曹馨月，黃嬡媛，趙 驍，王 敦，馮紀(jì)年

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，植保資源與病害蟲治理教育部重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

蘋果蠹蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的克隆及原核表達

曹馨月，黃嬡媛，趙 驍，王 敦，馮紀(jì)年

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，植保資源與病害蟲治理教育部重點實驗室,陜西 楊凌 712100)

【目的】 獲得蘋果蠹蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的全長序列，并在大腸桿菌BL21(DE3)中融合表達，為探明蘋果蠹蛾雌雄間的信息素交流機制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?提取蘋果蠹蛾觸角總RNA，利用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR擴增技術(shù)獲得CpomPBP2基因的全長序列；通過構(gòu)建原核表達載體pET28a-CpomPBP2對CpomPBP2進行重組表達與檢測；并對融合蛋白pET28a-CpomPBP2進行Western blot鑒定及可溶性鑒定?！窘Y(jié)果】 以蘋果蠹蛾觸角總RNA為模板合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板經(jīng)RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR擴增，得到CpomPBP2基因約3 000 bp的全長序列；測序結(jié)果表明，CpomPBP2基因開放閱讀框長約510 bp，編碼169個氨基酸，預(yù)測的成熟蛋白分子質(zhì)量為16.45 ku，等電點(pI)為5.09。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，融合蛋白CpomPBP2以包涵體形式存在，蛋白分子質(zhì)量約為20 ku。Western blot鑒定結(jié)果顯示，獲得了目標(biāo)蛋白CpomPBP2。用終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h后，可獲得大量融合蛋白?！窘Y(jié)論】 獲得CpomPBP2的全長序列，成功構(gòu)建了CpomPBP2的原核表達載體，經(jīng)Western blot鑒定，CpomPBP2表達正確。

蘋果蠹蛾；蘋果蠹蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅱ基因；基因克隆；原核表達

蘋果蠹蛾(Cydiapomonella)初孵幼蟲從果面的損傷處、花萼或梗洼處蛀入果實，直達果心進行為害，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。目前，對蘋果蠹蛾的防治主要采用化學(xué)殺蟲劑、生物藥劑及人工防除等方法，但這些方法容易導(dǎo)致蘋果蠹蛾的抗藥性增強，并對天敵造成嚴(yán)重威脅，且存在防治效果不明顯、用藥量大等缺點[2-3]，所以需要尋求其他方法控制蘋果蠹蛾。有研究表明，利用低濃度性信息素或相關(guān)化合物干擾蘋果蠹蛾后，能明顯影響其尋找配偶，而該方法已被運用于蘋果蠹蛾的防治中[4]。

蘋果蠹蛾成蟲通過嗅覺覓食及尋找配偶，雌蛾尋找產(chǎn)卵場所也要通過嗅覺來完成。在昆蟲的觸角感受機制中，首先通過氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding protein,OBPs)和氣味分子的相互作用與外界進行信息交流[5]。氣味分子為疏水性物質(zhì)，它通過一定途徑到達受體蛋白，穿過細胞間質(zhì)中的親水性溶液，即昆蟲嗅覺感受器淋巴液，OBPs就存在于親水性溶液中，且濃度很高，OBPs選擇性地與特異氣味分子結(jié)合，將其運送到嗅覺感受器細胞中[6]。在鱗翅目的蛾類中，性信息素由雌蟲分泌，同類群的雄蟲通過專一的選擇性和特異性對其進行分析、檢測，啟動交配過程。在雄蟲觸角中，性信息素結(jié)合蛋白(PBPs)運輸疏水性信息素分子穿過感器淋巴液到膜結(jié)合受體(離子通道)[7-8]，同時保護疏水性信息素分子避免降解酶觸發(fā)的神經(jīng)反應(yīng)，PBPs在不同蛾類中有高度的相似性，超過50%的序列相似[9]。

