林麗飛，唐寶林，羅 冰，王傳銘，金 秋，劉艷紅，張燦邦

(1 云南紅河學(xué)院 云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自661100；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，云南 昆明650201；3 建水縣臨安鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 建水654399)

He-Ne激光輻照對燈盞花組培體系的影響

林麗飛1，2，唐寶林3，羅 冰1，王傳銘1，金 秋1，劉艷紅1，張燦邦1

(1 云南紅河學(xué)院 云南省農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自661100；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，云南 昆明650201；3 建水縣臨安鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 建水654399)

【目的】 研究He-Ne激光輻照不同時間對燈盞花組織培養(yǎng)的影響，為燈盞花的開發(fā)利用提供參考。【方法】 以燈盞花的種子、無菌培養(yǎng)苗、葉片、愈傷組織及芽為材料，用He-Ne激光輻照不同時間(種子分別為0(CK)，0.5，1，5，10 min；葉片分別為0(CK)，2，4，6，8 min；愈傷組織分別為0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽分別為0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根分別為0(CK)，0.5，1，2 min)，分析He-Ne激光輻照對各組織的影響，篩選最佳輻照時間?！窘Y(jié)果】 He-Ne激光輻照1 min能夠提高燈盞花種子活力；誘導(dǎo)愈傷組織初期，較適宜的輻照時間是2 min，繼代后以輻照8 min的愈傷組織生長最好；愈傷組織增殖培養(yǎng)時，輻照4 min效果最佳；誘導(dǎo)芽輻照3 min較適宜；生根培養(yǎng)以輻照2 min較好。【結(jié)論】 一定量的He-Ne激光能夠提高燈盞花種子的萌發(fā)率、出愈率及愈傷組織誘導(dǎo)芽和生根效果。

He-Ne激光；燈盞花；組織培養(yǎng)；生理指標

燈盞花學(xué)名短葶飛蓬[Erigeronbreviscapus(Vaniot) Hand.-Mazz]，屬菊科(Compositae) 飛蓬屬(Erigeron)植物，全草入藥，中藥名“燈盞細辛”，已入《中華人民共和國藥典》，自被1974年出版的《云南省藥品標準》收錄以來，燈盞花被云南省制藥工業(yè)廣泛用作制藥原料，但燈盞花種子癟粒多，繁殖系數(shù)低，難以滿足市場需求。

激光誘變于20世紀60年代初興起， 并在水稻、豆類、花生等許多植物上都取得了重要的進展[1-5]。研究表明，激光輻照可提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢等，并可改善植物葉片葉綠素含量，提高種子活性，增強光合作用強度和一些生物酶活性，有利于植物生長，從而達到增產(chǎn)的目的[6-13]。當(dāng)激光作用于生物組織時，在波長、照射時間、能量密度、功率等參量中，照射時間是決定性參量[14]。目前有關(guān)激光對燈盞花影響的研究鮮見報道[15]。因此，本試驗用He-Ne 激光器，以不同的誘變時間處理燈盞花種子及脫分化組織，選育出了優(yōu)良細胞系，并對其生理指標進行測定，篩選適宜的照射劑量，以期為燈盞花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

燈盞花種子購于紅河千山生物資源公司，手工揀除其中不飽滿的種子和絨毛；燈盞花無菌培養(yǎng)苗、葉片、愈傷組織及芽來自于紅河學(xué)院組培室，培養(yǎng)條件為：溫度(25±2) ℃ ，光照時間16 h/d，光照強度1 500～3 000 lx。

所用儀器：He-Ne激光器(南京教學(xué)儀器設(shè)備廠)，TU-1901型；OHAUS-AR1140電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。激光器參數(shù)為：波長632.8 nm(電源型號IN-TTL)，光斑直徑80 mm，功率1.2 mW，輻照裝置如圖1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒與培養(yǎng)基的制備 材料消毒與培養(yǎng)基制備參照文獻[16]的方法進行。(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；(2)增殖培養(yǎng)基：MS+2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；(3)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg/L+10%香蕉汁；(4)生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.3 mg/L。

