半脾模型在裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的實驗研究

白景舒，王 健，趙雪峰

(大連大學附屬新華醫(yī)院 普通外科，遼寧 大連116021)

結(jié)直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢［1］。結(jié)直腸癌的臨床分期是判斷預后的重要的因素。近期研究表明，晚期結(jié)直腸癌的5年生存率為不足50%，甚至有些病人失去了根治性手術(shù)的機會［2］。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)病率為25%左右，手術(shù)切除病灶后5年生存率為25% ～58%，復發(fā)率為25%～50%［3］。因此，對于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子生物機制的研究與新型靶向治療藥物的研發(fā)對結(jié)直腸癌的治療具有重要的意義。

目前有諸多抗腫瘤藥物用于臨床的治療，并取得了一定的療效，但仍存在毒副作用大、耐藥性強等問題，尚需開發(fā)新的針對腫瘤信號傳導途徑中多環(huán)節(jié)作用靶點的高效低毒抗腫瘤藥物。獲得純度高且量大的抗腫瘤藥物的關(guān)鍵是建立有效而穩(wěn)定的藥物篩選模型。本研究組之前構(gòu)建過符合臨床腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展特點的動物模型，也曾研究過大腸癌肝轉(zhuǎn)移機制和抗轉(zhuǎn)移治療，但治療途徑的選擇只能經(jīng)口或腹腔內(nèi)灌注［4］。本研究首先建立裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型，其后經(jīng)靜脈注入常用化療藥物，觀察抗腫瘤效能。期待近期會成為評價新型藥物抗腫瘤活性的有利藥物篩選模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料

人結(jié)腸癌細胞株HT29 和環(huán)磷酰胺(CTX)由韓國CNU 腫瘤研究所Young - Kyu Park 教授捐贈。BALb/c 品系裸鼠30 只，6 周齡雌性，體重18 ～20 g，由韓國CNU 實驗動物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及懸液制備:人HT29 結(jié)直腸癌細胞株在攝氏37 ℃、5% CO2，含10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，每2 ～3 d 換1 次培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)至80% ～90%融合時，用0.25%胰酶消化液消化后，1200 r/min 離心3 min，棄上清液，加無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液洗細胞2 次，顯微鏡下計數(shù)，用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度分別為5 ×106/mL、1 ×107/mL 及5 ×107/mL。制備好的細胞懸液放冰浴保存，于30 min 內(nèi)分別進行接種。

1.2.2 動物模型設(shè)計:制模前1 周為實驗動物安定期，防止進行對裸鼠的一切刺激性操作。實驗動物共30 只，隨機分為15 只低濃度環(huán)磷酰胺治療組(L-CTX 治療組;CTX 1.0 mg·kg-1)和15 只高濃度環(huán)磷酰胺治療組(H-CTX 治療組;CTX 4.0 mg·kg-1)。L-CTX 治療組再分為5 只HT29 大腸癌細胞濃度梯度為5 ×105/100 μL 制模組、5 只HT29 結(jié)直腸癌細胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組及5只HT29 結(jié)直腸癌細胞濃度梯度為5 ×106/100 μL制模組;H-CTX 治療組也同L -CTX 治療組分類。CTX 治療組在制模后3 d 起經(jīng)遠端半脾每隔3 d 進行治療。L-CTX 治療組經(jīng)遠端半脾注入濃度1.0 mg·kg-1，而H-CTX 治療組經(jīng)遠端半脾注入濃度4.0 mg·kg-1。制模30 d 后所有30 只裸鼠進行處死，解剖觀察實驗結(jié)果。

1.2.3 放大鏡輔助下結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型的建立:根據(jù)麻醉預實驗結(jié)果，選擇異氟醚進行全身麻醉。放大鏡輔助下(Binocular lens，Heine，Germany)取上腹正中切口長約5 mm，逐層入腹后小心牽拉大網(wǎng)膜并顯露脾臟(圖1A)。脾臟中央利用一次性鈦夾夾閉并切斷，分成兩個帶血管蒂的半脾(圖1B)。近端半脾牽出切口外，用31 號無損傷針頭迷路進針約2 mm，分組并分別緩慢注入HT29 結(jié)直腸癌細胞懸液5 ×105/100 μL、1 ×106/100 μL 及5 ×106/100 μL 至脾被膜下，總量為100 μL，注射部位脾被膜可見發(fā)白腫脹，拔針時用止血小紗布輕輕按壓30 s(圖1C)。10 min 后夾閉、切斷近端半脾臟血管(圖1D)，切除并移除近端半脾(圖1E)。切口左側(cè)皮下游離至使皮下形成儲存囊，將遠端半脾擺放在其囊內(nèi)，送回部分網(wǎng)膜等附件后，逐層關(guān)腹(圖1F)。建立模型全程應防止遠端半脾血管的損傷，同時也要防止胰腺、胃及重要血管的損傷。

1.2.4 結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移評分標準:根據(jù)制模預實驗結(jié)果，選擇制模及治療后30 d 處死裸鼠，并制定的肝轉(zhuǎn)移評分標準如下:0 為無肝轉(zhuǎn)移;1 為最低限度浸及肝臟，浸潤范圍≤0.50 cm2;2 為輕度浸及肝臟，浸潤范圍0.51 ～1.00 cm2;3 為中度浸及肝臟，浸潤范圍1.01 ～2.00 cm2;4 為重度浸及肝臟，浸潤范圍＞2.00 cm2。