蘋果蠹蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅱ(Pheromone binding protein 2，CpomPBP2)是氣味結(jié)合蛋白多基因家族的一個分支[10-11]，存在于雄蟲的觸角中，通常僅位于毛型感受器(Trichoidsensilla)中[12]。雄蛾利用性信息素結(jié)合蛋白感受雌蛾發(fā)出的性信息素氣味分子，與其特異性結(jié)合，完成交配。這種雌雄蛾間的信息交流具有專一性，從而形成了種群隔離[13]。為更好地了解PBP2的結(jié)構(gòu)和功能，本研究利用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR擴增技術(shù)獲得CpomPBP2基因的序列全長，并在大腸桿菌中進行融合表達，旨在探明蘋果蠹蛾雌雄間的信息素交流機制，為蘋果蠹蛾的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試蟲源 蘋果蠹蛾老熟幼蟲和蛹采自甘肅省張掖、武威地區(qū)，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)待其羽化后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA (下文所述cDNA均與此相同)，帶回實驗室進行后續(xù)研究工作。

1.1.2 載體與菌株 克隆載體pMD19-T購自Takara(大連寶生物工程有限公司)，表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌菌株TG1和BL21(DE3)由西北農(nóng)林科技大學(xué)昆蟲博物館分子生物學(xué)實驗室提供。

1.1.3 主要試劑 RNAiso Plus Kit(總RNA抽提試劑盒)、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)購自Fermentas公司，T4 DNA連接酶為Promega產(chǎn)品，IPTG、X-gal、抗生素購自西安沃爾森，DNA膠回收試劑盒為美國Zymo公司產(chǎn)品，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國MP Bio公司，HRP-conjugated 6*His-tag Miniclonal Antibody購自Proteintech公司。

1.2 方 法

1.2.1 蘋果蠹蛾觸角總RNA的提取 將蘋果蠹蛾成蟲觸角放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮，充分研磨，再加入適量的RNAiso Plus將樣品完全覆蓋，室溫靜置直至樣品融化。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5 min后，4 ℃、12 000g離心5 min，小心吸取上清，移入新的離心管；加入氯仿(RNAiso Plus體積的1/5)振蕩15 s，室溫靜置5 min;4 ℃、12 000g離心15 min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管，加入等體積的異丙醇，上下顛倒充分混勻，30 ℃靜置10 min，4 ℃、12 000g離心10 min，小心棄去上清，加入經(jīng)DEPC處理的體積分數(shù)75%乙醇l mL(切勿觸及沉淀)，4 ℃、12 000g離心5 min，棄去乙醇，室溫干燥沉淀2～5 min，加入適量的RNase-free水溶解沉淀后于-70 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 用于擴增蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因的引物，選取Willett[14]所提到的為鱗翅目昆蟲PBP基因保守序列設(shè)計的簡并引物。以蘋果蠹蛾cDNA為模板，PCR擴增獲得蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因保守區(qū)片段序列，再以此序列為基礎(chǔ)，用Primer Premier 5.0軟件進行3′-RACE引物設(shè)計。根據(jù)克隆得到的蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因cDNA片段序列，以待擴增的5′末端為方向設(shè)計TAIL-PCR引物(表1)。

1.2.3 cDNA片段的克隆 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以蘋果蠹蛾觸角總RNA為模板合成cDNA第一鏈，以其為模板，利用PF1和PR2引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系共25 μL：10×PCR Buffer(Mg2+Free) 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模版適量，TaqDNA聚合酶(5 U/μL ) 0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后于-20 ℃保存。

1.2.4 3′-RACE PCR擴增 以蘋果蠹蛾觸角總RNA為模板，利用3′-RACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已測序驗證的蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因保守區(qū)片段序列設(shè)計的特異性引物GSP1、GSP2，分別用特異性上游引物和下游錨定引物L(fēng)UPM、SUPM(表1)配對進行巢氏PCR擴增。

第1次 PCR：PCR 反應(yīng)體系共25 μL，內(nèi)含10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，上游引物GSP1(10 μmol/L)1 μL，下游引物L(fēng)UPM(10 μmol/L)1 μL，cDNA模板適量，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

第2次 PCR(巢氏PCR)：PCR 反應(yīng)體系共25 μL，內(nèi)含10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，上游引物GSP2(10 μmol/L)1 μL，下游引物SUPM(10 μmol/L)1 μL，第1次 PCR產(chǎn)物1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，67 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 5′ TAIL-PCR擴增 根據(jù)克隆得到的蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因cDNA片段序列，以基因組DNA為模板(基因組DNA的提取采用Biomiga公司生產(chǎn)的昆蟲gDNA小量提取試劑盒)，以待擴增的5′末端為方向設(shè)計3條嵌套的特異性引物RB0、RB1、RB2和TRB0、TRB1、TRB2，引物RB1設(shè)計位置在RB0內(nèi)側(cè)，RB2位于RB1內(nèi)側(cè)，這3條引物分別為3輪反應(yīng)的下游引物。引物L(fēng)AD1、LAD2、LAD3和LAD4為上游簡并引物[15]，用于預(yù)擴增的4個平行反應(yīng)；AC1[15]作為第1和第2輪擴增反應(yīng)的上游引物(表1)。TRB0、TRB1、TRB2嵌套方式及上游引物等均與RB0、RB1、RB2相同。