1.2.2 輻照劑量的優(yōu)化 選取飽滿燈盞花種子及接種好的外植體，用He-Ne激光進行照射處理，輻照時間分別為種子0(CK)，0.5，1，5，10 min；葉片0(CK)，2，4，6，8 min；愈傷組織0(CK)，1，2，3，4，5，6，7，8 min；分化芽0(CK)，0.5，1，2，3，6 min；根0(CK),0.5,1,2 min。輻照時先用反光鏡反光，再經(jīng)過擴束鏡使光斑擴大，然后將種子平鋪于光斑內(nèi)進行照射處理[17]。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 種子萌發(fā)率 將經(jīng)激光輻照的燈盞花種子接種到MS培養(yǎng)基上，每天觀察種子的萌發(fā)情況，計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽速率、發(fā)芽指數(shù)等相關(guān)指標[18-19]，測量數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進行分析。

發(fā)芽率=正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽勢=規(guī)定時間(7 d)內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽速率=∑(Gt×Dt)/發(fā)芽率(式中Gt指7 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)，Dt指發(fā)芽日數(shù))；發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt。

1.3.2 愈傷組織出愈率、增長率及誘導(dǎo)芽 將經(jīng)激光輻照處理的葉片接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導(dǎo)，培養(yǎng)16和30 d時觀察愈傷組織的生長情況，計算出愈率。出愈率=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

將試驗中輻照時間為0(CK)誘導(dǎo)出的愈傷組織0.5 g接種到增殖培養(yǎng)基上進行激光輻照，培養(yǎng)30 d時測定愈傷組織鮮質(zhì)量，計算愈傷組織鮮質(zhì)量增長率。鮮質(zhì)量增長率=[(培養(yǎng)后的鮮質(zhì)量-接種時的鮮質(zhì)量)/接種時的鮮質(zhì)量]×100%。

將經(jīng)過增殖培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，用激光照射0(CK)，0.5，1，2，3，6 min，培養(yǎng)10 和30 d時觀察芽生長情況。

1.3.3 生根數(shù) 將經(jīng)激光輻照形成的無根苗接種到生根培養(yǎng)基上，30 d后觀察生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 He-Ne激光輻照對燈盞花種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，He-Ne激光輻照不同時間對燈盞花種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽速率都會產(chǎn)生影響，隨輻照時間延長，上述指標均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且均在輻照1 min時達到最大值。He-Ne激光輻照處理燈盞花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速率均高于對照，說明He-Ne激光輻照有利于提高燈盞花種子的活力，最佳輻照時間為1 min。

2.2 He-Ne激光輻照對燈盞花葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

將經(jīng)He-Ne激光輻照的燈盞花葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果見表2和圖2。由表2和圖2可以看出，培養(yǎng)16 d后，均有少量愈傷組織形成，從出愈率看表現(xiàn)為2 min>0 min>8 min>6 min>4 min，從長勢上來看表現(xiàn)為2 min>8 min>0 min>6 min>4 min，說明愈傷組織誘導(dǎo)初期較好的輻照時間為2 min；培養(yǎng)30 d后，輻照0(CK)，2，8 min 的出愈率都達到100%，長勢較好的為輻照8 min處理，經(jīng)過繼代后愈傷組織的增長量最多，幾乎布滿整個瓶子，表明繼代后經(jīng)過8 min輻照的愈傷組織長勢最好。

2.3 He-Ne激光輻照對燈盞花愈傷組織增長率的影響

從表3可以看出，繼代后的燈盞花愈傷組織經(jīng)He-Ne激光輻照后，愈傷組織的增長呈現(xiàn)不同的趨勢。輻照4 min的愈傷組織鮮質(zhì)量增長率最大，為80.8%，其次為輻照1 min處理，為75.8%，表明4 min的輻照時間對燈盞花愈傷組織的增殖促進作用最強。從表3還可以看出，輻照1，2，4和7 min愈傷組織的鮮質(zhì)量增加量均高于CK，其中以輻照4 min的愈傷組織鮮質(zhì)量增加量最大，為2.11 g，其次為1 min處理，達1.57 g。上述結(jié)果表明，He-Ne激光輻照4 min有利于愈傷組織的增殖培養(yǎng)。

