申 嚴，卓宋明，莊 虹，李 娜，余海彬

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尤文聯(lián)合地塞米松對大鼠急性肺損傷的療效

申 嚴，卓宋明，莊 虹，李 娜，余海彬

目的 明確尤文聯(lián)合地塞米松對大鼠急性肺損傷模型的效果及其相關機制。方法 將96只SD大鼠分別于氣管內(nèi)滴注LPS制備急性肺損傷模型，隨機分為溶媒對照組(LPS組)、英脫利匹特組(ω-6組)、尤文組(ω-3組)、地塞米松組(DXM組)、英脫利匹特+地塞米松組(ω-6+DXM組)、尤文+地塞米松組(ω-3+DXM組)，分別給予相應的干預處理3 d后，HE染色檢測肺組織病理改變，測定PaO2及肺組織濕/干重比(W/D)，ELISA法檢測BALF中相關炎癥因子的含量。結果 LPS組與ω-6組大鼠肺泡隔增厚，肺組織出血、水腫及大量炎性細胞浸潤，肺組織W/D比值明顯高于其他各組；給予地塞米松或尤文后，模型大鼠死亡率降低，肺損傷程度減輕，PaO2升高，BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低(P<0.05)。ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組之間各檢測指標無明顯區(qū)別，而ω-3+DXM組肺組織基本正常，W/D比值最低，PaO2最高，BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯低于其他各組；給予尤文后BALF中IL-10明顯增高，ω-3組與ω-3+DXM組BALF中IL-10明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 尤文聯(lián)合地塞米松可通過調控TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10等相關炎癥因子的表達，減輕肺損傷。

急性肺損傷；脂多糖；尤文；地塞米松；炎癥因子

0 引言

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是由多種炎癥介質和細胞因子介導的，以彌漫性肺泡壁毛細血管通透性增加為特征的炎癥損傷性疾病，往往導致急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭，是臨床常見的危重癥之一[1-2]。糖皮質激素能明顯抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展，是臨床上治療ALI的常用藥物[3]，但目前ALI患者的預后仍不樂觀，死亡率可達67%[4]，能有效延緩ALI進程的治療方案仍在探索之中。研究表明，ω-3魚油脂肪乳注射液(Omegaven，尤文)含有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DXMA)等多不飽和脂肪酸(PUFAs)，可以通過多種分子機制調控機體炎癥和免疫功能，在治療感染性疾病方面比傳統(tǒng)的ω-6脂肪乳(Intralipid，英脫利匹特)具有更廣泛的臨床應用價值[5-6]。本研究通過建立大鼠ALI模型，觀察尤文聯(lián)合地塞米松對ALI大鼠肺組織病理形態(tài)及動脈血氧分壓(PaO2)的影響，同時檢測各組大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量，探討尤文聯(lián)合地塞米松對ALI大鼠的療效及其相關機制，以期為臨床合理用藥治療ALI提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 ALI模型的建立與分組 將96只(200±10)g健康SD大鼠(雌雄各半)分別于氣管內(nèi)滴注LPS(0.2 mg/kg，溶于0.3 mL 0.9%氯化鈉溶液)制備急性肺損傷模型，隨機分為溶媒對照組(LPS組)、英脫利匹特組(ω-6組)、尤文組(ω-3組)、地塞米松組(DXM組)、英脫利匹特+地塞米松組(ω-6+DXM組)、尤文+地塞米松組(ω-3+DXM組)，每組16只大鼠，氣管內(nèi)滴注LPS 10 min后，采用尾靜脈穿刺并固定靜脈留置針，連續(xù)3 d分別給予相應的干預處理，LPS組大鼠注射0.9%氯化鈉注射液、ω-6組注射20%英脫利匹特、ω-3組注射10% ω-3魚油脂肪乳注射液(商品名：尤文)，劑量均為30 mL/(kg·d)，DXM組注射地塞米松注射液3 mg/kg(溶于等量0.9%氯化鈉溶液)，ω-6+DXM組及ω-3+DXM組分別聯(lián)合注射等量地塞米松(3 mg/kg)和ω-6或ω-3[30 mL/(kg·d)]。LPS購自武漢博士德生物工程有限公司，0.9%氯化鈉溶液、地塞米松注射液、20%英脫利匹特、10%尤文均購自上海華瑞制藥有限公司。