TAIL-PCR預(yù)擴增反應(yīng)：反應(yīng)體系共20 μL,內(nèi)含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.0 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，任1種LAD引物(20 μmol/L)1 μL，引物RB0(10 μmol/L)1 μL，DNA模板1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O補足至20 μL。

第1輪反應(yīng)：反應(yīng)體系共25 μL，內(nèi)含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，引物AC1(10 μmol/L)1 μL，引物RB1(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋50倍)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補足至25 μL。

第2輪反應(yīng)：反應(yīng)體系共25 μL，內(nèi)含10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mix(各2.5 mmol/L)2 μL，引物AC1(10 μmol/L)1 μL，引物RB2(10 μmol/L)1 μL，DNA模板(上一輪擴增產(chǎn)物稀釋10倍)1 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補足至25 μL。TAIL-PCR反應(yīng)條件參考Liu等[15]的方法。TRB0、TRB1、TRB2反應(yīng)條件和體系與RB0、RB1、RB2相同。

將2次TAIL-PCR擴增所得基因序列與RT-PCR和3′ RACE擴增獲得的部分基因序列進行拼接，得到CpomPBP2基因DNA全長序列，利用拼接的全長序列設(shè)計擴增CpomPBP2基因全長的引物QCF、QCR(表1)，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，并將PCR產(chǎn)物純化、克隆，對經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定為陽性的克隆進行測序。

1.2.6 蘋果蠹蛾P(guān)BP2編碼框基因的克隆 以cDNA為模板，用帶有酶切位點的引物CpomPBP2 F、CpomPBP2 R(表1)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，其中ddH2O 15.3 μL，dNTP Mix(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，10×PCR Buffer (Mg2+Free)2.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，割膠回收目的條帶并純化，純化過程按照DNA膠回收試劑盒說明書進行。將回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見Takara公司pMD19-T載體說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞TG1中，涂板于LB固體培養(yǎng)基(含Amp 100 μg/mL，IPTG 24 μg/mL，X-gal 20 μg/mL)，在37 ℃反應(yīng)12 h，進行藍白斑篩選。挑取陽性克隆(白斑)進行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。將部分菌液送上海桑尼生物科技有限公司進行測序鑒定，剩余菌液分裝加入體積分數(shù)20%～30%甘油于-80 ℃保存。

1.2.7 原核表達載體pET28a-CpomPBP2的構(gòu)建 將鑒定正確的陽性克隆pMD19-CpomPBP2在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，pET-28a(+)在含Kana(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃過夜培養(yǎng)。CaCl2堿裂解法分別提取質(zhì)粒DNA進行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。用T4 DNA連接酶在22 ℃連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后涂布于含Amp(100 μg/mL)的固體LB培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)12 h。藍白斑篩選獲得目的基因原核表達載體pET28a-CpomPBP2，經(jīng)菌液PCR、酶切鑒定后，再送上海桑尼生物科技有限公司進行測序鑒定，將鑒定正確者轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中進行原核表達。

1.2.8 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的誘導(dǎo)表達及檢測 將含有pET28a-CpomPBP2的BL21(DE3)菌液在LB液體培養(yǎng)基(含Kana)中37 ℃過夜培養(yǎng)，以體積比1∶50的量加入到新的LB液體培養(yǎng)基(含Kana)中振蕩，培養(yǎng)至OD值為0.5～0.7，加入IPTG使其終濃度分別為0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L，于37 ℃培養(yǎng) 6～8 h。確定最佳誘導(dǎo)濃度后，以最佳IPTG誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)菌液8 h，每隔2 h取1次樣，以確定最佳誘導(dǎo)時間。以最佳誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)pET28a(+)和BL21(DE3)。

