平璐 顧德峰 韋正乙 仲曉芳 王云鵬 林春晶 邢少辰

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春，130118) (吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所)

責(zé)任編輯:任 俐。

矮牽牛(Petunia hybrid Vilm)屬于茄科，碧冬茄屬，多年生草本植物，因花色豐富而極具觀賞價(jià)值，有“花壇皇后”的美譽(yù)。在我國(guó)東北地區(qū)，常作為1～2年生栽培花卉，用于園林植物景觀搭配的材料［1］。矮牽牛的栽培歷史悠久，品種豐富多樣，1849年就人工培育出了復(fù)瓣雜交品種，之后又陸續(xù)培育出四倍體大花品種和小花及矮化品種［2-3］。1930年，日本首次培育了F1代的雜交矮牽牛品種［4］。而后通過花藥離體培養(yǎng)和低溫處理等方法進(jìn)行矮牽牛的單倍體育種研究［5-8］。由于矮牽牛具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)科技工作者在矮牽牛雜種優(yōu)勢(shì)研究和雜交品種培育方面也取得了明顯進(jìn)展，如采用射線誘變，配合單株系選方法，篩選自交系和不育系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行雜交，獲得不同花色的矮牽牛雜種一代品種6 個(gè)［9-11］。

除了常規(guī)育種外，基因工程也為矮牽牛育種開辟了一個(gè)新途徑。由于矮牽牛具有生長(zhǎng)周期短、基因變異性狀易于識(shí)別、適合農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化等多種優(yōu)勢(shì)［4，12-13］。自Horsch et al.［14］1985年首次獲得矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株后，矮牽牛作為受體被廣泛用于基因工程領(lǐng)域，用于多種性狀改良。在花色性狀改良方面，利用矮牽牛無色突變體轉(zhuǎn)化來自玉米的二氫槲皮素還原酶基因，已經(jīng)獲得磚紅色矮牽牛品系，轉(zhuǎn)化查爾酮還原酶基因獲得了黃色矮牽牛品系［15-16］;在改善矮牽牛的誘導(dǎo)率和抗逆性方面，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶Ⅰpt 基因可以提高不定芽的誘導(dǎo)頻率，而經(jīng)過芯片表達(dá)譜篩選出的B-box 型鋅指蛋白基因PhBBX8可能與非生物逆境有關(guān)［13，17］。將源于百脈根的Bio基因及其突變基因經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入矮牽牛，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因后代植株的葉片明顯變窄，甚至只剩下主葉脈，說明該基因可調(diào)控葉片的發(fā)育［18］。研究發(fā)現(xiàn)，源于擬南芥的AtGA2OX1 基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，可以產(chǎn)生矮化植株，其效果與噴施多效唑的效果一致，為矮化育種提供技術(shù)支持［19］。在提高矮牽?？共⌒陨希l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)乙烯受體突變基因ETR1-1 可以提高矮牽牛葉片對(duì)灰霉病的抗性［20］。將與衰老相關(guān)的SAG12-ⅠPT 基因轉(zhuǎn)化到矮牽牛中，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)能夠明顯延遲矮牽牛葉片的衰老，開花數(shù)量和生物量也均有增加［21］。

與傳統(tǒng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)化不同，葉綠體轉(zhuǎn)化具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，如外源基因的高表達(dá)量，沒有基因沉默現(xiàn)象等，因而為植物的性狀遺傳改良和生物反應(yīng)器研究開辟了新途徑［22］。作為葉綠體轉(zhuǎn)化的受體，區(qū)別核轉(zhuǎn)化受體的一個(gè)明顯特點(diǎn)就是需要其具有較高的不定芽誘導(dǎo)頻率，以便有更大的機(jī)會(huì)獲得同質(zhì)化轉(zhuǎn)基因植株。2004年，Zubko et al.［23］利用Gus 基因首次建立了矮牽牛穩(wěn)定的葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系，后續(xù)未見其他報(bào)道。本研究通過在篩選培養(yǎng)基中添加雙丙氨膦和壯觀霉素，配合3 種不同質(zhì)量濃度的激素，開展抗性培養(yǎng)基參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)，希望在4 種矮牽牛品種中獲得不定芽誘導(dǎo)頻率表現(xiàn)良好的材料，為后續(xù)的矮牽牛葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化奠定材料基礎(chǔ)，進(jìn)而推動(dòng)矮牽牛遺傳性狀的改良。

