫力，因此易感人群須每年進行加強免疫[9]。雖然該滅活病毒疫苗免疫效果良好，但是生產(chǎn)過程中病毒的大量繁殖須在生物安全3級實驗室進行，此過程存在操作人員被WEEV感染的風險，導致疫苗生產(chǎn)成本居高不下，因此該疫苗的應用受到限制[5]。

2 減毒活疫苗

目前尚無減毒活疫苗獲批上市，WEEV弱毒株的篩選處于研究階段。有報道利用反向遺傳技術，將WEEV的全長cDNA進行定點突變，拯救獲得了減毒的突變毒株（WE2102和WE2130）。動物實驗結果表明，與母本毒株相比，減毒株在蚊體內的復制和傳播能力明顯降低，免疫1日齡小雞2周后以WEEV強毒株進行攻擊，未出現(xiàn)病毒血癥，WE2102和WE2130可作為減毒疫苗候選株[10]。

曾有一種與WEEV同屬的委內瑞拉馬腦炎病毒的減毒疫苗獲批在人和馬中使用，但臨床應用結果表明，盡管該疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生持久的保護性免疫，但近40%的疫苗接種者出現(xiàn)不同的不良反應。此外，考慮存在神經(jīng)毒性等不安全因素，該減毒疫苗在美國已停止使用[11]。

3 亞單位疫苗

Das等[12]利用大腸桿菌表達WEEV的E1蛋白，該重組蛋白免疫小鼠后可產(chǎn)生較強的特異性細胞免疫和體液免疫應答，但同源WEEV攻擊的保護率僅為25%，且對異源病毒株的攻擊無保護力。此外，該研究組又采用大腸桿菌表達了WEEV的E2蛋白，盡管E2蛋白免疫小鼠的同源WEEV攻擊保護力略高于E1蛋白，但整個實驗結果與E1蛋白的結果無顯著差異[13]。

近來，也有研究嘗試采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達WEEV糖蛋白以制備WEE亞單位疫苗。Toth等[14]分別構建了表達不同WEEV糖蛋白（整個E1蛋白、E1蛋白結構域、E26KE1多聚蛋白前體和E2-E1嵌合蛋白）的重組桿狀病毒，并同時研究不同桿狀病毒啟動子對誘導目的蛋白表達的影響。結果表明，目的蛋白的性質和啟動子的類型均會影響重組蛋白表達的產(chǎn)量和質量。采用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備的這些重組蛋白的免疫保護效果尚待動物實驗進行評價。

4 嵌合體疫苗

近年來，辛德畢斯病毒（sindbis virus,SINV）被成功用作表達高致病性甲病毒屬腦炎病毒結構蛋白的表達載體。Atasheva等[7]利用SINV載體首先構建了第一代嵌合體病毒SIN/CO92，其結構蛋白來自WEEV CO92-1356株，非結構蛋白均來自SINV AR339株。嵌合重組病毒可在哺乳動物和蚊蟲細胞內高效復制，并對6周齡小鼠無致病性。動物免疫實驗顯示：高劑量（5 log10PFU）的SIN/CO92嵌合體病毒免疫小鼠能有效抵抗致死劑量的WEEV攻擊，低劑量（≤4.5 log10PFU）嵌合體病毒免疫時其保護率為50%～60%。此外，Atasheva等[7]還構建了第二代嵌合體病毒IN/SIN/McM和SIN/EEE/McM，其結構蛋白來自WEEVMcMillan株，但其編碼RNA結合結構域的衣殼蛋白N-末端則分別來自SINV或東方馬腦炎病毒（eastern equine encephalitis virus,EEEV）FL93-939株，非結構蛋白均來自 SINV AR339株。安全性和免疫原性實驗結果顯示，部分小鼠在SIN/SIN/McM嵌合體病毒免疫后發(fā)病并死亡，提示該嵌合體病毒毒力強；與此相反，SIN/EEE/McM嵌合體病毒則呈現(xiàn)出高免疫原性和弱毒性，而且WEEV攻擊后的免疫小鼠保護率為100%。

Schoepp等[15]采用反向遺傳技術，拯救獲得了重組WEEV和EEEV的嵌合體病毒。該嵌合體病毒基因組5'末端的2/3來自于WEEV，編碼非結構蛋白；3'末端的1/3來自于EEEV，編碼結構蛋白。與母本病毒（WEEV和EEEV）相比，該嵌合體病毒的毒力顯著降低，其免疫小鼠后可有效抵抗致死劑量的EEEV攻擊，但不能抵抗致死劑量的WEEV攻擊。

5 重組活載體疫苗

5型人腺病毒（human adenovirus type 5,HAd5）載體也被應用于WEE新型疫苗的研究。Wu等[16]利用HAd5載體構建了表達WEEV 71V-1658株E3-E2-6K-E1結構蛋白的重組病毒Ad5-WEEV。小鼠實驗結果表明：Ad5-WEEV免疫小鼠1次不僅可100%抵抗致死劑量的同源WEEV（71V-1658株）攻擊，還可有效抵抗致死劑量的異源病毒（CBA87）攻擊。此外，1次免疫后13周，免疫小鼠仍具有有效抵抗力。Ad5-WEEV可作為WEE暴發(fā)或WEEV生物襲擊時的候選應急疫苗[6]。然而，作為重組活載體疫苗，人體內已經(jīng)存在的腺病毒抗體產(chǎn)生的抗載體免疫以及腺病毒本身的安全性仍須進一步評價。

6 DNA疫苗

Nagata等[17]制備了表達WEEV 71V-1658株結構蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的DNA疫苗pVHX-6。4次免疫后，同源病毒株攻擊時免疫小鼠受到100%保護，然而該疫苗對異源病毒株的攻擊僅能提供50%～62%的保護。進一步研究表明，該DNA疫苗免疫不能誘導機體產(chǎn)生高水平中和抗體，但能誘導產(chǎn)生較強的E1和E2抗原特異性T細胞免疫應答。

為進一步研究pVHX-6的哪一種編碼蛋白與保護性免疫相關，Gauci等[18]構建了pE3-E2-6K-E1、pE3-E2和p6K-E1 3種不同的DNA疫苗。動物實驗結果顯示：3次免疫后，p6K-E1、pE3-E2-6K-E1和pVHX-6免疫小鼠抗同源病毒株的保護率為100%，當用異源病毒株CBA87攻擊時僅部分免疫小鼠受保護；用異源病毒株Fleming攻擊時，pE3-E2-6K-E1免疫小鼠的保護率為100%，pVHX-6免疫小鼠為50%，p6K-E1免疫小鼠為0。此外，pE3-E2免疫小鼠對WEEV同源病毒株或異源病毒株的攻擊均無保護力。其免疫保護缺失的原因可能是因為6K基因片段的缺失，而這個基因片段對于蛋白的正確折疊起著至關重要的作用。

7 小 結

隨著免疫學和分子生物學技術的飛速發(fā)展，研究者不斷嘗試開發(fā)新型WEE疫苗，且許多疫苗已在小鼠模型中被證實安全有效，在下一步進入人體試驗前可先用馬模型進行評價。近年來，WEE不僅在北美廣泛傳播，而且正在歐洲國家逐步擴散，加之存在的WEE跨國傳播和我國存在WEE暴發(fā)流行的可能性，我國WEE新型疫苗的研究迫在眉睫。

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