兩種伊維菌素注射液在家兔體內(nèi)的生物等效性研究

李朋朋，張聰，張曉會(huì)，周德剛，李召斌，張曉東，劉栓

(1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng) 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽(yáng) 471003)

兩種伊維菌素注射液在家兔體內(nèi)的生物等效性研究

李朋朋1，張聰1，張曉會(huì)1，周德剛1，李召斌1，張曉東1，劉栓2

(1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng) 471003；2.普萊柯生物工程股份有限公司，洛陽(yáng) 471003)

為評(píng)價(jià)兩種伊維菌素注射液在家兔體內(nèi)的生物等效性，采用雙周期交叉給藥方式，將16只健康家兔隨機(jī)分成2 組，按5 mg/kg體重皮下單劑量注射兩種伊維菌素注射液，使用HPLC法測(cè)定血漿中的伊維菌素，利用3P97藥動(dòng)軟件計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，受試制劑和參比制劑的Tmax分別為(26.45±8.62) h，(22.33±11.72) h；Cmax分別為(182.73±59.27) ng/mL，(166.77±65.25) ng/mL；AUC0-t分別為(21122±9999) ng·h·L-1，(19475±7009) ng·h·L-1；AUC0-∞分別為(27390±12197) ng·h·L-1，(31559±13412) ng·h·L-1。伊維菌素注射液受試制劑與參比制劑的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Tmax均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩種制劑生物等效，可為獸醫(yī)臨床給藥方案的制定以及合理用藥提供參考。

伊維菌素注射液；生物等效性；家兔

伊維菌素是阿維菌素藥物(AVM)的一種衍生物，是一種新型的廣譜、高效、低毒抗生素類抗寄生蟲藥[1]，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲特別是線蟲和節(jié)肢動(dòng)物均有良好驅(qū)殺作用[2]，獸醫(yī)臨床中廣泛用于馬、牛、羊、豬、犬、貓、兔等的寄生蟲病治療。20世紀(jì)80年代，伊維菌素注射液在法國(guó)上市，成為動(dòng)物抗寄生蟲藥的首選。梅里亞公司生產(chǎn)的伊維菌素注射液，具有安全、高效、長(zhǎng)效等特點(diǎn)，且已有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)牛、羊、豬等家畜的體內(nèi)線蟲和體外寄生蟲驅(qū)除效果佳[3]。根據(jù)伊維菌素注射液特點(diǎn)，河南新正好生物工程有限公司研制了一種伊維菌素注射液。本試驗(yàn)以家兔為研究對(duì)象，以梅里亞公司生產(chǎn)的伊維菌素注射液作為參比制劑，通過(guò)HPLC法測(cè)定家兔血漿中的伊維菌素，評(píng)價(jià)了受試制劑與參比制劑的生物等效性，為獸醫(yī)臨床合理使用伊維菌素注射液提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康家兔16 只，雌雄各半，體重(2.7±0.2)kg。試驗(yàn)前飼養(yǎng)1周，飼喂不含任何抗菌藥物的配合日糧，自由飲水和采食。1.1.2 藥品與試劑 伊維菌素對(duì)照品，批號(hào)：201405001，含量：92.7%，普萊柯生物工程股份有限公司；受試制劑：伊維菌素注射液(Ⅰ)，規(guī)格為100 mL：1 g，批號(hào)：20150312，由河南新正好生物工程有限公司提供；參比制劑：伊維菌素注射液(Ⅱ)，規(guī)格為100 mL：1 g，批號(hào)：AF210112，購(gòu)自梅里亞動(dòng)物保健有限公司。乙腈，批號(hào)：D1409018，西隴化工股份有限公司，色譜級(jí)；甲醇，批號(hào)：2014121101，成都市科龍化工試劑廠，色譜級(jí)；三乙胺，批號(hào)：20140217，天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析級(jí)。