1 材料與方法

本研究選用4 種不同花色的矮牽牛品種，分別為‘Pink Vein’、‘Peppermint’、‘Red’和‘Pink’(圖1)。上述品種由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所植物生物反應(yīng)器工程實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 4 種不同花色的矮牽牛品種

試驗(yàn)設(shè)計(jì):以4 種不同花色的矮牽牛品種作為材料，選取3 種誘導(dǎo)激素(6-BA、NAA、IBA)中的任意2 種激素，按照不同質(zhì)量濃度設(shè)定為1 組，共設(shè)計(jì)9 組激素配比(表1)，每1 組設(shè)置5 次重復(fù)，每次重復(fù)接種16 個(gè)外植體。運(yùn)用DPS 軟件分析葉片外植體直接誘導(dǎo)不定芽的情況，從中篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基及受體材料。在此基礎(chǔ)上，選擇2 種篩選劑，每1 種篩選劑添加到一組最優(yōu)培養(yǎng)基和受體材料組合中，設(shè)置5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度處理，每組接種16 個(gè)葉片外植體，處理14 d，每2 d 統(tǒng)計(jì)1 次外植體黃化或褐化個(gè)數(shù)，通過篩選效果選出最優(yōu)篩選劑及篩選的最優(yōu)質(zhì)量濃度。

再生培養(yǎng)基中3 種激素質(zhì)量濃度的優(yōu)化:以MS作為矮牽牛再生的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度、不同組合方式的6-BA、NAA 及IBA3 種激素。培養(yǎng)基中瓊脂為0.6%、蔗糖為3%，pH=5.8(表1)。

表1 矮牽牛不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中3 種激素的組合

兩種抗性培養(yǎng)基的篩選:兩種抗性培養(yǎng)基包括在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的雙丙氨膦(Bialaphos-sodium，縮略為Bar)和壯觀霉素(Spectinomycin，縮略為Spe)，利用確定的矮牽牛品種‘Pink’進(jìn)行抗性篩選。在雙丙氨膦質(zhì)量濃度的選擇上，本研究參照煙草、水稻、玉米等植物的篩選條件［24-26］，在品種‘Pink’最適的再生培養(yǎng)基中，添加5 種不同質(zhì)量濃度的Bar 進(jìn)行篩選，質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、1、2、3、4、5 mg·L-1。在抗生素壯觀霉素質(zhì)量濃度的選擇上，參照甜菜、郎柿、菊苣等植物的篩選標(biāo)準(zhǔn)［27-29］，在品種‘Pink’最適再生培養(yǎng)基中，添加5種不同質(zhì)量濃度的Spe 進(jìn)行抗性篩選，質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為0、50、75、100、125、150 mg·L-1。

矮牽牛再生體系的建立:本試驗(yàn)選取4 種不同花色的矮牽牛品種作為受體材料，每個(gè)品種的種子分別用10%的過氧化氫(H2O2)殺菌10 min，再用無菌水沖洗4～6 次，然后加入無菌水將種子完全淹沒，4 ℃條件下過夜。次日，倒掉無菌水，分別加25%的次氯酸鈉(NaClO)，滅菌30 min。最后用無菌水沖洗6～8 次，接種到MS 培養(yǎng)基中，4 ℃條件下暗培養(yǎng)12 h，次日進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:溫度24 ℃，濕度40%，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照培養(yǎng)18 h/d，暗培養(yǎng)6 h/d，待矮牽牛種子萌發(fā)并長(zhǎng)成10 cm 左右的幼苗，用于再生。

