利用多重PCR技術(shù)檢測羊肉中摻雜狐貍?cè)獾姆椒ㄑ芯?/h1>
2015-03-10 13:22:09張全芳馬德源劉艷艷梁水美楊雪馮
山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
張全芳+馬德源+劉艷艷+梁水美+楊雪+馮夢秋+史學(xué)芹+卞如如+李燕+岳鳴鳴+步迅
摘要：本研究根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設(shè)計特異性引物，其擴(kuò)增片段大小分別為401、450 bp和300 bp，從而可在一個PCR反應(yīng)中同時鑒別山羊、綿羊和狐貍?cè)N源性成分，檢測靈敏度高。
關(guān)鍵詞：多重PCR；山羊；綿羊；狐貍；源性鑒定
中圖分類號：Q819+R155文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0004-04
隨著人們生活水平的不斷提高，對肉產(chǎn)品的需求量越來越大。但肉制品摻雜摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等手段。例如一些不法商家或個人為了追求自身利益用低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，尤以摻雜異種肉（如用雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉等）的造假行為最為常見[1]。2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件顯示，不法商家將未經(jīng)檢驗(yàn)的狐貍、水貂、老鼠等肉品摻雜至羊肉中，銷往上海等多地的農(nóng)貿(mào)市場。這些摻假肉類微生物嚴(yán)重超標(biāo)，投入市場嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的健康。
目前，對肉類的鑒別方法主要有：顯微鏡觀察法，通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進(jìn)行肉類來源的判別；蛋白質(zhì)檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法；DNA檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴(kuò)增[2]。基于顯微鏡及蛋白質(zhì)的鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，且具有極大的主觀性，主要用于生鮮肉類的鑒別。在熟肉制品中，蛋白質(zhì)遇高溫易變性，利用蛋白質(zhì)檢測法無法靈敏地檢測其肉質(zhì)種源。除此之外，這些方法存在成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點(diǎn)。分子生物學(xué)鑒定中的DNA雜交法費(fèi)時、昂貴且復(fù)雜，而PCR方法由于反應(yīng)時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為肉制品品種鑒別中最常用的方法[2，3]。目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計物種特異性引物建立的PCR與實(shí)時熒光PCR方法已有大量報道，且進(jìn)入了中國權(quán)威的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[4，5]。PCR方法可以解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，多重PCR技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便性的特點(diǎn)，使肉類及其制品種類鑒定成為可能[6]。
本研究根據(jù)動物線粒體16S rRNA基因的差異性位點(diǎn)，設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立了正向引物共用、反向引物特異的PCR反應(yīng)體系，一次PCR反應(yīng)可同時擴(kuò)增出三個不同物種（綿羊、山羊、狐貍）的特異性片段。該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，且操作簡單易行，有望成為常規(guī)檢測的有效方法。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1供試材料用于陽性對照的山羊肉和綿羊肉（生肉、熟肉制品）樣品及待檢測樣品購自濟(jì)南超市及市場，狐貍?cè)鈦碜耘钊R市新港街道辦事處劉家旺村狐貍養(yǎng)殖場。
1.1.2主要試劑和儀器動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP304-02，天根）；2×Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。儀器：PCR擴(kuò)增儀（Veritee96-well，TaKaRa公司）；核酸電泳儀（Power PA 200，Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（5430R，Eppendorf公司）。
1.1.3PCR引物的設(shè)計根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號分別為AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）設(shè)計并確定各自特異引物， 三個物種的編號分別為：山羊-SY、綿羊-MY、狐貍-H，具體信息見表1。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1肉類總DNA的提取使用滅菌打孔器，采用三層五點(diǎn)取樣法在山羊肉、綿羊肉、狐貍?cè)夂痛龣z樣品的不同部位取樣，置于滅菌研缽中剪碎，加入液氮充分研磨。按照試劑盒說明進(jìn)行基因組DNA提取。50 mg樣品的總DNA均溶解于100 μL TE 緩沖液中，于OD260/OD280測定吸光度值，計算DNA濃度和純度。