1.2 觀察各組大鼠死亡率，測定PaO2及肺組織濕/干重比 干預處理3 d后，將各組存活的大鼠經(jīng)心臟穿刺抽取2 mL血液注入肝素抗凝管，采用血氣分析儀測定PaO2。采集心臟血后，取出左側肺，稱取濕重后，置于80 ℃烤箱中烤至恒重，稱干重，計算肺組織濕/干重比(W/D)。

1.3 BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量測定 結扎左側肺門，于氣管下段作一小T形切口，插入12號針頭，用注射器吸取2.5 mL 0.9%氯化鈉溶液行右肺肺泡灌洗，首先以較小的壓力將鹽水緩慢注入肺內(nèi)，再緩慢回抽灌洗液，然后將所得液體緩慢注回肺內(nèi)，如此反復約5次后回抽液體，注入15 mL離心管，然后重復3次上述操作，回收總量約6 mL肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，4 ℃1 500 r/min離心10 min，上清液放入-70 ℃冰箱中保存，ELISA法測定BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學改變 留取肺泡灌洗液后，將套管針插入右心室，在左心耳剪一長約2 mm切口，同時向右心室灌注加入肝素的0.9%氯化鈉溶液，直至將肺血管床血液沖洗干凈，取右下肺組織于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察肺組織病理形態(tài)學改變。

2 結果

2.1 ALI模型大鼠死亡率、PaO2及肺組織W/D比值變化 LPS處理制作ALI模型后，各組大鼠均有部分發(fā)生死亡，LPS組及ω-6組各死亡6只大鼠，ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組均有2只大鼠死亡，其死亡率低于LPS組及ω-6組，但差異無統(tǒng)計學意義；ω-3+DXM組有1只大鼠死亡，其死亡率明顯低于LPS組及ω-6組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。LPS組及ω-6組PaO2明顯低于其他各組，肺組織W/D比值明顯高于其他各組；聯(lián)合給予尤文及地塞米松(ω-3+DXM組)后，PaO2達(92.72±8.36)mmHg，明顯高于其他各組，肺組織W/D比值顯著降低，明顯低于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義。ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組間PaO2及肺組織W/D比值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠死亡率、PaO2及肺組織W/D比值的比較

注：與LPS組及ω-6組比較，*P<0.05；與ω-3組、DXM組及ω-6+DXM組比較，#P<0.05

2.2 BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量測定 LPS組與ω-6組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。DXM組、ω-6+DXM組及ω-3組的BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低，ω-3+DXM組BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組之間TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較差異無統(tǒng)計學意義；給予尤文后BALF中IL-10明顯增高，ω-3組及ω-3+DXM組BALF中IL-10明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 肺組織病理學改變 LPS組及ω-6組大鼠肺組織彌漫性充血水腫，肺泡隔增厚，血管周圍及肺泡腔內(nèi)有較多滲出液，肺間質可見大量多形核白細胞浸潤(圖1A、B)。給予地塞米松或尤文干預處理后，大鼠肺組織病變明顯減輕，ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組肺泡結構較清晰，肺間質可見少量多形核白細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少量滲出液(圖1C、D、E)；而聯(lián)合給予尤文及地塞米松后，肺組織結構基本正常，肺泡結構清楚，無明顯充血、水腫及炎性細胞的浸潤(圖1F)。