選取上述4 個(gè)矮牽牛品種中長(zhǎng)勢(shì)好的無菌苗，剪取中層葉片，去除葉脈后切成大小約1 cm×1 cm的方形葉塊，近軸面朝上平鋪在添加了不同質(zhì)量濃度激素的MS 培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基按照4×4 方式均勻擺放葉塊。每組處理80 個(gè)外植體，每皿16 個(gè)，一個(gè)處理設(shè)置5 次重復(fù)。每2 周左右更換一次培養(yǎng)基，直至誘導(dǎo)出不定芽。待不定芽長(zhǎng)至1 cm 左右，統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)。將不定芽移栽到分別添加不同激素的生根培養(yǎng)基中，生根成苗。

Bar 與Spe 對(duì)矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的影響:取長(zhǎng)勢(shì)較好的無菌苗中層葉片，按前述的4×4 葉塊擺放方式，分別均勻地平鋪在含不同質(zhì)量濃度Bar 和Spe的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基中同時(shí)添加3 種激素，并分別設(shè)置不同質(zhì)量濃度。每種激素處理16 個(gè)外植體葉塊，約2 周后統(tǒng)計(jì)外植體不定芽的誘導(dǎo)情況，分別確立Bar 及Spe 篩選的最適臨界質(zhì)量濃度。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，首先對(duì)9 種激素組合的處理結(jié)果進(jìn)行單因素比較分析，按照不定芽誘導(dǎo)的頻率，確定4 個(gè)不同矮牽牛品種的最適培養(yǎng)基，然后進(jìn)行多重比較，確定誘導(dǎo)不定芽的最適矮牽牛品種。根據(jù)不同激素質(zhì)量濃度與不同品種不定芽誘導(dǎo)數(shù)進(jìn)行方差分析，選擇出適用于葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的矮牽牛受體品種，以及利用Bar和Spe 作為篩選劑的抗性篩選培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的影響

2.1.1 適合不同品種不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基通過9 個(gè)激素組合和5 次重復(fù)處理，對(duì)比分析4 種不同花色品種的矮牽牛不定芽誘導(dǎo)率，從而確定不同品種誘導(dǎo)不定芽的最適培養(yǎng)基(表2)。

表2 不同質(zhì)量濃度激素對(duì)矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的影響

結(jié)果分析表明(表2)，品種‘Pink Vein’在3 號(hào)培養(yǎng)基中不定芽產(chǎn)生個(gè)數(shù)最多，80 個(gè)外植體中有68個(gè)分化出不定芽，誘導(dǎo)率為85.0%，并且與其他培養(yǎng)基存在顯著差異，確定品種‘Pink Vein’的最適培養(yǎng)基為3 號(hào)培養(yǎng)基，即MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA;品種‘Peppermint’在2 號(hào)培養(yǎng)基中不定芽產(chǎn)生個(gè)數(shù)最多，80 個(gè)外植體中有65 個(gè)分化出不定芽，誘導(dǎo)率為81.3%，且與其他培養(yǎng)基存在極顯著差異，確定品種‘Peppermint’的最適培養(yǎng)基為2 號(hào)培養(yǎng)基，即MS+1.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA;同樣地，品種‘Pink’的最適培養(yǎng)基確定為3 號(hào)培養(yǎng)基，80 個(gè)外植體中有70 個(gè)分化出不定芽，誘導(dǎo)率為87.5%，即MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA為矮牽牛再生的最適培養(yǎng)基(圖2)。品種‘Red’只在1 號(hào)培養(yǎng)基，即MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA 中誘導(dǎo)產(chǎn)生一個(gè)不定芽。在其他培養(yǎng)基中沒有誘導(dǎo)出不定芽。

圖2 在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21 d 時(shí)，‘Pink’矮牽牛葉片不定芽的誘導(dǎo)情況

2.1.2 不定芽誘導(dǎo)最適品種的篩選

為了從4 個(gè)矮牽牛品種中篩選得到哪個(gè)品種更適合不定芽的誘導(dǎo)，分析了培養(yǎng)基中不同激素質(zhì)量濃度與不同品種不定芽誘導(dǎo)之間的關(guān)系，二者之間的二因素多重比較結(jié)果如表3所示。