1.2.5 觀察指標:每天常規(guī)觀察記錄裸鼠狀態(tài)，包括飲食、活動量、皮膚狀態(tài)、排泄物。裸鼠出現(xiàn)頻死前癥狀或觀察期滿30 d 時予以處死。處死后立即解剖觀察腹腔及胸腔內(nèi)情況，具體記錄肝轉(zhuǎn)移評分、有無淋巴結(jié)腫大及轉(zhuǎn)移、有無血性腹水、有無腹腔種植轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)以Mean ±SD 表示，研究組和對照組的比較采用t 檢驗和χ2檢驗進行統(tǒng)計分析，P ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 半脾模型Fig 1 Hemispleen model

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度梯度的結(jié)直腸癌細胞制模后肝轉(zhuǎn)移評分

30 只裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率皆為100%，無一例手術(shù)死亡，制模有效。L -CTX 治療組按大腸癌細胞濃度梯度(5 ×105/100 μL、1 ×106/100 μL 及5 ×106/100 μL)，肝轉(zhuǎn)移評分分別為1.80 ±0.45，2.60±0.55 及3.60 ±0.55，其差異有顯著性意義(P ＜0.05)，見表1。H-CTX 治療組也同L-CTX治療組按結(jié)直腸癌細胞濃度梯度分類，肝轉(zhuǎn)移評分分別為0.80±0.55，1.20 ±0.55 及2.40±0.55，其差異也有顯著性意義(P ＜0.05)，見表1。

2.2 CTX 治療效能及模型穩(wěn)定性比較

30 只裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型減瘤率皆為100%。大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型觀察，發(fā)現(xiàn)L -CTX治療組淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移(11/15;73.3%)、血性腹水(8/15;53.3%)、腹膜種植轉(zhuǎn)移(3/15;20.0%)及肺轉(zhuǎn)移(1/15;6.7%)。但H-CTX 治療組無腹膜種植轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移，而表現(xiàn)出淋巴結(jié)腫大或轉(zhuǎn)移(2/15;13.3%)、血性腹水(1/15;6.7%)。L-CTX 治療組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血性腹水明顯少于H-CTX 治療組，其差異有顯著性意義(P ＜0.05)。見圖2，表2。

表1 不同濃度梯度的結(jié)直腸癌細胞制模后肝轉(zhuǎn)移評分比較Tab 1 The liver metastasis scores between two concentrations of CTX in different concentrations of HT29 human colon cancer cells of hemispleen models

圖2 半脾模型致肝轉(zhuǎn)移Fig 2 The hepatic metastasis of hemspleen model

表2 不同濃度梯度CTX 治療效能的比較Tab 2 The therapeutic effects of different concentrations of CTX in hemispleen model (n)

2.3 藥物敏感性篩選模型的選定

L-CTX 與H -CTX 治療組的相互比較中，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模相其平均肝轉(zhuǎn)移評分的差值減少最顯著，見表1。結(jié)直腸癌細胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模相其組織及臟器轉(zhuǎn)移能力明顯下降，見表2。人HT29 結(jié)直腸癌細胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組，其模型具有高度的穩(wěn)定性和對抗腫瘤藥物的敏感性。

3 討 論

隨著腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究，信號傳導途徑中的關(guān)鍵蛋白作為藥物靶點進行抗腫瘤藥物的研究，有望成為腫瘤治療的新途徑［5］。然而，在前臨床實驗過程中，選擇有效而穩(wěn)定的藥物篩選模型是能否研發(fā)高效而低毒的抗腫瘤藥物的先決條件。

經(jīng)臨床實踐證實，癌腫的遠處轉(zhuǎn)移是有選擇性的而非隨機的，具有很強的器官特異性，如結(jié)直腸癌容易發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移［6］。建立合理的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型是研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移機制的基礎(chǔ)。本實驗室曾成功建立過胃腸道腫瘤的原位或異位移植肝轉(zhuǎn)移模型。真正應用于前臨床實驗只能經(jīng)口或腹腔內(nèi)抗腫瘤藥物的灌注［4，7］，故本研究建立裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型，后經(jīng)保留的遠端脾靜脈直接注入常用化療藥物，觀察抗腫瘤效能。此模型更有利于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移分子生物機制及新型靶向治療藥物的研發(fā)，是較為理想的抗腫瘤藥物篩選模型。本模型與目前報道的常用大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型相比，有如下優(yōu)點:(1)有效利用了裸鼠脾臟特殊的解剖特點;(2)經(jīng)靜脈給藥，更加貼近于臨床，值得強力推薦于前臨床試驗;(3)可模擬臨床廣泛應用于腫瘤患者的皮下埋置的化療泵，不用開腹就能利用注射器來定期注入抗腫瘤藥物;(4)可模擬應用于腫瘤化療患者的周圍中心靜脈的PICC 管，必要時連接抗腫瘤藥物;(5)可作為肝轉(zhuǎn)移的有效治療，也可應用于預防性肝轉(zhuǎn)移治療的實驗設(shè)計。此藥物篩選模型值得前臨床試驗的推廣應用，但其弱勢在于動物實驗手術(shù)操作相對復雜，需要反復預實驗的來熟練其手術(shù)操作。

在本組的前臨床實驗中，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細胞建立的肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率和減瘤率皆為100%。尤其是在實驗中發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞濃度梯度為1 ×106/100 μL 制模組，顯示出模型穩(wěn)定性和抗腫瘤藥物的敏感性。

綜上所述，本文所構(gòu)建的裸鼠大腸癌肝轉(zhuǎn)移半脾模型為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學機制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了較為理想的實驗模型。肝轉(zhuǎn)移半脾模型為抗腫瘤藥物體外篩選模型方法，其模型的建立能應用于抗腫瘤藥物的篩選。

特此，感謝韓國Young Kyu Park 教授的捐贈。

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