表2 各組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量的比較

注：*與LPS組、ω-6組比較，*P<0.05；#與ω-3+DXM組比較，P<0.05；&與ω-3，P<0.05

3 討論

ALI為常見的臨床疾病，存在肺泡上皮和內(nèi)皮細胞的損傷，往往迅速進展為肺水腫以及肺動脈高壓，表現(xiàn)為急性發(fā)作的低氧血癥，其機制是炎性細胞和促炎介質經(jīng)血液循環(huán)被轉運入肺內(nèi)誘發(fā)彌漫性肺內(nèi)病變，ALI具有與急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)相同的病理生理改變，嚴重的ALI或ALI的最終嚴重階段就是ARDS[2,7-8]。研究表明，ALI的本質是炎癥反應，因此，抗炎成為治療ALI的積極策略?；谔瞧べ|激素能通過抑制NF-κB與相關基因上的NF-κB位點結合，抑制炎癥細胞因子mRNA的轉錄，減少炎癥因子的生成，從而減輕炎癥反應，因而糖皮質激素是臨床上治療ALI的常用藥物，但在應用糖皮質激素治療ALI的時機及聯(lián)合用藥方案上一直存在爭議[3,9-10]。因此，開展ALI發(fā)生后糖皮質激素治療時機、用藥方案和作用機制的研究，對于指導ALI的臨床治療具有積極的意義。

尤文富含ω-3多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，主要成分有α-亞麻酸、EPA和DXMA等。文獻報道，ω-3 PUFAs通過減少促

圖1 肺組織病理學改變光鏡下觀察(HE染色)

炎介質如巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)和血栓素B2(TXB2)的生成，減少中性粒細胞侵入肺泡內(nèi)，對實驗性肺損傷有一定的預防和治療作用[11-12]。而英脫利匹特主要含有亞油酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸(AA)等ω-6 PUFAs，其中AA是脂質炎癥遞質的前體，通過環(huán)氧化酶、脂氧化酶、細胞色素P450途徑，可以產(chǎn)生多種炎癥遞質，如前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)等，進而促進IL-1的產(chǎn)生及炎癥反應[13]。本研究顯示，氣管內(nèi)滴入LPS并給予溶媒或英脫利匹特注射處理3 d后，大鼠動脈血PaO2<70 mmHg，肺組織W/D比值明顯高于其他各組，HE染色顯示肺間質內(nèi)大量炎性細胞浸潤，肺泡隔明顯增寬，肺組織病理評分明顯高于其他各組；給予地塞米松或尤文干預處理后，PaO2升高，肺組織病變明顯減輕，ω-3組、DXM組、ω-6+DXM組肺組織病理評分之間差異無統(tǒng)計學意義；而聯(lián)合給予尤文及地塞米松后，ALI大鼠死亡率降低，PaO2進一步升高，達90 mmHg以上，肺泡結構清楚，無明顯充血、水腫及炎性細胞的浸潤，肺組織結構基本正常，表明給予英脫利匹特對ALI大鼠模型無明顯療效，而給予尤文或地塞米松均能明顯減輕ALI大鼠肺組織病變，改善PaO2，降低死亡率，且尤文與地塞米松聯(lián)合應用后對ALI大鼠模型肺組織具有協(xié)同效應，這也為臨床治療ALI等炎性疾病應選擇尤文而不是選擇英脫利匹特提供了實驗依據(jù)。

IL-6是急性炎性反應中的一種多功能細胞因子，具有廣泛的生物活性和免疫調節(jié)作用，是啟動全身炎癥反應最強的內(nèi)源性炎癥因子，主要由TNF-α、IL-1β刺激巨噬細胞分泌，轉錄由NF-κB所介導，與TNF-α、IL-1β一起被稱作“前炎性細胞因子”[14-15]。研究表明，а7nAChR激動劑能通過抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生，阻斷炎癥激活的惡性循環(huán)，減輕大鼠腸缺血再灌注后急性肺損傷，改善肺功能[16]。且尤文中富含的EPA和DXMA等ω-3 PUFAs也可以抑制人單核細胞的I-κB磷酸化及NF-κB的激活，進而抑制TNF-α等炎性因子產(chǎn)生，降低炎性反應[15,17]。本研究表明，給予地塞米松或尤文干預處理后，BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯降低，聯(lián)合給予地塞米松和尤文干預處理后，BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低更明顯，表明尤文與地塞米松一樣能通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減輕ALI大鼠肺組織病變，且尤文與地塞米松聯(lián)合應用能產(chǎn)生協(xié)同效應，能進一步抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生。