由表2可以看出，4 個(gè)矮牽牛品種的不定芽誘導(dǎo)率由高到低的順序?yàn)椤甈ink’、‘Pink Vein’、‘Peppermint’、‘Red’。其中，由表3的二因素多重比較結(jié)果可以看出，品種‘Pink’與3 號(hào)培養(yǎng)基組合時(shí)，誘導(dǎo)不定芽的平均數(shù)與其他組合之間的不定芽誘導(dǎo)率存在極顯著差異，而且葉片誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量最多，因此，確定‘Pink’為4 個(gè)矮牽牛品種中最適合不定芽誘導(dǎo)的品種。4 個(gè)矮牽牛品種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的不定芽誘導(dǎo)情況如圖3所示。

表3 不同激素質(zhì)量濃度與不同矮牽牛品種不定芽誘導(dǎo)二因素多重比較

圖3 4 個(gè)矮牽牛品種葉片在各自的最適培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d(A)和30 d(B)時(shí)不定芽的誘導(dǎo)情況

由圖3可以看出，4 個(gè)矮牽牛品種在各自的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d 時(shí)，各個(gè)矮牽牛品種不定芽誘導(dǎo)的頻率沒有明顯差異(圖3A)，但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至30 d 時(shí)，可以明顯地發(fā)現(xiàn)品種‘Pink’與其他3 個(gè)品種之間的差別(圖3B)。品種‘Pink’葉片誘導(dǎo)的不定芽成簇增加，不定芽誘導(dǎo)頻率明顯高于其他3 個(gè)品種的。

2.1.3 不同激素質(zhì)量濃度與品種間因素對(duì)矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的影響

根據(jù)不同激素質(zhì)量濃度下不同品種矮牽牛不定芽方差分析(表4)可看出，品種間因素、品種與激素質(zhì)量濃度間互作因素的概率值均小于0.01，而激素質(zhì)量濃度間的因素概率值小于0.05 且大于0.01，表明品種因素極顯著影響矮牽牛葉片誘導(dǎo)不定芽再生數(shù)量，而激素質(zhì)量濃度顯著影響葉片誘導(dǎo)不定芽再生數(shù)量。說明品種的不同是影響矮牽牛不定芽再生的關(guān)鍵性因素。

表4 不同激素質(zhì)量濃度下不同矮牽牛品種不定芽誘導(dǎo)的方差分析

2.2 雙丙氨膦對(duì)矮牽牛葉片離體培養(yǎng)的影響

以篩選得到的不定芽誘導(dǎo)頻率最高的矮牽牛品種‘Pink’為材料，在其最適的3 號(hào)培養(yǎng)基中，添加不同質(zhì)量濃度的Bar 進(jìn)行梯度篩選，以確定Bar 對(duì)該品種葉片分化的影響，結(jié)果如表5所示。根據(jù)表5中外植體黃化或褐化個(gè)數(shù)分析，當(dāng)用3 mg·L-1Bar處理8 d 時(shí)，16 個(gè)外植體中有8 個(gè)葉片外植體的分化產(chǎn)生明顯的抑制，而當(dāng)Bar 質(zhì)量濃度低于3 mg·L-1時(shí)，其抑制時(shí)間增加，且抑制效果不明顯，高于3 mg·L-1時(shí)，雖然抑制時(shí)間縮短，但抑制劑質(zhì)量濃度過高會(huì)對(duì)不定芽的分化產(chǎn)生不利影響，因此，選擇Bar 最適篩選質(zhì)量濃度為3 mg·L-1。

表5 不同質(zhì)量濃度雙丙氨膦對(duì)葉片外植體分化的影響

從表5可看出，在最適品種‘Pink’、最適3 號(hào)培養(yǎng)基條件下，添加不同質(zhì)量濃度的Bar 第10 天(圖4)，當(dāng)Bar 質(zhì)量濃度為3 mg·L-1時(shí)，對(duì)于離體葉片分化最為敏感，約有一半以上出現(xiàn)黃化現(xiàn)象;到第12 d 時(shí)完全抑制離體葉片分化，葉片幾乎全部褐化，并且在2 周內(nèi)死亡。