1.1.3 儀器 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；電子分析天平，型號(hào)：AB-265s，梅特勒-托利多集團(tuán)公司；HLB固相萃取小柱，美國(guó)Waters公司，1cc/30 mg，批號(hào)：128A34266A。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取伊維菌素對(duì)照品150 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成6 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，2～8 ℃保存。系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋而成，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 血樣采集 16 只家兔隨機(jī)分成2 組，每組8 只，進(jìn)行編號(hào)，采用雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。一組先給予受試制劑，再給予參比制劑；另一組先給予參比制劑，再給予受試制劑，清洗期為50 d。通過(guò)皮下注射給藥，給藥劑量5 mg/kg體重。分別于給藥后2、4、6、8、12、20、24、48、96、144、168 h自耳緣動(dòng)脈采血，每次2.5～4 mL，置含10 mg(40 μL 25%枸櫞酸鈉溶液)枸櫞酸鈉的離心管中，混勻，3000 r/min離心10 min，分離血漿，-70 ℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確吸取血漿樣品1 mL，置5 mL離心管中，加乙腈2 mL，渦旋1 min，8000 r/min離心10 min，取上清液于10 mL離心管中，加入3 mL水、7.5 μL三乙胺，旋渦1 min，備用。

取HLB固相萃取小柱，用1 mL乙腈活化，1 mL乙腈-水-三乙胺溶液(40∶60∶0.1)平衡，將備用液過(guò)柱，之后用1 mL乙腈-水-三乙胺溶液淋洗，抽干后用2 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于5 mL離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，?0 μL甲醇溶解后檢測(cè)。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：kromasil 100-5C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水=35∶53∶12[4]；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：30 μL。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證1.3.1 檢測(cè)限和定量限 照“1.2.3”項(xiàng)處理血漿樣品進(jìn)樣檢測(cè)，當(dāng)儀器信噪比(S/N)=3時(shí)，對(duì)應(yīng)樣品中的含藥濃度即為檢測(cè)限；當(dāng)儀器信噪比(S/N)=10時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品中的含藥濃度即為定量限。

1.3.2 回收率及精密度 取空白血漿1 mL，加入伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作用，制備成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度(30、300、600 ng/mL)的血漿樣品，每一濃度6個(gè)樣品并測(cè)定，按“1.2.3”方法進(jìn)行處理后進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)定值與加入值之比計(jì)算回收率，并計(jì)算批內(nèi)精密度。連續(xù)3 d配制并測(cè)定伊維菌素濃度，考察批間精密度。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 分別吸取濃度為1、3、6、15、22.5、30、45、60 μg/mL的系列伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，置1 mL空白血漿中，渦旋混勻，使血漿樣品中伊維菌素濃度分別10、30、60、150、225、300、450、600 ng/mL。按“1.2.3”項(xiàng)下的血漿樣品處理方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度做5個(gè)重復(fù)。以最終藥物濃度(x，ng/mL)為自變量，相應(yīng)各濃度對(duì)應(yīng)的平均峰面積(y)為變量，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 取兩種制劑中各家兔的血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血漿中伊維菌素的濃度。采用藥代動(dòng)力學(xué)軟件3P97對(duì)血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)處理，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 方法檢測(cè)限及定量限 按照S/N=3為檢測(cè)限，S/N=10為定量限測(cè)定，該方法伊維菌素在家兔血漿中的檢測(cè)限為7 ng/mL，定量限為16 ng/mL。

2.2 提取回收率及精密度驗(yàn)證 血漿中伊維菌素空白添加濃度分別為30、300和600 ng/mL時(shí)，提取回收率在65.23%～85.88%之間，三個(gè)濃度精密性測(cè)定結(jié)果小于10%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 該方法在10～600 ng/mL范圍內(nèi)的線性方程為：y=1349.3x-4301.9，r=0.9999，血藥濃度與峰面積線性關(guān)系良好，可用于血漿藥物濃度測(cè)定。

2.4 血藥濃度數(shù)據(jù)與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 16只家兔以5 mg/kg體重皮下注射受試制劑和參比制劑，取受試家兔11個(gè)采樣點(diǎn)的血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下的血漿樣品處理方法處理后進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊維菌素血液濃度，采用3P97軟件處理血藥濃度并進(jìn)行計(jì)算，得到受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時(shí)間曲線(圖1)和各藥動(dòng)參數(shù)(表1)。

圖1 兩組伊維菌素注射液的藥時(shí)曲線

參數(shù)單位參數(shù)值(x±s)伊維菌素注射液(Ⅰ)伊維菌素注射液(Ⅱ)Keh-10.01±0.010.008±0.004Kah-10.12±0.070.227±0.172T1/2Kah8.42±6.415.80±5.91T1/2Keh82.95±43.87120.06±60.83Tmaxh26.45±8.6222.33±11.72Cmaxng/mL182.73±59.27166.77±65.25AUC0-tng·h/mL21122±999919475±7009AUC0-∞ng·h/mL27390±1219731559±13412