IL-10是重要的內(nèi)源性抗炎因子之一，具有強有力的抗炎作用，能夠廣泛抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎介質生成。ARDS患者IL-10水平明顯下降，且其水平的降低與病死率高度相關[18]。扶志敏等[19]在關于兔的急性肺損傷中也發(fā)現(xiàn)，ω-3 PUFAs可以上調IL-10的表達。此外，S100A8在體內(nèi)能通過抑制肥大細胞活化及NF-κB通路，誘導IL-10產(chǎn)生，減輕小鼠急性肺損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予地塞米松處理后，BALF中IL-10水平較LPS組稍高，但差異無統(tǒng)計學意義；而給予尤文后，BALF中IL-10水平明顯增高，ω-3組及ω-3+DXM組BALF中IL-10水平均明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義，表明尤文還能通過促進IL-10的表達抑制ALI模型的炎癥反應。至于尤文通過何種機制調控IL-10的表達有待進一步研究。

綜上所述，尤文聯(lián)合地塞米松能對ALI治療產(chǎn)生協(xié)同效應，兩者通過促進IL-10產(chǎn)生，抑制ALI大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎介質生成，減輕ALI大鼠肺組織病變，英脫利匹特對ALI大鼠模型無明顯療效，這為臨床盡早選擇ω-3脂肪乳聯(lián)合地塞米松治療ALI患者提供了重要的實驗依據(jù)。

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Effects of omeganven combined with dexamethasone on rat model with acute lung injury

SHEN Yan,ZHUO Song-ming,ZHUANG Hong,LI Na,YU Hai-bin

(Department of Respiratory Medicine,Longgang District Central Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518116,China)

Objective To explore the effects of omeganven combined with dexamethasone on the acute lung injury of rat model and the mechanism.Methods Ninety-six SD rats were treated with lipopolysaccharide (LPS) by intratracheal instillation to induce acute lung injury,and they were randomly divided into control group (LPS group),intralipid group (ω-6 group),omeganven group (ω-3 group),dexamethasone group (DXM group),intralipid+dexamethasone group (ω-6+DXM group) and omeganven+dexamethasone group (ω-3+DXM group).After 3 d of corresponding treatment,the pathologic changes in lung tissue section,wet/dry weight ratio (W/D) of lung tissue and PaO2were measured.The concentration of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in broncho-alveolar lavage fluid (BALF) were respectively measured by ELISA.Results In rats of LPS group and ω-6 group,alveolar septum thickening,lung hemorrhage,edema and inflammatory cell infiltration in lung tissue were easily seen,and W/D ratio of lung tissue was significantly higher than that of another groups.Among rats of ω-3 group,DXM group and ω-6+DXM group,there was no obvious difference in pathological changes,and the level of TNF-α,IL-1β and IL-6 in BALF,however,the indexes decreased significantly after treatment in DXM group and ω-3 group.In rats of ω-3+DXM group,the structure of lung tissue was almost normal,and the W/D ratio and the levels of TNF-α,IL-1β and IL-6 in BALF were the lowest(P<0.05).Furthermore,the level of IL-10 in BALF increased remarkably after treatment with omeganven,and it was obviously higher in rats of ω-3 group and ω-3+DXM group (P<0.05).Conclusion Omeganven combined with dexamethasone can relieve lung injury through regulating the expression of inflammatory factor in BALF such as TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in rats with acute lung injury.

Acute lung injury;Lipopolysaccharide;Omeganven;Dexamethasone;Inflammatory factor

2015-04-15

深圳市龍崗中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，深圳 518116

10.14053/j.cnki.ppcr.201511009