吳曉康，馬超峰，余鵬博，王香玲，韓 蕾，李妙羨，徐紀(jì)茹

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004；2. 西安市疾病預(yù)防 控制中心，陜西西安 710054；3. 陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西西安 710054； 4. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)系，陜西西安 710061)

◇基礎(chǔ)研究◇

2型糖尿病患者腸道乳酸菌屬和消化鏈球菌屬 定量研究及其意義

吳曉康1，馬超峰2，余鵬博3，王香玲1，韓 蕾4，李妙羨1，徐紀(jì)茹4

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004；2. 西安市疾病預(yù)防 控制中心，陜西西安 710054；3. 陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西西安 710054； 4. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)系，陜西西安 710061)

目的 對(duì)2型糖尿病患者與健康人腸道乳酸菌屬和消化鏈球菌屬進(jìn)行定量分析，探討兩組人群腸道菌群的差異。方法 提取腸道菌群總DNA，利用菌屬特異性引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，制作菌屬標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量分析兩種優(yōu)勢菌屬在糖尿病患者和健康人群中的含量。結(jié)果 與健康對(duì)照組相比，2型糖尿病組腸道消化鏈球菌的數(shù)量均顯著減少，而乳酸菌屬的數(shù)量兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 熒光定量PCR方法可作為研究腸道菌群的一種準(zhǔn)確、敏感的檢測方法；糖尿病患者腸道優(yōu)勢菌屬發(fā)生變化，提示腸道優(yōu)勢菌群可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。

2型糖尿?。荒c道菌群；乳酸菌屬；消化鏈球菌；定量分析

腸道菌群在代謝性疾病發(fā)生中的作用已經(jīng)成為近期研究的熱點(diǎn)。很多學(xué)者現(xiàn)在已經(jīng)把腸道菌群看作生物體的一個(gè)“器官”[1]。這個(gè)復(fù)雜的微生物群體由眾多菌屬組成，而某一菌屬有可能在疾病發(fā)生中起到真正作用。因此，定量分析腸道菌屬可能會(huì)發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生最相關(guān)的病因。課題組已對(duì)2型糖尿病患者和健康人群部分腸道優(yōu)勢菌屬(普通擬類菌、柔嫩梭菌、雙歧桿菌)進(jìn)行了定量分析。本實(shí)驗(yàn)則對(duì)糖尿病患者與健康人腸道乳酸菌屬和消化鏈球菌屬進(jìn)行定量分析，比較兩組人群腸道菌群的差異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收集2型糖尿病患者的糞便樣品。病例篩選標(biāo)準(zhǔn)為：①患2型糖尿病有1年以上病史；②采樣前1月內(nèi)未使用抗生素、益生菌或者益生元等制品；③近1月內(nèi)無腹瀉、痢疾等胃腸道疾病。患者中男性10名、女性6名，年齡范圍52～65歲，共計(jì)16例(以下簡稱糖尿病組)。對(duì)所有患者一般情況進(jìn)行調(diào)查，包括：年齡、性別、身高、體質(zhì)量、個(gè)人健康情況(急、慢性疾病和血糖水平)、生活習(xí)慣(體育鍛煉、飲食習(xí)慣等)。另從社區(qū)收集健康志愿者的糞便樣品作為對(duì)照，選擇標(biāo)準(zhǔn)：①身體狀況良好；②采樣前1月內(nèi)未使用抗生素、益生菌或者益生元等制品；③近1月內(nèi)無腹瀉、痢疾等胃腸道疾病。健康人中男性4名、女性4名，年齡范圍51～65歲，共計(jì)8例(以下簡稱健康人組)。對(duì)入選的糖尿病患者和健康個(gè)體還要求有相似的飲食習(xí)慣，如以谷類(小麥、稻米)、蔬菜和少量肉食為主，遵守糖尿病患者每日的食量控制，禁食糖類食品等。樣品的采集得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)和本人的知情同意。糞樣用潔凈的樣品杯收集后立即凍存在-80 ℃。

