金瑞日　鮑曉榮

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腎內(nèi)科， 上?！?01508)

·論著·

活性維生素D對(duì)大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的影響及其機(jī)制研究

金瑞日鮑曉榮

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院腎內(nèi)科， 上海201508)

摘要目的：觀(guān)察活性維生素D3對(duì)大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的影響及其可能機(jī)制。方法： 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)、UUO+低劑量活性維生素D3組(LV組)、UUO+大劑量活性維生素D3組(HV組)，每組10只。采用單側(cè)(左)輸尿管結(jié)扎法建立梗阻性腎小管間質(zhì)纖維化大鼠模型。Sham組只游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎。LV組與HV組分別予以0.03 μg/(kg·d) 、0.06 μg/(kg·d)活性維生素D3(溶于花生油)腹腔注射，Sham組和UUO組均予以等體積花生油腹腔注射。術(shù)后14 d處死大鼠，采集血、腎臟標(biāo)本，并檢測(cè)血清鈣、磷、肌酐(SCr)、甲狀旁腺激素(PTH)。制作腎臟病理組織切片，行H-E、Masson染色，在光鏡下觀(guān)察腎小管間質(zhì)損傷及纖維化情況。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎小管間質(zhì)中α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)的表達(dá)。結(jié)果： 與UUO組相比，LV組和HV組SCr水平[(39.0±1.83) μmol/L、(36.0±2.11) μmol/L 比(43.1±5.55) μmol/L]、腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)(2.00±0.12、1.70±0.10比2.80±0.11)、α-SMA表達(dá)(0.22±0.02、0.20±0.03比 0.24±0.02)、TGF-β表達(dá)(0.26±0.03、0.25±0.03 比 0.32±0.04) 均顯著下降 (P<0.05), E-cadherin表達(dá) (0.30±0.08、0.34±0.11比 0.22±0.07)明顯升高。與LV組相比，HV組SCr水平腎間質(zhì)纖維化指數(shù)、腎間質(zhì)損傷指數(shù)、α-SMA表達(dá)、TGF-β表達(dá)明顯下降(P<0.05), E-cadherin表達(dá)上升(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，TGF-β、α-SMA表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化指數(shù)正相關(guān)，E-cadherin表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化指數(shù)負(fù)相關(guān)；TGF-β表達(dá)與α-SMA表達(dá)正相關(guān)，E-cadherin與TGF-β負(fù)相關(guān)；α-SMA表達(dá)與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)。結(jié)論： 活性維生素D3可改善UUO大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，大劑量活性維生素D3改善作用優(yōu)于小劑量，其機(jī)制可能是：通過(guò)抑制TGF-β的過(guò)度表達(dá)從而抑制UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)而改善腎小管間質(zhì)纖維化。

關(guān)鍵詞活性維生素D3； 腎小管間質(zhì)纖維化； 腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

Effect of Active Vitamin D3on Rat Renal Tubulointerstitial Fibrosis and Its Possible MechanismJINRuiriBAOXiaorongDepartmentofNephrology，JinshanHospital，F(xiàn)udanUniversity，Shanghai201508，China

AbstractObjective： To observe the effect of active vitamin D3on renal tubulointerstitial fibrosis and its possible mechanism. Methods： Forty male SD rats were randomly divided into four groups： sham operation group(Sham group，n=10)，unilateral ureteral obstruction (UUO) model group (UUO group，n=10)，UUO model treated with low dose of active vitamin D3group(LV group，n=10)， and UUO model treated with high dose of active vitamin D3group (HV group，n=10). UUO model was estabished by ligating the left ureter. The left ureter was only dissociated without ligation in Sham group. LV group and HV group were given active vitamin D3(dissolved in peanut oil) at a dose of 0.03 μg/(kg·d) and 0.06 μg/(kg·d), respectively, by intraperitoneal injection. Sham group and UUO group were given the same volume of peanut oil by intraperitoneal injection. Rats were killed 14 days after surgery. Blood and kidney samples were collected. And serum calcium, phosphorus, creatinine (SCr), and parathyroid hormone (PTH) were detected. The kidney pathological changes involving renal tubulointerstitial injury and fibrosis, were observed after H-E and Masson staining with optical microscope. The expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA)、E-cadherin, and transforming grow factor β(TGF-β)in renal tubulointerstitial tissues were detected by immunohistochemistry. Results： Compared with those in UUO group， the SCr level ([39.0±1.83] μmol/L, [36.0±2.11] μmol/Lvs. [43.1±5.55] μmol/L), tubulointerstitial fibrosis index (2.00±0.12, 1.70±0.10vs. 2.80±0.11), expression of α-SMA (0.22±0.02, 0.20±0.03vs. 0.24±0.02), and expression of TGF-β (0.26±0.03, 0.25±0.03vs. 0.32±0.04) in LV group and HV group decreased significantly (P<0.05), while the expression of E-cadherin (0.30±0.08,0.34±0.11vs. 0.22±0.07) increased. Compared with those in LV group, the SCr level, tubulointerstitial fibrosis index, tubulointerstitial injury index, expression of α-SMA, and expression of TGF-β, in HV group decreased significantly (P<0.05), while the expression of E-cadherin increased (P<0.05). Correlation analysis showed that the expressions of TGF-β and α-SMA were positively correlated with tubulointerstitial fibrosis index. E-cadherin was negatively correlated with tubulointerstitial fibrosis index.TGF-β was positively correlated with α-SMA.E-cadherin was negatively correlated with TGF-β. α-SMA was negatively correlated with E-cadherin. Conclusions： Active vitamin D3can relieve renal tubulointerstitial fibrosis in UUO rats. Its possible mechanism is that the tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation(EMT) is suppressed by inhibiting the over expression of TGF-β so as to relieve the renal tubulointerstitial fibrosis. The effect of the high dose of active vitamin D3for relieving renal tubulointerstitial fibrosis is superior to that of low dose of active vitamin D3.

