超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝優(yōu)化

文 / 李冰, 于長(zhǎng)青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

(甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝優(yōu)化

文 / 李冰, 于長(zhǎng)青*, 郝琴, 張曉雪, 魏文慧

(甘肅省輕工研究院 分離技術(shù)開(kāi)發(fā)中心 天然產(chǎn)物工程技術(shù)研究中心, 甘肅 蘭州730000)

本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝。結(jié)果表明，紅芪多糖的最佳提取條件為：提取溫度為60.00 ℃，超聲功率為120.00 W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%，紅芪多糖提取率為5.98%，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

超聲波; 纖維素酶; 紅芪多糖; 提取率

紅芪(Radix Hedysari)又叫巖黃芪、晉芪、獨(dú)根[1]，系多序巖黃芪(Hedysarum Poly-botrys Hand.-Mazz.)的干燥根，與黃芪同科異屬，為多年生草本[2]。其根多為粗狀、深長(zhǎng)，外皮暗紅褐色的直系根[3]；主要分布于甘肅宕昌、武都、岷縣、舟曲、臨潭、漳縣、西和、禮縣、武山等地，生于海拔1800~2500米的高原山脊、臺(tái)地及溝谷邊[4,5]。紅芪性溫、味甘，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、排膿、斂瘡生肌等功效[6]。紅芪富含多糖、黃酮、皂苷、氨基酸及微量元素等多種有效成分，其中紅芪多糖(HPS)因具有提高超氧化物歧化酶活性，增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤等多種生物效應(yīng)，一直成為人們研究的熱點(diǎn)[7-10]。

目前，紅、黃芪多糖的提取方法多為傳統(tǒng)熱水浸提法[5]、超聲波輔助提取法[11]、微波輔助提取法[12]、酶法提取[5]等方法，研究也主要集中在對(duì)某種單一提取方法單因素或多因素的正交優(yōu)選方面，而對(duì)這些提取方法之間的協(xié)同作用的研究所見(jiàn)不多。本文以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，優(yōu)化紅芪多糖的提取工藝，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

紅芪(購(gòu)置于甘肅省隴南市宕昌縣)；纖維素酶(500000~1400000U/g,甘肅華羚生物科技有限公司)；檸檬酸(分析純，)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；葡萄糖(分析純，天津市北辰方正試劑廠)；苯酚(分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(分析純，天津市百世化工有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

ACS-A型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；CTXNW-10B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；RE5220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠)；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生化儀器廠)；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華一起有限責(zé)任公司)；DL-5M型低速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；AB104-N型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；W201S型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；722s型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

1.3.1 紅芪多糖的提取

將清洗、干燥后的紅芪原料(水分含量≤13%)粉碎至45目，稱量后加入一定量的蒸餾水，用檸檬酸調(diào)節(jié)至一定pH值后，按酶量/紅芪粉末質(zhì)量百分比加入一定量的纖維素酶，投入超聲波提取裝置，在一定溫度、一定功率條件下間歇超聲(超聲時(shí)間:間歇時(shí)間為1:1)攪拌(80r/min)提取3次，每次30 min。合并提取液，90℃滅酶活，以4000 r/min離心15min，取上層清液，70℃濃縮。濃縮液加入等體積三氯乙酸-正丁醇(V:V=1:10)振蕩?kù)o置分層，收下層水溶液，再以4000r/min離心15min，取上層清液加入無(wú)水乙醇至30%，靜置6h后以4000 r/min離心15min，取沉淀70℃真空干燥得到紅芪多糖。

1.3.2 紅芪多糖含量的測(cè)定

總多糖含量 (%)：苯酚-硫酸法[13]

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以紅芪多糖提取率為衡量指標(biāo)，對(duì)提取溫度、超聲功率、料液比、溶液pH值、酶用量5個(gè)單因素進(jìn)行考察。

1.3.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，采用的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，以提取溫度(X1)、超聲功率(X2)、料液比(X3)、溶液pH值(X4)、酶用量(X5)為自變量，展開(kāi)五因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)，建立最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，利用此模型確定超聲波協(xié)同酶法提取紅芪多糖工藝中的最佳提取條件及最大提取率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用ANOVA進(jìn)行方差分析，利用Duncan法進(jìn)行多重比較；響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用F檢驗(yàn)(tape III)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)分析分別采用Spss19.0和Design Expert7.0軟件。