將上述經(jīng)不同濃度IPTG和不同時間誘導(dǎo)的樣品按每個樣品1.5 mL離心收集菌體，用PBS洗滌2次后，用40 μL PBS重懸，以體積比1∶4加入5×SDS-PAGE樣品緩沖液，變性處理后經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測。電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色，檢測蛋白是否表達及其表達量。

1.2.9 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的Western blot鑒定 因pET28a(+)含有6個His-tag組氨酸標(biāo)簽，可進行抗組氨酸的Western blot鑒定。將SDS-PAGE凝膠用半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將NC膜置于封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST)中4 ℃過夜。用TBST緩沖液洗膜后，以體積比1∶5 000的量加入辣根過氧化物酶HRP作為抗體，孵育1 h，用DAB使膜顯色。

1.2.10 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的可溶性鑒定 取優(yōu)化條件下誘導(dǎo)的融合蛋白pET28a-CpomPBP2菌液,經(jīng)反復(fù)凍融和超聲波破碎，離心后分別收集上清和沉淀，沉淀用PBS洗滌后重懸，制成可溶性和不可溶性蛋白樣品，用SDS-PAGE進行電泳檢測，以明確融合蛋白的可溶性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因cDNA和內(nèi)含子的克隆與序列分析

以蘋果蠹蛾觸角總RNA為模板合成cDNA第一鏈，然后以cDNA第一鏈為模板，利用簡并引物PF1和PR2進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示擴增出了長度約為270 bp的目的條帶(圖1a)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆、測序獲得了長度為276 bp的片段。利用NCBI的Blast工具進行同源性檢索，發(fā)現(xiàn)由cDNA片段所推導(dǎo)的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲PBP2的同源性很高，并且含有5個保守的半胱氨酸(Cysteine，Cys)位點(全長序列應(yīng)具有6個)，具有昆蟲性信息素結(jié)合蛋白基因的典型特征，證明獲得的cDNA序列為蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因片段，命名為CpomPBP2。

圖1 蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因cDNA中間片段(a)、3′端(b)、5′端(c)和全長(d)的PCR擴增結(jié)果
M.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；a：1.陰性對照；2.PBP2基因片段克隆; b：1.RACE巢氏PCR擴增產(chǎn)物;c：引物RB1、RB2、TRB1和TRB2的TAIL-PCR擴增結(jié)果;d：1.以DNA為模板
Fig.1 PCR amplification of middle segment (a),3′ end (b),5′ end (c) and complete sequence (d) of full length cDNA ofCydiapomonellaPBP2 gene
M.DNA Marker;a:1.Sterile water as negative control,2.Cloning of CpomPBP2 fragment;b:1.3′ RACE nested PCR amplification;c:TAIL-PCR products of RB1,RB2,TRB1 and TRB2;d:1.DNA as template

根據(jù)獲得的蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因的cDNA序列，設(shè)計合成GSP1和GSP2特異性上游引物，并分別與下游錨定引物L(fēng)UPM、SUPM配對進行巢式PCR擴增，對3′ RACE PCR產(chǎn)物進行電泳分析，目的條帶長度約為500 bp (圖1b)，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化、克隆和測序獲得了476 bp的cDNA片段。該序列3′ 端非編碼區(qū)長120 bp，末端具有真核生物典型的poly(A)結(jié)構(gòu)，并且該poly(A)結(jié)構(gòu)上游41 bp處有1個加尾信號(序列為AATAAA)，表明已經(jīng)得到目的基因cDNA的3′末端序列。

根據(jù)昆蟲性信息素結(jié)合蛋白保守的基因結(jié)構(gòu)推斷，通過RT-PCR和3′ RACE擴增得到的cDNA片段包括了CpomPBP2部分外顯子2和全部的外顯子3，即在Ala 52和Asp 53之間有1個內(nèi)含子(圖2)，所以分別在外顯子2和外顯子3區(qū)域內(nèi)設(shè)計了用于TAIL-PCR的特異性引物(RB0、RB1、RB2，TRB0、TRB1、TRB2)。以蘋果蠹蛾基因組DNA為模板，以根據(jù)CpomPBP2基因外顯子2、3區(qū)域分別設(shè)計和合成的特異性引物進行TAIL-PCR擴增。在3區(qū)域預(yù)擴增中使用LAD3和在2區(qū)域預(yù)擴增中使用LAD1時擴增結(jié)果較理想，分別在第2輪、第3輪擴增時得到了長度約為2 000 bp的條帶和大于 2 000 bp的特異性條帶，將第2輪PCR產(chǎn)物純化、克隆后測序，得到1 918 bp和2 537 bp的序列(圖1c)。