2.4 He-Ne激光輻照對燈盞花愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

從圖3可以看出，對輻照后的愈傷組織誘導(dǎo)芽，培養(yǎng)10 d后，輻照時間為0(CK)與3 min的愈傷組織均有芽形成，從芽的長勢來看，CK優(yōu)于3 min處理，從形成的新愈傷組織來看，0.5 min輻照較好，輻照6 min也有新的愈傷組織形成，但是出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象。從表4可以看出，培養(yǎng)30 d之后，在輻照3 min處理下芽的長勢優(yōu)于0 min；從愈傷組織的生長看，輻照2 min的有褐化出現(xiàn)，輻照6 min的愈傷組織較緊密，而輻照0.5 min的則只有新的愈傷形成，且形成的愈傷從疏松程度和增殖量來看都比其他處理好。說明He-Ne激光輻照對燈盞花愈傷組織分化有利，3 min的照射時間有利于芽的形成。

2.5 He-Ne激光輻照對燈盞花生根培養(yǎng)的影響

將經(jīng)He-Ne激光輻照的愈傷組織形成的小植株誘導(dǎo)生根，30 d后輻照2 min處理的長根最多，根為乳白色，細長，幾乎布滿整個瓶底，植株生長旺盛，長葉較多，長勢較好；輻照1 min的長勢也好，但次于2 min處理；而輻照0.5 min處理的根短而粗壯，植株生長旺盛，其中有幾片葉子較寬、厚，與其他葉片不同(圖4)?？傮w來看，以輻照2 min的長勢最好。

3 討 論

He-Ne激光輻照種子后，種子及其萌發(fā)的植物體能產(chǎn)生各種各樣的非基因變異性表型效應(yīng)[14]。本研究結(jié)果表明，He-Ne激光輻照燈盞花種子不同時間后，燈盞花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽速率均高于對照，說明He-Ne激光輻照有利于提高燈盞花種子的活力，輻照最佳時間為1 min，這與張舉成等[15]的研究結(jié)果一致。

用He-Ne激光輻照處理的葉片誘導(dǎo)愈傷組織，從出愈率及長勢來看，愈傷組織誘導(dǎo)初期輻照2 min誘導(dǎo)效果好，而繼代后(30 d)則以輻照8 min的葉片所誘導(dǎo)的愈傷組織長勢最好，增殖最快。

在燈盞花愈傷組織的增殖培養(yǎng)中，經(jīng)He-Ne激光輻照4 min后的愈傷組織較有利于增殖培養(yǎng)；有利于燈盞花愈傷組織分化芽的輻照時間為3 min；生根培養(yǎng)的輻照時間2 min較好。

[1] 周有院，雷德柱，李友明.He-Ne激光對植物組織培養(yǎng)中根、芽分化的影響 [J].激光雜志，1993，14(3)：147-152.

Zhou Y Y，Lei D Z，Li Y M.The effect of He-Ne laser to the root an d shoot differentiation in plant tissue culture [J].Laser Journal，1993，14(3)：147-152.(in Chinese)

[2] 邢少武，蔡玉紅.不同波長激光照射小麥種胚的生物學(xué)效應(yīng) [J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，22(3)：8-11.

Xing S W，Cai Y H.The biological effects of wheat embryo irradiated by different wave length of laser [J].Journal of Agricultural University of Hebei，1999，22(3)：8-11.(in Chinese)

[3] 張建東，陳怡平，王勛陵.CO2激光處理對大豆種子萌發(fā)及生理的影響 [J].西北植物學(xué)報，2004，24(2)：221-225.

Zhang J D，Chen Y P，Wang X L.Effects of CO2laser treatment on seeds germination and physiology of soybean [J].Acta Bot Boreal-Occident Sin，2004，24(2)：221-225.(in Chinese)

[4] 錢曉凡，周凌云.低強度He-Ne激光照射水稻的顯微拉曼散射研究 [J].激光雜志，2003，24(4)：81-82.