1.2.2PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件反應(yīng)體系（25 μL）為：rTaq（2.5 U/μL）0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，SYS1 （2 μmol/L） 2.0 μL、SYA （2 μmol/L） 1.5 μL、MYA （2 μmol/L） 1.0 μL、HA （2 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 12.85 μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。
1.2.3引物特異性試驗(yàn)使用上述反應(yīng)體系及條件，分別對3種目標(biāo)肉類和兩兩等比例混合最終完全混合DNA標(biāo)本及非目標(biāo)肉類等材料（牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、小麥）的DNA標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對山羊、綿羊、狐貍?cè)豍CR引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證與比較，重復(fù)2次。
1.2.4摻雜肉類敏感性試驗(yàn)將山羊、綿羊和狐貍?cè)獾娜駾NA分別用分光光度計將濃度定量到10 ng/μL，將山羊肉/狐貍?cè)?、綿羊肉/狐貍?cè)獍凑毡?的比例進(jìn)行混勻，參照上述PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測，重復(fù)2次。
2結(jié)果與分析
2.1山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR引物特異性試驗(yàn)
PCR結(jié)果見圖1，山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)夥謩e得到401、450、300 bp的單一條帶，無非特異性雜帶；山羊肉/綿羊肉、山羊肉/狐貍?cè)?、綿羊肉/狐貍?cè)狻⑸窖蛉?綿羊肉/狐貍?cè)獾幕旌螪NA擴(kuò)增條帶清晰，能夠清楚分辨不同肉類來源的條帶；而小麥、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉及空白對照均沒有擴(kuò)增出條帶，說明引物的特異性強(qiáng)。
2.2山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR摻雜肉類敏感性試驗(yàn)
將狐貍?cè)釪NA分別按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例與綿羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳檢測擴(kuò)增效果。從圖2可以看出，在綿羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗(yàn)中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于2%的狐貍?cè)獬煞帧膱D3可以看出，在山羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗(yàn)中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于20%的狐貍?cè)獬煞?。結(jié)果顯示狐貍?cè)夂途d羊肉摻雜在一起的檢測敏感性要比山羊肉和狐貍?cè)鈸诫s在一起的檢測敏感性高。
3討論
在動物源性成分鑒定中，多重PCR技術(shù)是較為常用的鑒定方法之一。多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。以多重PCR為基礎(chǔ)的肉類成分鑒別技術(shù)具有檢測通量高、儀器設(shè)備簡單、操作方便且檢測費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，它解決了傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，還可以鑒定肉加工類樣品[7，8]。
本試驗(yàn)在參考前人研究的基礎(chǔ)上，基于物種間線粒體16S rRNA基因的序列差異，建立了三種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。本方法可以特異地分辨出綿羊肉、山羊肉、狐貍?cè)馊N不同的肉類源性成分，在綿羊肉中可以分辨出含量高于2%的狐貍?cè)?，在山羊肉中只可以分辨出含量高?0%的狐貍?cè)?，可能是由于山羊肉和狐貍?cè)饣蚪M存在競爭性擴(kuò)增或者引物的設(shè)計及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)冉档土似潇`敏度。
目前，針對鴨肉、豬肉、雞肉和馬肉等可能摻假肉類的檢測已經(jīng)成熟[9～11]，對越來越復(fù)雜的羊肉摻假現(xiàn)象，相關(guān)檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展。未來動物源性食品檢測技術(shù)的研究將致力于提高靈敏度和特異性，開發(fā)各種肉類配套的試劑盒產(chǎn)品，這樣對于各種動物源性肉類及肉制品的檢測將會更加系統(tǒng)快捷。
參考文獻(xiàn)：
[1]劉帥帥，李宏，羅世芝，等. PCR 技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2011， 2（6）： 280-284.