1.2 儀器與試劑 PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 2720)ABI/美國，CFX96TMReal-time定量PCR系統(tǒng)Bio-rad/美國，Nanodrop 2000微量核酸蛋白檢測儀系美國Thermo公司，QIAamp Stool Mini Kit(Cat. no.51504)德國QIAGEN公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Cat. no.D2500-01)系Omega公司，PGMT T載體、EcoRⅠ Promega公司，質(zhì)粒提取試劑盒(Cat. no. D6943-01)北京天根生化科技有限公司，X-gal、IPTG Merck公司，SYBR Green PCR Master Mix TOYOBO公司，Taq酶及緩沖液，MgCl2、三磷酸脫氧核苷(dNTP)Promega公司，引物合成系上海生工生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 糞便樣本菌群總DNA的提取 將糞便標(biāo)本置于冰上，用鋼珠粉碎樣品5 000 r/min，30 s，菌群DNA提取按照QIAGEN QIAamp StoolMini kit(QIAGEN，Hilden，Germany)步驟說明書進(jìn)行，將提取的核酸用NanoPhotometerTM(IMPLEN，Germany)測定其濃度。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制作和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以正常人糞便提取的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，50 μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)1 μL，5 μmol/L上下游引物各2 μL(表1)，DNA模板4 μL，DNATaq酶(5 U/μL)0.4 μL，ddH2O 30.6 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，最終72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，然后在成像分析系統(tǒng)拍照。

制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：將以上2種細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后分別作為目的DNA片段，連接至pGEM-T Easy Vector上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌DH5a中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，得到陽性克隆后，制備質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定及測序正確后，即可作為標(biāo)準(zhǔn)品。同時(shí)測定所提質(zhì)粒濃度，利用Avogadro’s常數(shù)(1摩爾溶液大約有6.022 141 5×10E23拷貝數(shù))計(jì)算出溶液中質(zhì)?？截悢?shù)，為制作標(biāo)準(zhǔn)品原液。

1.3.3 Real-time PCR定量分析 分別將以上2種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，做成6～8個(gè)稀釋度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表不同陽性模板細(xì)菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)代表出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù)(Ct)。利用CFX96 Real-time PCR檢測系統(tǒng) (美國Bio-Rad公司)對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增和定量檢測。Each 20 μL反應(yīng)體系包括：10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix (TOYOBO，Osaka，Japan)，1 μL上下游引物(5 μmol/L)(見表1)，2 μL DNA and 6 μL H2O。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 5 s；退火分別是52 ℃和55 ℃ 10 s；延伸72 ℃ 15 s(采集熒光)，40個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行熔解曲線分析：melt curve 65 ℃→95 ℃，increment 0.5 ℃，5 s。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行采集和評(píng)價(jià)分析，通過軟件得到絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard curve)、熔解曲線(melt curve)的Ct值、對(duì)數(shù)濃度值等數(shù)據(jù)。

表1 實(shí)驗(yàn)中PCR擴(kuò)增所用引物情況

Tab.1 PCR primers used in this study

菌屬引物序列(5'～3')大小(bp)退火溫度文獻(xiàn)消化鏈球菌PSP-1PSP-2AACTCCGGTGGTATCAGATGGGGGCTTCTGAGTCAGGTA26852℃[2]乳酸菌LAA-1LAA-2CTCAAAACTAAACAAAGTTTCCTTGTACACACCGCCCGTCA25055℃[3]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量資料結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布的資料，以中位數(shù)(P25～P75)表示，兩組間差異用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酶切鑒定 對(duì)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒需要進(jìn)行插入片段是否為細(xì)菌DNA的鑒定，采用EcoRⅠ酶切方法，可以看到酶切片段符合腸道細(xì)菌DNA片段(圖1)。

2.1.2 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的測序鑒定 利用測序確定載體插入片段是否為腸道細(xì)菌DNA，將測序結(jié)果利用Genetool軟件進(jìn)行處理，得到目的基因序列，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Ribosomal Database Project-Release10(http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/)比對(duì)，確定測序結(jié)果即為腸道細(xì)菌(圖2、圖3)。