Qian X F，Zhou L Y.Studies of low energy He-Ne laser irradiated rice seeds by micro-Raman Spectroscopy [J].Laser Journal，2003，24(4)：81-82.(in Chinese)

[5] 李耀維，張素梅.He-Ne激光對白術(shù)種子萌發(fā)與幼苗生長的影響 [J].應(yīng)用激光，1996，16(1)：37-38.

Li Y W，Zhang S M.Effeets of He-Ne laser on seeds sprout and seedling growth ofAtraetylodesmaerocephala[J].Applied Laser，1996，16(1)：37-38.(in Chinese)

[6] 吳俊林，張宗權(quán)，劉志賢.He-Ne激光作用油松種子生物效應(yīng)的物理模型及其意義 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2002，30(2)：136-138.

Wu J L，Zhang Z Q，Liu Z X.The physical model and its significance of the biological effect of He-Ne laser producing the Chinese pine seeds [J].Jour of Northwest A&F University:Nat Sci Ed，2002，30(2)：136-138.(in Chinese)

[7] 陳怡平，李 麗，王勛陵，等.He-Ne激光和KT對小麥種子萌發(fā)與幼苗生長的影響 [J].激光生物學(xué)報，2002，11(6)：412-416.

Chen Y P，Li L，Wang X L，et al.The effects of He-Ne laser and KT treatment on the seeds germination and growth of wheat [J].Acter Laser Biology Sinica，2002，11(6)：412-416.(in Chinese)

[8] 郭君瑜，張 琴，韓 榕.He-Ne激光對增強UV-B輻射小麥幼苗葉綠體的影響 [J].植物研究,2009，29(2)：204-208.

Guo J Y，Zhang Q，Han R.Effects of He-Ne laser on chloroplast of wheat seedling exposed to enhanced UV-B radiation [J].Bulletin of Botanical Research，2009，29(2)：204-208.(in Chinese)

[9] 陳怡平，王勛陵.He-Ne激光處理對菘藍幼苗光合作用的影響 [J].激光技術(shù)，2004，28(1)：42-44.

Chen Y P， Wang X L.Effects of He-Ne laser treatment seeds ofIsatisindigoticaon photosynthesis of seedlings [J].Laser Technology，2004，28(1)：42-44.(in Chinese)

[10] 張 娟，王小花，郝金花，等.He-Ne激光對UV-B輻射小麥幼苗糖代謝的影響 [J].激光生物學(xué)報，2008，17(5)：577-581.

Zhang J，Wang X H，Hao J H，et al.Effects of He-Ne laser on sugar metabolism of wheat seedling exposed to ultraviolet-B radiation [J].Acter Laser Biology Sinica，2008，17(5)：577-581.(in Chinese)

[11] 徐 莉，蔡素雯，王永輝，等.He-Ne激光輻射對玉米幼苗糖代謝的影響 [J].應(yīng)用激光，2000，20(1)：21-23.

Xu L，Cai S W，Wang Y H，et al.The effect of He-Ne laser irradiation of glycometabolism of corn seedlings [J].Applied Laser，2000，20(1)：21-23.(in Chinese)

[12] 蔡素雯，齊 智，馬小來，等.He-Ne激光對玉米幼苗可溶性蛋白合成的影響 [J].中國激光，2000，27(3)：284-288.

Cai S W，Qi Z，Ma X L，et al.The effect of He-Ne laser irradiation on soluble protein synthesis of corn seedling [J].Chinese Journal of Lasers，2000，27(3)：284-288.(in Chinese)

[13] 徐 莉，蔡素雯.He-Ne 激光輻射對玉米幼苗α-淀粉酶和磷酸化酶的影響 [J].應(yīng)用激光，2002，22(6)：569-572.

Xu L,Cai S W.Research on the effect of He-Ne laser irradiation on α-amylase and phosphorylase of corn seedlings [J].Applied Laser，2002，22(6)：569-572.(in Chinese)

[14] 姚翠萍，張鎮(zhèn)西.激光與組織的相互作用 [J].激光生物學(xué)報，1999，8(2)：102-108.