2.5 生物等效性評(píng)價(jià) 采用SPSS軟件對(duì)受試制劑和參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-t、AUC0-∞和Cmax進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差分析，然后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)及置信區(qū)間法計(jì)算，結(jié)果表明：受試制劑與參比制劑的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。受試制劑AUC0-t、AUC0-∞的90%置信區(qū)間分別為4.13～4.43、4.24～4.54，參比制劑AUC0-t、AUC0-∞的80%～125%的范圍分別為3.41～5.33，3.56～5.56，受試制劑AUC0-t、AUC0-∞的90%置信區(qū)間均在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi)。受試制劑Cmax的90%置信區(qū)間為2.15～2.34，落在參比制劑Cmax的70%～143%范圍內(nèi)(即1.53～3.13)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

3 討 論

健康家兔皮下注射受試制劑后，達(dá)峰時(shí)間為26.45 h，峰濃度為182.73 ng/mL，消除半衰期為82.95 h，皮下注射參比制劑后，達(dá)峰時(shí)間為22.33 h，峰濃度為166.77 ng/mL，消除半衰期為120.06 h，與參比制劑相比，受試制劑的達(dá)峰時(shí)間晚，峰濃度高，消除較快。由AUC0-∞數(shù)值得知，在相同劑量下，受試制劑在受試個(gè)體內(nèi)的暴露量較參比制劑較低，但AUC0-t結(jié)果表明，在0～168 h內(nèi)，受試制劑在受試個(gè)體內(nèi)的暴露量較參比制劑高，這可能與受試制劑達(dá)峰時(shí)間晚，消除較快有關(guān)。受試制劑與參比制劑的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax等藥動(dòng)參數(shù)均無(wú)顯著性差異，并結(jié)合生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果，可判定受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

試驗(yàn)中家兔單劑量皮下注射伊維菌素后，藥時(shí)數(shù)據(jù)采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]的一致。從數(shù)據(jù)可以看出，雖然兩制劑的各藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無(wú)顯著性差異，但也不全相同，這可能是因?yàn)橹苿┕に嚥煌鴮?dǎo)致，至于兩制劑的具體臨床效果仍需臨床試驗(yàn)，尚需做進(jìn)一步研究。

[1] Fink D W，Porras A G. Pharmacodynamics of ivermectin in animals and humans[M]// Ivermectin and Abamectin. New York: Springer, 1989.

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(編輯：李文平)

Bioequivalence of Two Different Ivermectin Injections in Rabbits

LI Peng-peng1，ZHANG Cong1，ZHANG Xiao-hui1，ZHOU De-gang1，LI Zhao-bin1，ZHANG Xiao-dong1，LIU Shuan2

(1.NationalResearchCenterforVeterinaryMedicine,Luoyang471003,China; 2.PulikeBiologicalEngineering,INC,Luoyang471003,China)

To evaluate the pharmacokinetics and bioequivalence of two kinds of ivermectin injections in rabbits, in a randomized two-way self-crossover study, 16 healthy rabbits were randomly divided into two groups, and were given respectively a single dose of two kinds of ivermectin injection by subcutaneous injection (5 mg/kg). Plasma concentrations of ivermectin were measured by HPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated by 3P97 pharmacokinetic software, and the bioequivalence were evaluated. The main pharmacokinetic parameters of the test and reference preparations were as follows:Tmaxwere (26.45±8.62) h，(22.33±11.72) h；Cmaxwere (182.73±59.27) ng/mL，(166.77±65.25) ng/mL；AUC0-twere (21122±9999) ng·h·L-1，(19475±7009) ng·h·L-1；AUC0-∞were (27390±12197) ng·h·L-1，(31559±13412) ng·h·L-1. The pharmacokinetic parameters (AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Tmax) showed no significant difference between test and reference preparations of ivermectin injections. The test and reference formulations were bioequivalent after two one-sidet-test. This study provided theoretical basis for making of veterinary clinical dosage regimen and clinical rational administration.

ivermectin injection; bioequivalence; rabbits

李朋朋，碩士，獸醫(yī)師，從事獸藥研究及開(kāi)發(fā)工作。E-mail：13526496019@163.com

2015-11-04

A

1002-1280 (2016) 01-0043-04

S859.79