2、結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，用酶量為0.6 %，超聲功率120 W條件下，分別探討30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的提取溫度對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與提取溫度的關(guān)系見(jiàn)圖1(a)。

由圖1(a)可知，隨著提取溫度的升高，紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P＜0.05)，當(dāng)提取溫度達(dá)到50℃時(shí)，提取率達(dá)到峰值，這是因?yàn)闇囟鹊纳卟粌H會(huì)使萃取劑的傳質(zhì)系數(shù)增加， 度下降，從而引起多糖分子溶出的增加[15]；而且，酶活也逐漸達(dá)到最適溫度，促進(jìn)了酶對(duì)紅芪細(xì)胞壁的分解，使得多糖的提取率增加[13]。當(dāng)溫度超過(guò)50℃，紅芪多糖的提取率隨之顯著降低(P＜0.05)，這可能是因?yàn)闇囟鹊纳呤沟妹富钚缘慕档突蛎覆糠质Щ?，從而影響了紅芪的水解效果。

2.2.2 超聲功率的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，用酶量為0.6%，提取溫度50℃條件下，分別探討80W、100W、120W、140W、160W的超聲功率對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與超聲功率的關(guān)系見(jiàn)圖1(b)。

由圖1(b)可知，紅芪多糖提取率隨超聲功率的升高而顯著增大(P＜0.05)，當(dāng)超聲功率超過(guò)120W，紅芪多糖提取率趨于平緩。這說(shuō)明適當(dāng)?shù)纳叱暪β士梢栽鰪?qiáng)超聲波所產(chǎn)生的空穴力，提高多糖分子的運(yùn)動(dòng)使其溶出，并且可能會(huì)一定程度的增強(qiáng)酶的活力，從而促進(jìn)提取過(guò)程中對(duì)紅芪細(xì)胞壁的破壞作用。

2.2.3 溶液pH值的影響

在料液比1:10，用酶量為0.6%，提取溫度50℃，超聲功率120W條件下，分別探討2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液pH值對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與溶液pH值的關(guān)系見(jiàn)圖1(c)。

由圖1(c)可知，紅芪多糖提取率隨著溶液pH值的升高而顯著增大(P＜0.05)，并在pH值為5.0時(shí)提取率達(dá)到峰值，說(shuō)明適宜的pH值會(huì)提高酶和底物的相互結(jié)合，并發(fā)生催化作用，從而使酶解效果達(dá)到最佳。當(dāng)溶液pH值大于5.0時(shí)，紅芪多糖提取率隨著pH的增大而顯著降低(P＜0.05)，這可能由于已過(guò)最適宜pH值所導(dǎo)致的酶活性降低，從而引起提取率的下降。

2.2.4 料液比的影響

在溶液pH值5.0，用酶量為0.6%，提取溫度50℃，超聲功率120W條件下，分別探討1:6、1:8、1:10、1:12、1:14的料液比對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與料液比的關(guān)系見(jiàn)圖1(d)。

由圖1(d)可知，隨著溶液體積的增加，紅芪多糖的提取率隨之顯著增加(P＜0.05)，但料液比達(dá)到1:10之后多糖提取率趨于平緩。這主要是因?yàn)樵黾犹崛∫旱挠昧磕軌蚴苟嗵欠肿映浞值娜艹觯嗵欠肿踊救艹龊笤僭黾犹崛∫旱挠昧恳矡o(wú)法使多糖的提取率有顯著的提升。

2.2.5 用酶量的影響

在料液比1:10，溶液pH值5.0，提取溫度50℃，超聲功率120 W條件下，分別探討0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的用酶量對(duì)紅芪多糖提取率的影響。提取率與用酶量的關(guān)系見(jiàn)圖1(e)。

由圖1(e)可知，隨著用酶量的增加，紅芪多糖提取率呈增加的趨勢(shì)，在用酶量為0.3%時(shí)達(dá)到最大，之后隨著酶添加量的繼續(xù)增加，提取率開(kāi)始逐漸減少。這主要是因?yàn)椋?1)加酶量越大，內(nèi)容物釋放量越大，底物減少，使得一部分酶沒(méi)有足夠的底物結(jié)合，從而使多糖提取率下降。(2)酶濃度的增加，多糖中某些糖苷鍵會(huì)被過(guò)量的酶所分解，多糖提取率會(huì)隨之下降。

