周育宏，黃海林，杜哲明，陳　超，王學(xué)閩，曾　朋

330030南昌，武警江西總隊醫(yī)院普外科

雌激素受體陰性乳腺癌中神經(jīng)膠質(zhì)瘤致病因子1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)及其臨床意義

周育宏，黃海林，杜哲明，陳超，王學(xué)閩，曾朋

330030南昌，武警江西總隊醫(yī)院普外科

一般認(rèn)為，雌激素是促進乳腺癌發(fā)生進展的主要因素，但是ER陰性乳腺癌對雌激素刺激不敏感，內(nèi)分泌治療有效率低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，其發(fā)病機制需要進一步研究[1]。2011年Kwon等[2]報道，Gli1通過上調(diào)MMP增強ER陰性乳腺癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，認(rèn)為引起ER陰性乳腺癌增殖的重要機制是Gli1對MMP表達(dá)的上調(diào)。Nagai等[3]同樣報道，Gli1可以通過上調(diào)MMP-9表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞株生長。但上述有關(guān)兩者間調(diào)控作用的報道均在體外預(yù)設(shè)實驗條件下實現(xiàn)，實際人體病理狀態(tài)下Gli1、MMP-9表達(dá)對ER陰性乳腺癌的促進作用是否存在，Gli1與MMP-9的表達(dá)是否相關(guān)均需要驗證。本實驗擬通過免疫組化Envision法檢測ER陰性乳腺癌組織中Gli1、MMP-9、CD34的表達(dá)，分析Gli1、MMP-9表達(dá)之間的相關(guān)性及其臨床意義，為研究ER陰性乳腺癌的增殖機制提供初步的臨床依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料收集我院2006-01至2013-10經(jīng)手術(shù)切除且病理確診的ER陰性乳腺癌標(biāo)本64例，所有乳腺癌標(biāo)本均有完整的臨床、病理及常用免疫診斷資料?；颊呔鶠榕裕g(shù)前未接受乳腺癌相關(guān)治療，年齡30～86歲，中位年齡54歲。根據(jù)乳腺癌TNM國際分期法，Ⅰ期18例，Ⅱ期31例，Ⅲ期15例。病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌45例，浸潤性小葉癌11例，導(dǎo)管內(nèi)癌6例，黏液腺癌2例。

1.2方法Gli1購自Santa Cruz公司，MMP-9購自Abcam公司，CD34購自DAKO公司，均為鼠抗人單克隆抗體。DAB顯色劑購自華美生物工程公司。采用免疫組化Envision法，操作嚴(yán)格按照說明書進行。蠟塊做連續(xù)4 μm切片，置于防脫載玻片上，二甲苯脫蠟，50 μl 3% 過氧化氫清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，pH 6.0枸櫞酸液加熱修復(fù)抗原，10%羊血清封閉，分別滴加三種一抗(Gli1抗體配比1∶50，MMP-9抗體配比1∶200，CD34抗體配比1∶100)。4℃孵育16 h，加入羊抗鼠二抗，DAB鏡下顯色、復(fù)染、脫水、封片。以Tris緩沖鹽水(TBS)代替一抗作為陰性對照，已知對應(yīng)陽性乳腺癌組織切片作為陽性對照。

1.3免疫組化染色評價標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計Gli1為細(xì)胞核、細(xì)胞漿同時染色，以細(xì)胞核染色為判定標(biāo)準(zhǔn)。MMP-9為胞漿染色，CD34為微血管內(nèi)皮染色。在100倍鏡下找到癌細(xì)胞或微血管生成較集中的區(qū)域，該范圍內(nèi)200倍鏡下隨機取3個視野進行計數(shù)。

1.3.1Gli1及MMP-9表達(dá)評估采用 Sinicrope等[4]的免疫反應(yīng)評分法(IS)：兼顧細(xì)胞染色強度及染色百分比。染色細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞百分比≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，≥76%記4分。根據(jù)不同抗體顯色不同，無染色記0分，弱染色記1分，中度染色為2分，深度染色為3分(染色強度判定參照Haaf等[5]Gli1染色深度評分)。兩者積分相乘，0、1分為“-”，2、3分為“+”，4、6分為“++”，8、9、12分為“+++”?！?分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)[6]。