圖2 CpomPBP2部分cDNA序列及氨基酸序列> < 2.內(nèi)含子2；RB0-RB2、TRB0-TRB2.用于TAIL-PCR擴增的特異性引物
Fig.2 Partial sequences of cDNA and deduced amino acids of CpomPBP2> < 2.Intron 2;RB0-RB2，TRB0-TRB2.Special primers for TAIL-PCR

2.2 蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因DNA全序列的克隆

經(jīng)PCR擴增得到長度約3 000 bp的特異性條帶。將PCR產(chǎn)物純化、克隆，對經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定為陽性的克隆進行測序，結(jié)果表明，CpomPBP2基因開放閱讀框全長510 bp，編碼169個氨基酸，DNA序列全長3 147 bp，含有2個內(nèi)含子，在Glu 22和Leu 23之間插入第1個內(nèi)含子(1 655 bp)，在Ala 82和Asp 83之間插入第2個內(nèi)含子(862 bp)。經(jīng)SignalP軟件預(yù)測，CpomPBP2的N-端前25個氨基酸為信號肽，具有真核生物分泌蛋白信號肽的典型特征，因此CpomPBP2成熟蛋白包括144個氨基酸，預(yù)測的分子質(zhì)量為16.45 ku，等電點為5.09。測序結(jié)果與上述拼接的DNA全長序列一致(圖1d)。蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因全長DNA序列已在GenBank上注冊，登錄號為JQ776635。

以cDNA為模板，用帶有雙酶切位點的引物CpomPBP2 F、CpomPBP2 R進行PCR擴增，得到長度約500 bp的目的片段(圖3)，與理論值相符。

2.3 原核表達載體pMD19-CpomPBP2的酶切鑒定和測序結(jié)果

用BamHⅠ和XhoⅠ對原核表達載體pMD19-CpomPBP2進行雙酶切，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，片段長度約為500 bp(圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序，目的片段與GenBank中蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因(GenBank登錄號：JQ776635)閱讀編碼框序列相吻合,全長510 bp，編碼169個氨基酸。說明原核表達載體pMD19-CpomPBP2構(gòu)建成功。

圖3 蘋果蠹蛾P(guān)BP2編碼框基因RT-PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果
M.DNA Marker DL2000；1,2.RT-PCR產(chǎn)物
Fig.3 Gel electrophoresis of RT-PCR products of PBP2 ofCydiapomonella
M.DNA Maker DL2000;1,2.Products of RT-PCR

2.4 原核表達載體pET28a-CpomPBP2的酶切鑒定及測序結(jié)果

質(zhì)粒pMD19-CpomPBP2和pET28a(+)雙酶切并連接后，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖5)表明，分別得到了長度約為5 300和500 bp的片段。經(jīng)測序公司測序正確，說明成功構(gòu)建了表達載體。

圖4 蘋果蠹蛾pMD19-CpomPBP2的雙酶切鑒定結(jié)果
M.DNA Marker DL2000；1，2.經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pMD19-CpomPBP2
Fig.4 Restriction enzyme identification of pMD19-CpomPBP2 ofCydiapomonella
M.DNA Marker DL2000；1,2.pMD19-CpomPBP2 digested withBamHⅠandXhoⅠ

圖5 原核表達載體pET28a-CpomPBP2的酶切鑒定結(jié)果
M.DNA Marker DL5000；1，2.經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET28a-CpomPBP2
Fig.5 Identification of prokaryotic expression vector pET28a-CpomPBP2
M.DNA Marker DL5000；1，2.pET28a-CpomPBP2 digested withBamHⅠandXhoⅠ

2.5 融合蛋白pET28a-CpomPBP2誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

不同終濃度(0.5，1.0，1.5和2.0 mmol/L) IPTG誘導(dǎo)融合蛋白6～8 h后取樣，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測，在約20 ku處均有明顯的目的條帶，說明IPTG誘導(dǎo)濃度對蛋白表達量的影響無明顯差異，IPTG誘導(dǎo)濃度在蛋白質(zhì)表達中為非關(guān)鍵因素(圖6)。因而取常見終濃度1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白，每隔2 h取樣1次，共取樣4次，通過12% SDS-PAGE檢測可知，誘導(dǎo)8 h時蛋白的表達量明顯大于其他時段(圖7)。