Key WordsActive vitamin D3;Renal tubulointerstitial fibrosis;Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation;Transforming grow factor β

慢性腎臟病目前已成為危害人類(lèi)健康的主要疾病之一。腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病進(jìn)入終末期的共同病理特征。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)、肝細(xì)胞因子(hepatocyte growth factor,HGF)等參與調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化，其中TGF-β通過(guò)SMAD受體促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation, TEMT)被認(rèn)為是促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化最重要的途徑之一。目前，改善或延緩腎小管間質(zhì)纖維化的藥物仍然較少且治療效果欠佳，故進(jìn)一步探索腎小管間質(zhì)纖維化的治療具有重要意義?；钚跃S生素D3近年來(lái)逐漸受到關(guān)注，研究[1-4]發(fā)現(xiàn)其具有降低蛋白尿、保護(hù)腎臟的作用，但關(guān)于其改善腎小管間質(zhì)纖維化的研究較少。本研究擬通過(guò)單側(cè)輸尿管結(jié)扎法(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立腎間質(zhì)纖維化模型，并予以不同劑量活性維生素D3干預(yù)，通過(guò)檢測(cè)大鼠腎功能、腎臟損傷和纖維化情況及腎臟纖維化相關(guān)因子的表達(dá)水平等探討活性維生素D3對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的影響及可能的機(jī)制。

1資料與方法

1.1主要材料及試劑健康雄性SD大鼠40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～220 g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。骨化三醇由山東青島正大海爾制藥有限公司提供(批號(hào)：1311087)；兔抗大鼠TGF-β抗體、兔抗大鼠E鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、兔抗大鼠α-SMA抗體、抗大鼠甲狀旁腺激素(PTH)單抗均由江蘇南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.2模型建立及分組將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組) 、UUO+低劑量活性維生素D3組(LV組)、UUO+大劑量活性維生素D3組(HV組)，每組10只。UUO組、LV組、HV組于左側(cè)腎臟近腎門(mén)處結(jié)扎輸尿管，再于輸尿管遠(yuǎn)離腎門(mén)處二次結(jié)扎；Sham組只游離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎。LV組術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始予以0.03 μg/(kg·d)活性維生素D3(溶于花生油，0.3 mL)腹腔注射，HV組術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始予以 0.06 μg/(kg·d) 活性維生素D3(溶于花生油，0.3 mL)腹腔注射，Sham組和UUO組腹腔注射等體積的花生油。手術(shù)及腹腔注射均嚴(yán)格采用無(wú)菌操作，減少腹腔感染風(fēng)險(xiǎn)。各組大鼠在恒溫、自然光照周期環(huán)境下飼養(yǎng)，予以普通飼料并正常飲水，觀(guān)察至術(shù)后2周。

1.3標(biāo)本采集和檢測(cè)

1.3.1標(biāo)本采集術(shù)后14 d，用氯胺酮麻醉大鼠后經(jīng)心臟取血，并取左側(cè)腎臟組織標(biāo)本。

1.3.2血指標(biāo)檢測(cè)應(yīng)用瑞士羅氏公司P800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐(SCr)、鈣、磷。用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)PTH。