1.3.2CD34表達(dá)評估表達(dá)強度用MVD表示。根據(jù)Weidner等[7]的計數(shù)法：視野中染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇，只要能和其他血管、腫瘤細(xì)胞及組織區(qū)分開，就記為一個微血管單位。細(xì)胞簇部分超出視野，仍記為一個血管單位。管腔超過8個紅細(xì)胞直徑的血管壁細(xì)胞不計數(shù)。ER及HER-2表達(dá)判定均以病理報告為準(zhǔn)：SP法ER細(xì)胞核染色<10%判定為陰性，熒光原位雜交(fish)HER-2/CEN17<2.2為陰性。上述讀片及計數(shù)均由兩名病理科醫(yī)師獨立完成，差異大于1分重新讀片判定，MVD取平均值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，MVD組間比較用單因素方差分析，相關(guān)性分析用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Gli1、MMP-9表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Gli1及MMP-9表達(dá)強度均與腫瘤大小、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，Gli1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2表達(dá)無關(guān)。MMP-9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與HER-2表達(dá)無關(guān)。兩者均與腫瘤大小及分期進展呈正相關(guān)，MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(表1)。

表1　雌激素受體陰性乳腺癌中Gli1、MMP-9表達(dá)

2.2Gli1、MMP-9表達(dá)與MVD的關(guān)系Gli1、MMP-9陰性(-)、低表達(dá)(+)、中表達(dá)(++)及高表達(dá)(+++)組MVD均數(shù)組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。MVD隨Gli1、MMP-9表達(dá)增強而增高，表明Gli1及MMP-9的表達(dá)是促進ER陰性乳腺癌微血管增殖的重要因素。

表2雌激素受體陰性乳腺癌Gli1、MMP-9不同表達(dá)

強度組MVD值比較

表達(dá)強度MMP-9例數(shù)MVDGli1例數(shù)MVD-1148.15±8.441348.83±7.53+2161.69±10.711460.69±10.02++1867.76±14.032064.68±12.92+++1473.11±12.781775.91±11.30F10.1315.41P<0.05<0.05

2.3Gli1與MMP-9表達(dá)的關(guān)系Gli1和MMP-9表達(dá)存在一定正相關(guān)性(r=0.462，P<0.01，表3)。

表3　雌激素受體陰性乳腺癌Gli1與MMP-9的關(guān)系

3討論

對Gli1的認(rèn)識源于對Hedgehog信號通路的研究。Hedgehog信號通路是一類高度保守的信號途徑，在進化中表現(xiàn)十分穩(wěn)定。通路生理狀態(tài)下階段性激活與胚胎發(fā)育有關(guān)，病理狀態(tài)下其過度激活導(dǎo)致包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生[8]。Gli1是Hedgehog通路下游重要的限速因子，能夠激活myc、snail、Bcl-2等多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，是研究Hedgehog通路致乳腺癌機制的重要靶點。Kubo等[9]報道，乳腺癌組織中Hedgehog通路相關(guān)蛋白Gli1、SHH、Ptch表達(dá)與ER表達(dá)相關(guān)。Zhao等[10]發(fā)現(xiàn)，Gli1過表達(dá)可抑制乳癌細(xì)胞ER的表達(dá)并減低細(xì)胞對雌激素的敏感性。后期研究又發(fā)現(xiàn)ER的表達(dá)能促進Gli1表達(dá)，并且不受雌二醇濃度的影響[11]。綜合其結(jié)論，Gli1表達(dá)可抑制ER表達(dá)并促進ER陰性乳腺癌細(xì)胞株的生長。

本研究分析了Gli1對ER陰性乳腺癌臨床特征的影響，發(fā)現(xiàn)Gli1表達(dá)顯著促進乳腺癌微血管增殖，半定量組間比較已呈現(xiàn)出兩者間的量化效應(yīng)，即MVD隨著Gli1表達(dá)增強而升高。同時，還證明Gli1表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小和TNM分期呈正相關(guān)，推測Gli1表達(dá)是促進ER陰性乳腺癌腫瘤增大和TNM分期進展的重要因素。目前已知腫瘤生長與微血管增殖關(guān)系密切，原發(fā)腫瘤超過0.1 mm就需要新生血管的營養(yǎng)支持，才能繼續(xù)浸潤和發(fā)生轉(zhuǎn)移。綜合分析上述臨床資料表明，Gli1表達(dá)促進ER陰性乳腺癌進展的具體方式可能是通過促進血管增殖，為乳腺癌細(xì)胞提供充分營養(yǎng)支持，從而引起腫塊不斷增大進而改變臨床分期。本結(jié)果顯示Gli1表達(dá)與HER-2無明顯相關(guān)(P=0.556)，可能是Hedgehog通路與后者的作用機制不同，兩者源于不同分子途徑。而本研究發(fā)現(xiàn)Gli1表達(dá)無明顯促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用，從側(cè)面反映乳腺癌是復(fù)雜的分子異構(gòu)體，其臨床特征表現(xiàn)是多因子共同作用的結(jié)果。

MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)重要成員，理論上能夠分解Ⅳ型膠原蛋白破壞基底膜，從而使癌細(xì)胞順利進入血管或淋巴管引起腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。本實驗研究MMP-9表達(dá)與ER陰性乳腺癌特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MMP-9表達(dá)促進乳腺癌微血管增殖，并初步體現(xiàn)出量化效應(yīng)，即MVD隨著MMP-9表達(dá)增強而升高。同時，實驗還得出ER陰性乳腺癌組織中MMP-9表達(dá)不僅與腫瘤大小、臨床分期呈正相關(guān)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，可推測MMP-9表達(dá)通過血管和淋巴兩種途徑促進ER陰性乳腺癌增殖轉(zhuǎn)移。臨床表現(xiàn)與上述MMP-9相關(guān)的破壞基底膜引起腫瘤轉(zhuǎn)移的理論一致。

Gli1與MMP-9表達(dá)對ER陰性乳腺癌特征的影響較一致，從外在表現(xiàn)上看，兩者有存在調(diào)控關(guān)系的基礎(chǔ)。進一步對兩者相關(guān)性進行分析，結(jié)果為中度正相關(guān)性(r=0.462，P<0.01)，在一定程度上驗證并支持了前述體外實驗報道中兩者存在正調(diào)控關(guān)系。說明ER陰性乳腺癌的發(fā)生進展的作用機制之一可能是：Hedgehog信號通路激活→Gli1表達(dá)→MMP-9表達(dá)→血管增殖→腫瘤生長→臨床分期進展。可見Gli1是ER陰性乳腺癌增殖途徑中重要的調(diào)控節(jié)點，為下一步以Gli1為靶點治療ER陰性乳腺癌提供初步的臨床依據(jù)。

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(2014-10-18收稿2014-12-21修回)

(責(zé)任編輯尤偉杰)

【摘要】目的探討雌激素受體(estrogen receptor ，ER)陰性乳腺癌中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤致病因子1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表達(dá)及臨床意義。方法用免疫組化Envision法檢測ER陰性乳腺癌組織中Gli1、MMP-9、 CD34的表達(dá)情況, 分析Gli1、MMP-9表達(dá)與CD34、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期、HER-2表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果ER陰性乳腺癌組織中，Gli1陰性(-)、低表達(dá)(+)、中表達(dá)(++)及高表達(dá)(+++)組的CD34分別為48.83±7.53、60.69±10.02、64.68±12.92和75.91±11.30； MMP-9分別為48.15±8.44、61.69±10.71、67.76±14.03、73.11±12.78，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ER陰性乳腺癌組織中Gli1、MMP-9表達(dá)與腫瘤大小、臨床TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)。ER陰性乳腺癌組織中Gli1與MMP-9表達(dá)存在一定正相關(guān)性(r=0.462，P<0.01)。結(jié)論Gli1與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)性，推測Gli1是ER陰性乳腺癌增殖途徑中重要的調(diào)控節(jié)點之一。

【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤；雌激素受體；免疫組織化學(xué)；Gli1；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

【中國圖書分類號】R737.9

Expression of Gli1, MMP-9 in estrogen-independent breast cancer and its clinical significance

ZHOU Yuhong, HUANG Hailin, DU Zheming, CHEN Chao, WANG Xuemin, and ZENG Peng. General Surgery Department, Jiangxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Nanchang, 330030 China

【Abstract】ObjectiveTo study the expression and clinical significance of glioma-associated oncogene homolog 1 (Gli1) and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) in estrogen-independent breast cancer. MethodsThe expression of Gli1 protein was examined by Envision immunohistochemistry, Gli1, MMP-9 and CD34 expression were examined in ER-negative breast cancer. The relationships between them and CD34, tumor size, TNM stages, lymph node metastasis, HER-2 expression in ER-negative breast cancer were analyzed. ResultsThe expression of CD34 was enhanced by the expression of Gli1 and MMP-9 in ER-negative group(CD34 expression were 48.83±7.53，60.69±10.02，64.68±12.92，75.91±11.30 in different group of Gli1；CD34 expressions were 48.15±8.44，61.69±10.71，67.76±14.03，73.11±12.78 in different group of MMP-9), with significant differences (P<0.05). The expression of Gli1 and MMP-9 were correlated with tumor size and clinical TNM stages in ER-negative breast cancer (P<0.05). The expression of MMP-9 was also correlated with lymphatic metastasis (P<0.05). The correlation existed between the expression of Gli1 and MMP-9 in ER-negative breast cancer(r=0.462, P<0.01). ConclusionsClinical positive correlation exists between the expression of Gli1 and MMP-9, Gli1 is an important regulating point in estrogen-independent breast cancer growth way.

【Key words】breast cancer; estrogen receptor; immunohistochemistry; Gli1; matrix metalloproteinases-9

通訊作者：曾朋，E-mail:zengpengys@163.com

作者簡介：周育宏，博士，副主任醫(yī)師，E-mail: zhouyuhong0928@163.com