圖6 不同濃度IPTG誘導(dǎo)下pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析結(jié)果
M.預(yù)染蛋白Marker;1.未誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；2～5.終濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2
Fig.6 SDS-PAGE analysis of pET28a-CpomPBP2 at different IPTG concentrations
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2-5.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG at concentrations of 0.5,1.0,1.5, and 2.0 mmol/L,respectively

圖7 不同誘導(dǎo)時間下pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析結(jié)果
M.預(yù)染蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；2～5.經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)2，4，6，8 h的pET28a-CpomPBP2
Fig.7 SDS-PAGE analysis of recombinant pET28a-CpomPBP2 under different induction times
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2-5.pET28a-CpomPBP2 induced by 1.0 mmol/L IPTG for 2,4,6,and 8 h,respectively

2.6 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的誘導(dǎo)表達及Western blot檢測

將原核表達載體pET28a-CpomPBP2轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，并用IPTG誘導(dǎo)表達，同時將pET28a(+)及BL21(DE3)采用相同條件誘導(dǎo)表達，12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果(圖8)表明，未經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的融合蛋白pET28a-CpomPBP2無明顯目的條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體pET28a(+)及未誘導(dǎo)的菌液BL21(DE3)在約20 ku處也無特異性條帶，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的融合蛋白pET28a-CpomPBP2在約20 ku處有明顯條帶，且與理論值相符。Western blot免疫印跡檢測結(jié)果(圖9)證明，目的條帶為pET28a-CpomPBP2蛋白。

圖8 IPTG誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2的SDS-PAGE分析結(jié)果
M.預(yù)染蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；3.IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)；4.未誘導(dǎo)的BL21(DE3)
Fig.8 SDS-PAGE analysis of IPTG induced pET28a-CpomPBP2
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG;3.pET28a(+) induced by IPTG;4.BL21(DE3) without induction by IPTG

圖9 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的Western blot檢測結(jié)果
M.預(yù)染蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；3.IPTG誘導(dǎo)的pET28a(+)；4.未誘導(dǎo)的BL21(DE3)
Fig.9 Western blot analysis of pET28a-CpomPBP2 fused protein
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induced by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG; 3.pET28a(+) induced by IPTG;4.BL21(DE3) without induction by IPTG

2.7 融合蛋白pET28a-CpomPBP2的可溶性鑒定

圖10表明，融合蛋白pET28a-CpomPBP2在沉淀中以包涵體的形式存在。

圖10 融合蛋白pET28a-CpomPBP2菌液裂解后上清與沉淀的SDS-PAGE鑒定結(jié)果
M.預(yù)染蛋白Marker；1.未誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2；2.IPTG誘導(dǎo)的pET28a-CpomPBP2;3.IPTG誘導(dǎo)的上清液；4.IPTG誘導(dǎo)的沉淀
Fig.10 SDS-PAGE analysis of bacteria splitting supernatant and sediment of recombinant protein
M.Protein Marker;1.pET28a-CpomPBP2 without induction by IPTG;2.pET28a-CpomPBP2 induced by IPTG;3.Supernatant induced by IPTG;4.Sediment induced by IPTG

3 討 論

3.1 蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因全長的克隆

蛾類昆蟲的性信息素只有在信息素結(jié)合蛋白(PBP)作用下才能到達感器，但不同PBP對不同種類性信息素具有很高的敏感性和專一性[16-17]。Mitsuno等[18]已鑒定出一個小菜蛾(Plutellaxylostella)的性信息素結(jié)合蛋白PxlyPBP；陳東旭等[19]對小菜蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅰ(PBPⅠ)基因做了相關(guān)研究。本試驗以蘋果蠹蛾觸角cDNA為模板，運用RT-PCR、3′-RACE和5′ TAIL-PCR擴增技術(shù)，克隆了蘋果蠹蛾全長約為3 000 bp的PBP2基因，測序結(jié)果表明，CpomPBP2基因開放閱讀框長510 bp，編碼169個氨基酸，N-端前25個氨基酸為預(yù)測的信號肽，成熟蛋白由144個氨基酸組成，成熟蛋白分子質(zhì)量為16.45 ku，等電點(pI)為5.09，與全長引物擴增序列大小一致(GenBank上登錄號為JQ776635)，說明已獲得了CpomPBP2的全長。