1.3.3腎臟病理學(xué)檢查腎臟組織經(jīng)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋，切成3 μm的薄片后，予以H-E及Masson染色，由兩位不參與本實(shí)驗(yàn)的病理科醫(yī)師獨(dú)立在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腎臟組織病理學(xué)改變。H-E染色評(píng)定：在100倍光鏡視野下，依據(jù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、腎小管內(nèi)棕紅色針狀結(jié)晶沉積于小管、腎小管間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管分離8項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)腎間質(zhì)損傷指數(shù)[5]。Masson染色評(píng)定：在200倍光鏡視野下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)互不重疊的腎小管間質(zhì)視野，觀(guān)察纖維組織陽(yáng)性面積。根據(jù)視野中膠原染色陽(yáng)性面積占整個(gè)視野面積的百分比進(jìn)行半定量評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，陽(yáng)性面積<2%；1分，陽(yáng)性面積2%~10%，為輕度病變；2分，陽(yáng)性面積占11%~20%，為中度病變；3分，陽(yáng)性面積占21%~30%，為重度病變；4分，陽(yáng)性面積>30%，為極重度病變。10個(gè)視野評(píng)分的平均值即為該標(biāo)本的腎間質(zhì)纖維化指數(shù)。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色石蠟切片脫蠟水化，微波修復(fù)，采用S-P免疫組化試劑盒，采用兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶50)、兔抗大鼠E-cadherin多克隆抗體(1∶50)、兔抗大鼠TGF-β多克隆抗體(1∶25)，經(jīng)DAB(二氨基聯(lián)苯胺)處理2~5 min后顯微鏡下觀(guān)察。10 min著色，蘇木精復(fù)染。每張切片在不含腎小球的腎小管間質(zhì)區(qū)域選取10個(gè)高倍鏡視野(×200)觀(guān)察，用免疫組織化學(xué)分析軟件系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0分析各視野的平均光密度值(average optical density,AOD)，即陽(yáng)性目標(biāo)光密度和陽(yáng)性面積百分比(IOD/Area)，其代表待測(cè)抗原量。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血清指標(biāo)的比較①SCr比較：HV組、LV組、UUO組均高于Sham組(P<0.05)，而LV組低于UUO組，HV組低于LV組。②鈣、磷、PTH的比較：HV組、LV組血鈣均高于UUO組(P<0.05)，HV組與LV組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HV組血磷高于其他3組(P<0.05)，其余3組間血磷差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HV組PTH低于其他3組(P<0.05)，而其余3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清指標(biāo)的比較　(±s)

注：與Sham組相比，*P<0.05 ；與UUO組相比，△P<0.05；與LV組相比，#P<0.05

2.2各組腎小管間質(zhì)損傷及纖維化比較光鏡下觀(guān)察，Sham組大鼠腎小管及腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯病變；UUO組全視野可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、管腔明顯擴(kuò)張、間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生，多數(shù)腎小管基底膜完全喪失；LV組絕大部分視野可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、管腔擴(kuò)張、間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)單核細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織中度增生，腎小管基底膜多呈不規(guī)則改變，部分視野腎間質(zhì)、腎小管損傷不明顯；HV組可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張，間質(zhì)內(nèi)有少量的纖維組織增生。各組腎臟均未見(jiàn)鈣化點(diǎn)、鈣化灶。各組大鼠腎臟病理見(jiàn)圖1。各組腎小管間質(zhì)纖維化及腎小管損傷程度半定量分析指數(shù)見(jiàn)表2。

圖1　各組大鼠腎間質(zhì)損傷及纖維化表現(xiàn)(×200)

(±s)

注：與Sham組相比，*P<0.05；與UUO組相比，△P<0.05；與LV組相比，#P<0.05

2.3各組大鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果在各組TGF-β的表達(dá)對(duì)比中，4組均可見(jiàn)代表TGF-β的棕黃色顆粒，以Sham組染色最淺，UUO組染色最深，HV組染色淺于LV組。在各組α-SMA的表達(dá)對(duì)比中，4組均可見(jiàn)代表α-SMA的棕黃色顆粒，以Sham組染色最淺，UUO組染色最深，HV組染色淺于LV組。在各組E-cadherin的表達(dá)對(duì)比中，4組均可見(jiàn)代表E-cadherin的棕黃色顆粒，以Sham組染色最深，UUO組染色最淺，HV組染色深于LV組。見(jiàn)圖2、表3。

圖2　各組大鼠腎臟TGF-β、α-SMA、E-cadherin的表達(dá)(×200)

(IOD/Area;±s)