[2]王建昌，王金鳳，陳瑞春，等. 鴨肉冒充牛羊肉的分子生物學(xué)檢測[J].肉類研究， 2012， 6（21）：20-23.
[3]王可，張玉玉，崔緒奎，等.微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒別羊肉真?zhèn)畏椒ǖ慕⒓皯?yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（6）：16-18.
[4]何瑋玲， 張馳， 楊靜，等. 食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012， 45（9）：1873-1880.
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[6]曾少靈， 秦智鋒， 阮周曦，等. 多重實(shí)時熒光PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[J]. 生物工程學(xué)報， 2009， 25（1）： 139-146.
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[11]李杰，喬緒穩(wěn)，余興龍，等. 快速鑒定豬肉和牛肉多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)， 2011 （2）：13-15.
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隨著人們生活水平的不斷提高，對肉產(chǎn)品的需求量越來越大。但肉制品摻雜摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等手段。例如一些不法商家或個人為了追求自身利益用低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，尤以摻雜異種肉（如用雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉等）的造假行為最為常見[1]。2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件顯示，不法商家將未經(jīng)檢驗(yàn)的狐貍、水貂、老鼠等肉品摻雜至羊肉中，銷往上海等多地的農(nóng)貿(mào)市場。這些摻假肉類微生物嚴(yán)重超標(biāo)，投入市場嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的健康。
目前，對肉類的鑒別方法主要有：顯微鏡觀察法，通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進(jìn)行肉類來源的判別；蛋白質(zhì)檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法；DNA檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴(kuò)增[2]。基于顯微鏡及蛋白質(zhì)的鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，且具有極大的主觀性，主要用于生鮮肉類的鑒別。在熟肉制品中，蛋白質(zhì)遇高溫易變性，利用蛋白質(zhì)檢測法無法靈敏地檢測其肉質(zhì)種源。除此之外，這些方法存在成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點(diǎn)。分子生物學(xué)鑒定中的DNA雜交法費(fèi)時、昂貴且復(fù)雜，而PCR方法由于反應(yīng)時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為肉制品品種鑒別中最常用的方法[2，3]。目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設(shè)計物種特異性引物建立的PCR與實(shí)時熒光PCR方法已有大量報道，且進(jìn)入了中國權(quán)威的檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[4，5]。PCR方法可以解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，多重PCR技術(shù)具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟(jì)簡便性的特點(diǎn)，使肉類及其制品種類鑒定成為可能[6]。
本研究根據(jù)動物線粒體16S rRNA基因的差異性位點(diǎn)，設(shè)計特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，建立了正向引物共用、反向引物特異的PCR反應(yīng)體系，一次PCR反應(yīng)可同時擴(kuò)增出三個不同物種（綿羊、山羊、狐貍）的特異性片段。該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，且操作簡單易行，有望成為常規(guī)檢測的有效方法。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1供試材料用于陽性對照的山羊肉和綿羊肉（生肉、熟肉制品）樣品及待檢測樣品購自濟(jì)南超市及市場，狐貍?cè)鈦碜耘钊R市新港街道辦事處劉家旺村狐貍養(yǎng)殖場。
1.1.2主要試劑和儀器動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP304-02，天根）；2×Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。儀器：PCR擴(kuò)增儀（Veritee96-well，TaKaRa公司）；核酸電泳儀（Power PA 200，Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；臺式高速冷凍離心機(jī)（5430R，Eppendorf公司）。