Yao C P，Zhang Z X.Interaction of laser with tissue [J].Acter Laser Biology Sinica，1999，8(2)：102-108.(in Chinese)

[15] 張舉成，張黎黎，李 河，等.He-Ne和CO2激光對燈盞花種子影響的研究 [J].光電子·激光，2012，23(5)：1011-1015.

Zhang J C，Zhang L L，Li H，et al.Research on the effect of He-Ne and CO2laser on the seed ofErigeronbreviscapus(vant.)Hand.-Mazz [J].Journal of Optolectronics·Laser，2012，23(5)：1011-1015.(in Chinese)

[16] 林麗飛，陶發(fā)清，劉春國，等.藥用植物燈盞花組織培養(yǎng)體系的建立 [J].西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，31(12)：82-86.

Lin L F，Tao F Q，Liu C G，et al.Establishment of an optimized tissue culture system forErigeronbreviscapus[J].Journal of Southwest University:Natural Science Edition,2009，31(12)：82-86.(in Chinese)

[17] 曹 碩，楊 光.低劑量激光輻射對蔬菜生長的刺激效應(yīng) [J].遼寧大學(xué)學(xué)報，2003，30(4)：338-340.

Cao S，Yang G.Effects of low dose of laser on vegetable growth [J].Journal of Liaoning University，2003，30(4)：338-340.(in Chinese)

[18] 畢辛華，戴心維.種子學(xué) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1993：34-38.

Bi X H，Dai X W.Seeds [M].Beijing：China Agriculture Press，1993：34-38.(in Chinese)

[19] 李振輪，何 凱，石紋豪，等.外源維生素浸種對甜玉米種子萌發(fā)和幼苗生長的影響 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，42(6)：48-54.

Li Z L，He K，Shi W H，et al.Effects of seed soaking with exogenous vitamin on seed germination and seedling growth of sweet corn [J].Journal of Northwest A&F University：Nat Sci Ed，2014，42(6)：48-54.(in Chinese)

Influence of He-Ne laser on tissue culture ofErigeronbreviscapus

LIN Li-fei1,2,TANG Bao-lin3,LUO Bing1,WANG Chuan-ming1, JIN Qiu1,LIU Yan-hong1,ZHANG Can-bang1

(1KeyLabaoratoryforCropHighQualityCutltivationandSecuriyControlofYunnanProvince,YunnanHongheUniversity,Mengzi,Yunnan661100,China;2CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China;3ExtensionCentreofAgro-TechniqueofLin’an,Jianshui,Yunnan654399,China)

【Objective】 Experiment was carried out to study the effects of He-Ne laser on tissue culture system ofErigeronbreviscapusand improveE.breviscapusdevelopment and utilization.【Method】 Seeds,leaves,callus and roots were used as material and different irradiation times were set up.The irradiation times for germination of seed were 0(CK),0.5,1,5,and 10 min,for inducement of leaves were 0(CK),2,4,6,and 8 min,for callus were 0(CK),1,2,3,4,5,6,7,and 8 min,for callus were 0(CK),0.5,1,2,3,and 6 min while for rooting were 0(CK),0.5,1,and 2 min.Then effects of He-Ne laser irradiation were analyzed to select optimum irradiation times.【Result】 The suitable irradiation times for improving seed vigor,early to callus,successive culture to callus,during the multiplication culture,bud inducement,and root were 1 min,2 min,8 min,4 min,3 min,and 2 min,respectively.【Conclusion】 A certain dose of irradiation was suitable to improve rate of germination and growth of callus,shot,and root.

He-Ne laser;Erigeronbreviscapus;tissue culture;physiological indexes

2014-06-26

國家自然科學(xué)基金項目(61068003)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2009ZC131M)；第一批紅河學(xué)院中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項目(2010PY0104)；紅河學(xué)院碩士點植物保護一級學(xué)科建設(shè)項目

林麗飛(1978-)，女，云南建水人，副教授，在讀博士，主要從事植物保護、植物細胞工程研究。 E-mail:llf_biology2@126.com

張燦邦(1965-)，男，云南紅河人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事光學(xué)物理學(xué)研究。E-mail:cbzhanguoh@gmail.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.021

S567

A

1671-9387(2015)07-0207-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.021.html