圖1 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒酶切鑒定

Fig.1 Transformed plasmid identified by enzyme digestion

圖中psp泳道上方片段是質(zhì)粒載體，下方是消化鏈球菌酶切片段；LAA泳道上方片段是質(zhì)粒載體，下方是乳酸菌酶切片段(Bif泳道為參照品)。

圖2 乳酸桿菌BLAST比對(duì)結(jié)果

Fig.2 The comparison results ofLactobacillusgenus by BLAST

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 乳酸桿菌 ①擴(kuò)增曲線。標(biāo)準(zhǔn)品原液按10倍的比例稀釋后做定量PCR檢測，得到8.79×108～8.79×103個(gè)拷貝的模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的擴(kuò)增曲線(圖4A)。②標(biāo)準(zhǔn)曲線。按比例稀釋成不同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值為橫軸，反應(yīng)過程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱軸得到該菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，E=92.9%，R2=1.000，Slope=-3.504(圖4B)。③熔解曲線和熔解峰圖。熔解曲線分析為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增(圖4C、D)，熔解溫度為88～88.5 ℃。

2.2.2 消化鏈球菌 ①擴(kuò)增曲線。標(biāo)準(zhǔn)品原液按10倍的比例稀釋后做定量PCR檢測，得到4.58×108～4.58×103個(gè)拷貝的模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的擴(kuò)增曲線(圖5A)。②標(biāo)準(zhǔn)曲線。按比例稀釋成不同拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值為橫軸，反應(yīng)過程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱軸得到該菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，E=99.4%，R2=1.000，Slope=-3.336(圖5B)。③熔解曲線和熔解峰圖。熔解曲線分析為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增(圖5C、5D)，熔解溫度為90～90.5 ℃。

圖3 消化鏈球菌BLAST比對(duì)結(jié)果

Fig.3 The comparison results ofPeptostreptococcusproductusby BLAST

圖4 乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

Fig.4 The graphing results of standard curve of Lactobacillus genus

A:標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線;B:標(biāo)準(zhǔn)曲線;C:標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線;D:標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰圖。

2.3 乳酸菌屬和消化鏈球菌屬檢測結(jié)果 2型糖尿病組與健康對(duì)照組糞便樣品的細(xì)菌定量見表2。與健康對(duì)照組相比，2型糖尿病組腸道消化鏈球菌的數(shù)量均顯著減少(P<0.05)，而乳酸菌屬的數(shù)量兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.29)。

3 討 論

成人糞便中細(xì)菌的80%是由6種優(yōu)勢菌屬構(gòu)成，即擬類菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬和乳酸桿菌屬，每種菌屬又包括許多菌種[2-4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以細(xì)菌16SrRNA基因序列分析技術(shù)為代表的許多不依靠培養(yǎng)的新方法在腸道菌群研究中得到廣泛應(yīng)用。設(shè)計(jì)和選擇16SrRNA基因通用引物或者種屬特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測能更準(zhǔn)確、更敏感地定量腸道總細(xì)菌或者單一的菌屬，可得到菌群中細(xì)菌基因組16SrDNA的絕對(duì)定量值(拷貝數(shù))，已成為研究腸道菌群微生態(tài)學(xué)有力的工具[5]。

圖5 消化鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

Fig.5 The graphing results of standard curve of Peptostreptococcus productus

A:標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線;B:標(biāo)準(zhǔn)曲線;C:標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線;D:標(biāo)準(zhǔn)品熔解峰圖。

表2 糖尿病患者組與健康對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量的比較

Tab.2 Comparison of the number of bacteria between diabetic group and healthy control group

(log copies/g)