1.1.3PCR引物的設(shè)計根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號分別為AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）設(shè)計并確定各自特異引物， 三個物種的編號分別為：山羊-SY、綿羊-MY、狐貍-H，具體信息見表1。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1肉類總DNA的提取使用滅菌打孔器，采用三層五點(diǎn)取樣法在山羊肉、綿羊肉、狐貍?cè)夂痛龣z樣品的不同部位取樣，置于滅菌研缽中剪碎，加入液氮充分研磨。按照試劑盒說明進(jìn)行基因組DNA提取。50 mg樣品的總DNA均溶解于100 μL TE 緩沖液中，于OD260/OD280測定吸光度值，計算DNA濃度和純度。
1.2.2PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件反應(yīng)體系（25 μL）為：rTaq（2.5 U/μL）0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，SYS1 （2 μmol/L） 2.0 μL、SYA （2 μmol/L） 1.5 μL、MYA （2 μmol/L） 1.0 μL、HA （2 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 12.85 μL。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。
1.2.3引物特異性試驗(yàn)使用上述反應(yīng)體系及條件，分別對3種目標(biāo)肉類和兩兩等比例混合最終完全混合DNA標(biāo)本及非目標(biāo)肉類等材料（牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、小麥）的DNA標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對山羊、綿羊、狐貍?cè)豍CR引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證與比較，重復(fù)2次。
1.2.4摻雜肉類敏感性試驗(yàn)將山羊、綿羊和狐貍?cè)獾娜駾NA分別用分光光度計將濃度定量到10 ng/μL，將山羊肉/狐貍?cè)?、綿羊肉/狐貍?cè)獍凑毡?的比例進(jìn)行混勻，參照上述PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測，重復(fù)2次。
2結(jié)果與分析
2.1山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR引物特異性試驗(yàn)
PCR結(jié)果見圖1，山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)夥謩e得到401、450、300 bp的單一條帶，無非特異性雜帶；山羊肉/綿羊肉、山羊肉/狐貍?cè)?、綿羊肉/狐貍?cè)狻⑸窖蛉?綿羊肉/狐貍?cè)獾幕旌螪NA擴(kuò)增條帶清晰，能夠清楚分辨不同肉類來源的條帶；而小麥、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉及空白對照均沒有擴(kuò)增出條帶，說明引物的特異性強(qiáng)。
2.2山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR摻雜肉類敏感性試驗(yàn)
將狐貍?cè)釪NA分別按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例與綿羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳檢測擴(kuò)增效果。從圖2可以看出，在綿羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗(yàn)中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于2%的狐貍?cè)獬煞帧膱D3可以看出，在山羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗(yàn)中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于20%的狐貍?cè)獬煞?。結(jié)果顯示狐貍?cè)夂途d羊肉摻雜在一起的檢測敏感性要比山羊肉和狐貍?cè)鈸诫s在一起的檢測敏感性高。
3討論
在動物源性成分鑒定中，多重PCR技術(shù)是較為常用的鑒定方法之一。多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對以上引物，同時擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)。以多重PCR為基礎(chǔ)的肉類成分鑒別技術(shù)具有檢測通量高、儀器設(shè)備簡單、操作方便且檢測費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，它解決了傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，還可以鑒定肉加工類樣品[7，8]。
本試驗(yàn)在參考前人研究的基礎(chǔ)上，基于物種間線粒體16S rRNA基因的序列差異，建立了三種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。本方法可以特異地分辨出綿羊肉、山羊肉、狐貍?cè)馊N不同的肉類源性成分，在綿羊肉中可以分辨出含量高于2%的狐貍?cè)?，在山羊肉中只可以分辨出含量高?0%的狐貍?cè)?，可能是由于山羊肉和狐貍?cè)饣蚪M存在競爭性擴(kuò)增或者引物的設(shè)計及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)冉档土似潇`敏度。
目前，針對鴨肉、豬肉、雞肉和馬肉等可能摻假肉類的檢測已經(jīng)成熟[9～11]，對越來越復(fù)雜的羊肉摻假現(xiàn)象，相關(guān)檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展。未來動物源性食品檢測技術(shù)的研究將致力于提高靈敏度和特異性，開發(fā)各種肉類配套的試劑盒產(chǎn)品，這樣對于各種動物源性肉類及肉制品的檢測將會更加系統(tǒng)快捷。
參考文獻(xiàn)：
[1]劉帥帥，李宏，羅世芝，等. PCR 技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2011， 2（6）： 280-284.
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