3.2 蘋果蠹蛾P(guān)BP2基因的原核表達及鑒定

本研究運用PCR技術(shù)，根據(jù)已獲得的蘋果蠹蛾P(guān)BP2的cDNA序列設(shè)計引物，擴增得到PBP2的cDNA編碼閱讀框序列片段，將該基因片段與pMD19-T連接，經(jīng)雙切酶鑒定后，與表達載體pET-28a(+)構(gòu)建重組表達載體，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達，獲得分子質(zhì)量約20 ku的融合蛋白，經(jīng)Western blot分析表明，所獲蛋白確為His標(biāo)簽與PBP2的融合蛋白。

3.3 融合蛋白pET28a-CpomPBP2誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間是融合蛋白pET28a-CpomPBP2誘導(dǎo)過程中的關(guān)鍵因素[20]。本試驗結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)濃度對蛋白表達量的影響不明顯，因而選用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，分別在不同時間取樣進行12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明，在誘導(dǎo)8 h時蛋白表達量最大。因此選用1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h為最佳誘導(dǎo)條件。

目前，對于蘋果蠹蛾性信息素結(jié)合蛋白Ⅱ(CpomPBP2)基因的研究甚少，但對蘋果蠹蛾其他氣味結(jié)合蛋白序列已有報道[21]。對CpomPBP2的作用機制，尤其是對CpomPBP2與其他氣味結(jié)合蛋白的協(xié)調(diào)作用以及與不同種氣味結(jié)合特征等方面的研究還有待深入。本研究結(jié)果豐富和完善了對CpomPBP2結(jié)構(gòu)與功能的認識，通過分子克隆技術(shù)和原核表達，為進一步探明蘋果蠹蛾雌雄間信息素的交流機制奠定了基礎(chǔ)，為其防控提供了理論依據(jù)。

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Cloning and prokaryotic expression ofCydiapomonellapheromone binding protein Ⅱ gene (CpomPBP2)

CAO Xin-yue,HUANG Ai-yuan,ZHAO Xiao,WANG Dun,FENG Ji-nian

(KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinNorthwesternLoessPlateau,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofPlantProtectionResourcesandPestManagementofMinistryofEducation,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study obtained the cDNA sequence of pheromone binding protein Ⅱ gene ofCydiapomonella(CpomPBP2) and express CpomPBP2 inEscherichiacoliBL21(DE3) to understand the communication mechanism between male and femaleC.pomonella.【Method】 The sequence of CpomPBP2 was obtained using RT-PCR,3′-RACE and 5′ TAIL-PCR methods with extracted total RNA fromC.pomonellaantennae.The DNA segment was inserted into expression plasmid pET28a(+) to construct a recombinant expression plasmid and it was expressed and tested.Western blot characterization and soluble form identification of the fused protein pET28a-CpomPBP2 were also conducted.【Result】 The full-length of obtained cDNA was 3 000 bp with a 510 bp open reading frame,which encoded a protein of 169 amino acids with the molecular weight of 16.45 ku and pI value of 5.09.The SDS-PAGE analysis showed that the cloned fused CpomPBP2 was expressed in the form of inclusion bodies inE.coliBL21(DE3) with a molecular mass of 20 ku.Western blot showed that the fused CpomPBP2 was target protein.Under the 1.0 mmol/L IPTG and 8 h induction,plenty fused protein was obtained. 【Conclusion】 The full-length cDNA of CpomPBP2 was obtained and the fused CpomPBP2 was expressed inE.coliBL21(DE3) successfully.Western blot showed that CpomPBP2 was expressed correctly.

Cydiapomonella;pheromone binding protein Ⅱ gene ofCydiapomonella(CpomPBP2);gene cloning;prokaryotic expression

2013-11-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903042-03)；陜西省“13115”重大科技專項(2009ZDKG-06)

曹馨月(1988-)，女，甘肅嘉峪關(guān)人，在讀碩士，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究。

馮紀(jì)年(1957-)，男，陜西白水人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治研究。

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.010

Q786；S436.611.2+9

A

1671-9387(2015)03-0132-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.010.html