2.3 壯觀霉素最適質(zhì)量濃度的篩選

以篩選得到的不定芽誘導(dǎo)頻率最高的矮牽牛品種‘Pink’為材料，在其最適的3 號(hào)培養(yǎng)基中，添加不同質(zhì)量濃度的Spe 進(jìn)行梯度篩選，以確定Spe 對(duì)該品種葉片分化的影響，結(jié)果如表6所示。根據(jù)表6中外植體黃化或褐化個(gè)數(shù)分析，當(dāng)Spe 質(zhì)量濃度為100 mg·L-1處理8 d 時(shí)，16 個(gè)外植體中有7 個(gè)的分化受到明顯抑制;而當(dāng)Spe 質(zhì)量濃度低于100 mg·L-1時(shí)，其抑制增加;盡管當(dāng)Spe 質(zhì)量濃度高于100 mg·L-1時(shí)，抑制時(shí)間縮短，但抑制劑質(zhì)量濃度過高不利于不定芽分化，因此，本研究選擇Spe 最適篩選質(zhì)量濃度為100 mg·L-1。

從表6可看出，在最適品種‘Pink’、最適3 號(hào)培養(yǎng)基條件下，添加不同質(zhì)量濃度Spe 第8 天(圖5)，當(dāng)Spe 質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，對(duì)于離體葉片分化最為敏感，約有一半以上出現(xiàn)黃化現(xiàn)象;到第14天時(shí)完全抑制離體葉片分化，葉片幾乎全部褐化，并且在2 周內(nèi)死亡。

表6 不同質(zhì)量濃度壯觀霉素對(duì)葉片外植體分化的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度雙丙氨膦篩選第10 天時(shí)對(duì)品種‘Pink’葉片外植體分化的影響

3 結(jié)論與討論

選擇某種植物作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，該材料是否能夠具有理想的誘導(dǎo)和再生頻率往往是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵［30-31］。高頻率誘導(dǎo)不定芽有利于后期轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選，而影響不定芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素主要是植物的基因型［32-35］。這和本研究的結(jié)果相吻合。本研究利用4 種不同花色矮牽牛品種的葉片作為外植體，通過激素種類與質(zhì)量濃度之間的不同組合，配制培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽，最終確定品種‘Pink’在質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-16-BA 和質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1NAA 的培養(yǎng)基中，其不定芽的誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)率約為87.5%，適合作為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料;其次，本研究首次利用不定芽誘導(dǎo)頻率最高的品種‘Pink’，在最適培養(yǎng)基上分別進(jìn)行雙丙氨膦和壯觀霉素對(duì)葉片外植體分化的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)雙丙氨膦質(zhì)量濃度為3 mg·L-1、壯觀霉素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，分別對(duì)葉片的分化產(chǎn)生明顯的抑制作用。

許多文獻(xiàn)報(bào)道，激素是影響矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的重要因素［35-37］。本研究借鑒前人在誘導(dǎo)矮牽牛外植體再生時(shí)采用的激素種類及質(zhì)量濃度［38-40］，對(duì)6-BA、NAA 以及6-BA 與IBA 的不同組合在不定芽誘導(dǎo)率方面的作用進(jìn)行對(duì)比。武術(shù)杰等［38］在品種‘Tidal Wave’矮牽牛不定芽誘導(dǎo)中添加3.0 mg·L-16-BA 和0.3 mg·L-1NAA，誘導(dǎo)率為90%，與本試驗(yàn)的誘導(dǎo)率接近。誘導(dǎo)率微小差異的原因可能是由于品種材料的不同造成的。在本試驗(yàn)中，比較品種與激素方差分析結(jié)果表明，品種是影響不定芽分化的主要因素。呂晉慧等［34］在不同矮牽牛品種不定芽誘導(dǎo)研究中，添加0.2 mg·L-1NAA 時(shí)誘導(dǎo)效果最好，并提出NAA 是誘導(dǎo)不定芽的主導(dǎo)激素。本試驗(yàn)中6-BA、NAA 組合(1～3 號(hào)培養(yǎng)基)對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率均高于6-BA、IBA 組合(4～6 號(hào)培養(yǎng)基)，也證明了NAA 是矮牽牛不定芽誘導(dǎo)的主導(dǎo)激素。并且本試驗(yàn)對(duì)前人提出的各方面影響轉(zhuǎn)基因受體材料不定芽誘導(dǎo)因素(激素種類、激素配比、激素質(zhì)量濃度、品種材料等)首次進(jìn)行綜合分析，并在此基礎(chǔ)上首次嘗試添加篩選劑進(jìn)行梯度試驗(yàn)，從而為葉綠體轉(zhuǎn)化方面的研究提供材料基礎(chǔ)。