注：與Sham組相比，*P<0.05； 與UUO組相比，△P<0.05

2.4各指標(biāo)的相關(guān)性分析

TGF-β表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化指數(shù)正相關(guān)(r=0.637,P=0.00)，α-SMA 表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化指數(shù)正相關(guān)(r=0.768,P=0.00)，E-cadherin表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化指數(shù)負(fù)相關(guān)(r=-0.702,P=0.00)；TGF-β表達(dá)與α-SMA表達(dá)正相關(guān)(r=0.613,P=0.00)，E-cadherin表達(dá)與TGF-β表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.542,P=0.00)；α-SMA表達(dá)與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)(r=-0.608,P=0.00)。

3討論

腎小管間質(zhì)纖維化是指在各種因素刺激下，正常的腎小管缺失和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如膠原、纖黏連蛋白等)異常堆積，最終導(dǎo)致腎功能喪失，造成慢性腎臟病的進(jìn)展。活性維生素D3是維生素D的一種衍生物，其生物學(xué)效應(yīng)由細(xì)胞內(nèi)多種維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)介導(dǎo)。VDR分為膜受體(membrane vitamin D receptor，mVDR)和核受體(nuclear vitamin D receptor，nVDR)兩大類(lèi)。mVDR主要參與維持鈣磷平衡[6]；nVDR則是一種配體依賴(lài)的核轉(zhuǎn)錄因子，與維生素D3結(jié)合后調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化及相應(yīng)的生物學(xué)功能[7-9]。TGF-β是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子，也是調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化最重要的細(xì)胞因子。TGF-β可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成、抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解、抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)TEMT等促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化。TGF-β可通過(guò)SMAD途徑誘導(dǎo)正常的腎小管上皮細(xì)胞逐步喪失E-cadherin，而提高肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)生TEMT，產(chǎn)生能分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)的肌成纖維細(xì)胞，這被認(rèn)為是TGF-β促進(jìn)腎小管纖維化最主要的機(jī)制之一。

UUO模型是當(dāng)前較為成熟的腎間質(zhì)纖維化模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組相比，UUO組SCr升高，腎臟病理可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、管腔明顯擴(kuò)張、間質(zhì)顯著增寬，間質(zhì)可見(jiàn)大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生，多數(shù)腎小管基底膜完全喪失；腎間質(zhì)損傷指數(shù)、纖維化指數(shù)升高；梗阻側(cè)腎臟腎小管間質(zhì)中TGF-β、α-SMA表達(dá)上調(diào)，而E-cadherin表達(dá)下調(diào)，提示本實(shí)驗(yàn)成功建立了UUO模型。此外，本實(shí)驗(yàn)UUO模型中存在明顯的TEMT，這與既往研究[10-11]一致。而與UUO模型組相比，應(yīng)用活性維生素D3干預(yù)的2組SCr降低，腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、纖維化指數(shù)降低，梗阻側(cè)腎臟TGF-β和α-SMA表達(dá)下調(diào)、E-cadherin表達(dá)上調(diào)，表明活性維生素D3能夠改善腎間質(zhì)纖維化、抑制腎小管上皮細(xì)胞TEMT，這與既往研究[12-13]一致。相關(guān)性分析提示，腎間質(zhì)纖維化指數(shù)與TGF-β、α-SMA表達(dá)正相關(guān)，但與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)；TGF-β與α-SMA表達(dá)正相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)；α-SMA與E-cadherin表達(dá)負(fù)相關(guān)。由此推測(cè)，活性維生素D3可能通過(guò)抑制TGF-β的表達(dá)延緩或阻止TGF-β介導(dǎo)的TEMT，進(jìn)而延緩腎小管間質(zhì)纖維化。本研究還顯示，HV組SCr水平、腎間質(zhì)纖維化指數(shù)低于LV組，且兩組均未見(jiàn)鈣化灶，提示大劑量維生素D3改善腎間質(zhì)纖維化的作用優(yōu)于小劑量維生素D3，即活性維生素D3改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用可能具有濃度依賴(lài)性?；钚跃S生素D3抑制TGF-β表達(dá)的具體機(jī)制仍不明確，目前認(rèn)為其可能通過(guò)與VDR結(jié)合調(diào)節(jié)TGF-β的表達(dá)[14-16]?；钚跃S生素D3改善腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制仍有待探索。

綜上所述，本研究在UUO大鼠模型中證實(shí)，活性維生素D3具有顯著抑制腎小管間質(zhì)纖維化的作用，且大劑量活性維生素D3改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用優(yōu)于小劑量活性維生素D3?；钚跃S生素D3改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制可能與其抑制腎臟TGF-β-SMAD信號(hào)通路進(jìn)而抑制TEMT有關(guān)。

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通訊作者鮑曉榮， E-mail： baoxiaorongdc@126.com