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

本研究利用Real-time熒光定量PCR方法對(duì)糖尿病患者和健康人群腸道優(yōu)勢菌屬進(jìn)行定量檢測，旨在發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)下腸道的菌群是否發(fā)生變化，尋找與糖尿病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腸道細(xì)菌。結(jié)果顯示2型糖尿病組消化鏈球菌拷貝數(shù)顯著性降低，提示糖尿病患者腸道部分優(yōu)勢菌屬發(fā)生改變。消化鏈球菌是人體口腔、上呼吸道、腸道和女性生殖道的正常菌群，目前研究其與人體部分組織器官感染有關(guān)，而與2型糖尿病的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)檢測到其含量減少，推測是由于長期高脂飲食誘發(fā)的糖尿病改變了腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)，不合理的飲食導(dǎo)致腸道正常菌屬減少。CANI等[6]用膳食纖維(聚果糖，OFS)特異性的增加高脂飲食喂養(yǎng)的模型小鼠腸道雙歧桿菌含量，結(jié)果表明雙歧桿菌與改善糖耐量、糖誘發(fā)胰島素分泌、使低濃度炎癥好轉(zhuǎn)(降低毒素血癥，血漿脂肪組織的促炎癥因子)呈顯著的正相關(guān)。同時(shí)，代謝性內(nèi)毒素血癥與雙歧桿菌呈負(fù)相關(guān)。ARMOUGOM等[7]為確定不同體質(zhì)量人群腸道菌群的差異，利用Real-time熒光定量PCR方法檢測了擬類菌門、厚壁菌門、乳酸桿菌屬和產(chǎn)甲烷菌，結(jié)果表明肥胖患者擬類菌門顯著降低，而乳酸桿菌屬量顯著高于體質(zhì)量正常者和厭食癥患者；厭食癥患者產(chǎn)甲烷菌量高于體質(zhì)量正常者。此研究表明乳酸桿菌屬、產(chǎn)甲烷菌可能與肥胖和體質(zhì)量變化具有密切關(guān)系。

目前，有關(guān)人體腸道菌群的研究資料相對(duì)較少，而且結(jié)果有所不同，可能是由于不同研究條件、不同的研究方法及腸道菌群生態(tài)特征的復(fù)雜性所致。對(duì)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)及功能的研究也只是剛剛起步，腸道菌群在肥胖癥、2型糖尿病等代謝性疾病中到底哪些菌屬在其中發(fā)揮主要作用，其機(jī)制如何，將有待于后續(xù)不斷深入的研究得以揭示。

總之，本研究定量分析了糖尿病患者和健康人群腸道乳酸桿菌、消化鏈球菌，結(jié)果表明熒光定量PCR方法可準(zhǔn)確、敏感地檢測腸道菌群的含量，了解腸道菌群的組成和分布，是研究腸道菌群生態(tài)學(xué)的一種可靠的實(shí)驗(yàn)方法。與健康對(duì)照人群比較，2型糖尿病患者腸道部分優(yōu)勢菌屬發(fā)生變化，提示腸道菌群可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。

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(編輯 韓維棟)

Significance of the quantitative analysis ofLactobacillusandPeptostreptococcusproductusof gut microbiota in patients with type 2 diabetes

WU Xiao-kang1, MA Chao-feng2, YU Peng-bo3, WANG Xiang-ling1, HAN Lei4, LI Miao-xian1, XU Ji-ru4

(1. Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Center for Disease Control and Prevention of Xi’an, Xi’an 710054; 3. Center for Disease Control and Prevention of Shaanxi Province, Xi’an 710054; 4. Department of Immunology and Pathogenic Biology, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To analyze quantitatively the intestinalLactobacillusgenus andPeptostreptococcusproductusof patients with type 2 diabetes and healthy people to compare the differences of intestinal flora between the two groups of people. Methods The total DNA of intestinal microbiota was extracted. The specific primers of bacterial genus were used for real-time fluorescent quantitative PCR amplification. And bacterial standard and standard curve were made. Then we analyzed quantitatively the content of two predominant bacterial genus in patients with type 2 diabetes and healthy people. Results Compared with that in the healthy controls, the number of the intestinalPeptostreptococcusproductusin the patients with type 2 diabetes was significantly reduced. However, as for the number of intestinalLactobacillusgenus, no significant differences were found between the two groups. Conclusion Real-time PCR can be taken as an accurate and sensitive testing method to study the intestinal microbiota. The changes of the intestinal predominant bacterial genus in patients with diabetes suggest a certain correlation of the intestinal predominant bacterial genus with the occurrence and development of diabetes.

type 2 diabetes mellitus; gut microbiota;Lactobacillus;Peptostreptococcusproductus; quantitative analysis

2014-05-28

2014-07-17

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助 Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities

徐紀(jì)茹. E-mail: xujiru@mail.xjtu.edu.cn

R587.1

A

10.7652/jdyxb201501017

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140919.1821.009.html(2014-09-19)