圖5 不同質(zhì)量濃度壯觀霉素篩選第8 天時(shí)對(duì)品種‘Pink’葉片外植體分化的影響

矮牽牛轉(zhuǎn)基因研究中，綠色熒光蛋白基因gfp和卡那霉素、鏈霉素等常作為報(bào)告基因和抗生素篩選劑［33，39］，而利用雙丙氨膦和壯觀霉素作為篩選劑的報(bào)道甚少。Zubko et al.［23］在矮牽牛葉綠體轉(zhuǎn)化中，培養(yǎng)基中壯觀霉素的篩選質(zhì)量濃度為200 mg·L-1，但未進(jìn)行質(zhì)量濃度梯度篩選。這和本研究結(jié)果不同，原因可能由于品種基因型的差異造成的，也可能是葉綠體轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)基因材料的抗性發(fā)生了變化。本研究在確定雙丙氨膦與壯觀霉素篩選質(zhì)量濃度的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)Bar 在低質(zhì)量濃度篩選時(shí)，外植體葉片黃化或褐化效果明顯優(yōu)于Spe 高質(zhì)量濃度的篩選效果。為了更加高效地篩選出陽性轉(zhuǎn)基因植株，Bar更適合作篩選劑。

在葉綠體基因工程受體材料研究中，存在葉綠體轉(zhuǎn)基因受體材料轉(zhuǎn)化效率較低、葉綠體同質(zhì)化植株很難獲得、宿主植物種類偏少等問題［22-23，41］。本研究中的品種‘Pink’的不定芽誘導(dǎo)率為87.5%，尤其是在后期不定芽分化方面，可以明顯的看出其不定芽成簇增長(zhǎng)。而目前僅有的一篇關(guān)于矮牽牛葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道中，Zubko et al.［23］僅提出激素的質(zhì)量濃度分別為1.0 mg·L-16-BA 和0.1 mg·L-1IAA，并沒有具體說明不定芽誘導(dǎo)情況及誘導(dǎo)率為多少。并且在Zubko et al.［23］關(guān)于矮牽牛葉綠體轉(zhuǎn)化及Wang et al.［22］在煙草葉綠體轉(zhuǎn)化中均提到，葉綠體轉(zhuǎn)化明顯的限制因素是很難獲得同質(zhì)化材料，需要受體材料具備較高的不定芽誘導(dǎo)頻率和再生頻率，并且篩選效果明顯，進(jìn)而從中篩選出獲得完全同質(zhì)化葉綠體轉(zhuǎn)基因材料。因此，本試驗(yàn)首次從葉綠體轉(zhuǎn)化的需求方面考慮，對(duì)影響不定芽誘導(dǎo)率各方面因素進(jìn)行全面分析，為矮牽牛葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化提供最優(yōu)條件。

綜上所述，在本研究開展的4 種矮牽牛品種中，品種‘Pink’不定芽誘導(dǎo)表現(xiàn)最佳，而雙丙氨膦最適作為篩選劑，其最適不定芽誘導(dǎo)及篩選培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+3 mg·L-1Bar。該結(jié)果為今后利用生物技術(shù)改良該品種提供了技術(shù)支持。

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