圖1 不同因素對(duì)紅芪多糖提取率的影響Fig.1 The influence of different factors on extraction yield of Radix Hedysari

2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

2.2.1 模型方程的設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box—Behnken設(shè)計(jì)法，對(duì)超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紅芪多糖工藝進(jìn)行3因素優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

表2 Box—Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

由表3可知，該實(shí)驗(yàn)所選模型(P＜0.001)差異極其顯著，且失擬項(xiàng)(P＞0.05)差異不顯著；模型擬合度R2=0.9490，校正決定系數(shù)Radj2=0.9081，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，可解釋90.81%的響應(yīng)值變化。擬合方程一次項(xiàng)X2、X3對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)；擬合方程二次項(xiàng)X22、X32、X42對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)；擬合方程X2X5對(duì)紅芪多糖的提取率影響極其顯著(P＜0.01)，X1X3對(duì)其提取率影響顯著(P＜0.05)。綜上，五因素對(duì)紅芪多糖提取率影響程度由大到小依次為：超聲功率＞溶液pH值＞料液比＞提取溫度＞用酶量，且超聲功率與用酶量、提取溫度與溶液pH值存在協(xié)同影響紅芪多糖提取率的作用。

2.2.2 工藝提取條件的優(yōu)化

根據(jù)Box-Bwhnken試驗(yàn)所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測(cè)紅芪多糖提取率的最佳工藝條件為：在提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為4.82，料液比為1:10.33，用酶量為0.4%時(shí)，提取率為6.06%。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)操作，將其最佳提取條件修正為：提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%

2.2.3 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按修正后最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得紅芪多糖提取率為5.98%，RSD=1.01（見(jiàn)表4）。實(shí)際測(cè)得紅芪多糖提取率與預(yù)測(cè)值6.06%之間無(wú)顯著差異(P=0.386)。

表4 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 、結(jié)論

本研究以甘肅道地藥材紅芪為研究對(duì)象，以超聲波協(xié)同酶解技術(shù)為提取方法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件，運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面分析法，建立了紅芪多糖提取率與各因素間的擬合模型，對(duì)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了最佳工藝條件：在提取溫度為60.00℃，超聲功率為120.00W，溶液pH值為5.0，料液比為1:10，用酶量為0.4%下，紅芪多糖提取率為5.98%，為超聲波協(xié)同酶解技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及依據(jù)。

[1]歐陽(yáng)亦華, 顏劍. 紅芪多糖含量測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2002, 19(3): 296-301.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S]. 2010年版. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 142.

[3]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1998, 42(2): 186.

[4]羅文蓉, 楊扶德, 張雅聰. 紅芪的生藥學(xué)研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2004,15(3): 157.

[5]譚玉玲. 中藥紅芪藥材鑒定及多糖提取工藝研究[D]. 蘭州: 蘭州理工大學(xué), 2010.

[6]TIAN H Y. Chemical composition of Radix Hedysari research[J]. Northwest University for Nationalities (Natural Science), 1996, 17( 1) : 89-91.

[7]毛小娟, 王軍志, 王鳳連. 紅芪多糖和黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 1989, 5(6): 367-372.

[8]金智生, 張東鵬. 紅芪多糖對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗大鼠IL-6的影響[J]. 甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 23(5): 6-8.

[9]李世剛, 張永琦, 趙健雄. 紅芪多糖體外抗腫瘤活性及構(gòu)效關(guān)系研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2007, 23(6): 35-37.

[10]姚寶泰, 趙健雄, 王學(xué)習(xí). 紅芪總多糖體內(nèi)抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 2008, 23(7): 627-629.

[11]胡燕, 程衛(wèi)東, 劉欣, 等. 紅芪多糖超聲波提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 22(8): 1953-1954.

[12]龔蘇曉, 高展, 張鐵軍, 等. 微波輔助提取黃芪多糖及含量測(cè)定[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2008, 19(4): 784-786.

[13]刁文超, 王然, 王鳳舞, 等. 超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取南瓜多糖工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 14-20.

[14]Box G. P, Behnken D W. Some new three level design for the study of quantitative variables[J]. Technometrics, 1960(2): 456-475.

[15]李冰. 亞臨界萃取文冠果籽油工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 中國(guó)油脂, 2015, 40(2): 19-23.