李天芝，于新友，莫 玲，沈志強，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

日本腦炎病毒(JEV)又稱乙型腦炎病毒，屬于黃病毒科，黃病毒屬，所引起的疾病稱為日本腦炎(JE)或乙型腦炎，是一種人畜共患的自然疫源性傳染病[1]。該病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播[2]，豬是其主要傳染來源和擴散宿主，可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱仔，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬呈神經(jīng)癥狀等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3]。該病毒的基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb，由3個結(jié)構(gòu)基因(C、preM/M、E)和7個非結(jié)構(gòu)基因(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)構(gòu)成，其中E基因編碼囊膜糖蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒粒子表面最重要的成分，它與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等密切相關(guān)[4]。目前，JEV診斷方法主要有病毒分離鑒定[5]、免疫細胞化學(xué)法[6]、反向被動血凝試驗[7]、免疫熒光試驗(IFA)[8]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[9]、熒光定量RT-PCR方法[10]、RT-LAMP方法[11]、常規(guī)RTPCR方法[12]等，有的操作繁瑣，診斷時間長，結(jié)果重復(fù)性不好，有的難以檢測出微量病毒，不適宜疾病早期診斷，有的對儀器要求太高不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用，還有的太敏感容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。常規(guī)RT-PCR操作煩瑣，時間長，有時影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；一步法RT-PCR檢測方法具有特異、敏感、簡便等諸多優(yōu)點，能在數(shù)小時內(nèi)檢出病原。因此，建立一種快速、簡單、敏感的JEV一步法RT-PCR檢測方法十分必要。筆者根據(jù)GenBank公布JEV（GQ495005），針對具有很高保守性的E基因設(shè)計1對特異性引物，建立了一種特異、敏感的JEV一步法RT-PCR檢測方法，旨在為JE的早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供一種有效的分子生物學(xué)檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV 2）、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬瘟病毒（CSFV）由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2010年3月—2014年12月采自山東省各地豬場臨床診斷為JEV感染的豬的腦、肝臟、脾臟等。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3 RT-PCR引物設(shè)計與合成

應(yīng) 用PrimerPrem ier5.0基 因分析軟件，參照GenBank中登錄的JEVE基因序列（GQ495005）設(shè)計1對引物，擴增JEVE基因片段大小為513bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5'-GGTGCCAGAAGCAGACAG-3'，下游引物：5'-CTCCTTGGCTCACAGTCCAG-3'。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取JEV的RNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 JEVE基因的一步法RT-PCR擴增及條件優(yōu)化

以RNA為模板進行一步法RTPCR擴增，反應(yīng)體系為25μL。各參數(shù)為50℃逆轉(zhuǎn)錄30m in，95℃預(yù)變性2m in，然后進入95℃30S、54℃30S、72℃30S循環(huán)，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10m in。取5μL產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。同時對各擴增條件進行優(yōu)化，包括退火溫度(48～60℃梯度溫度，每2℃為1個梯度)、引物濃度(0.2～1.2μmol/L，每0.2μmol/L為1個梯度)等，反應(yīng)體系均為25μL。

1.6 PCR擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴增產(chǎn)物5μL在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH 5α。挑取單個的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)20h后，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA用PCR方法進行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進行測序鑒定。將測序結(jié)果與參照的JEV序列同源性比較。

1.7 特異性試驗

分別提取JEV、PRRSV、PCV 2、PPV、PRV、CSFV的核酸，用已建立的方法進行擴增。

1.8 敏感性試驗

JEV病毒提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有100ngRNA、10ngRNA、1ngRNA、100pgRNA、10pgRNA、1pgRNA的含量，分別進行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，對PRRSV、PCV 2、PPV、PRV、CSFV、健康豬腸道組織及JEV5份陽性病料和5份陰性病料，重復(fù)檢測3次，以驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測

取疑似送檢病料138份，利用建立的一步法RT-PCR方法進行檢測，對擴增產(chǎn)物全部進行測序鑒定，并利用生物學(xué)軟件BLAST進行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增產(chǎn)物的檢測及鑒定

2.1.1 擴增產(chǎn)物的檢測PCR擴增

產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物在513bp處可見特異性擴增條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.1.2 擴增產(chǎn)物的測序鑒定 挑取PCR鑒定正確的陽性菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果表明，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與JEV（登錄號：GQ495005）的序列相似性為100%。

2.2 特異性試驗

利用所設(shè)計的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對JEV、PRRSV、 PCV 2、PPV、PRV、CSFV的RNA進行一步法RT-PCR。結(jié)果6個毒株中只有JEVRNA能擴增出目的片段，大小為513bp(預(yù)期為513bp)，而其他毒株均未擴增出相應(yīng)的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性強。

2.3 敏感性試驗

圖1 JEV擴增結(jié)果

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

取5μ L PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約513bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達到10pgRNA（圖3）。

2.4 重復(fù)性試驗

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

2.5 臨床樣品的檢測

用建立的JEV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了138份在不同地方采集的豬病料，檢出陽性樣品56份。

3 討論

本試驗根據(jù)GenBank公布的JEV保守E基因序列（GQ495005），利用PrimerPrem ier5.0設(shè)計1對引物，通過一步法RT-PCR擴增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結(jié)果與模板序列進行比對，其同源性為100%，對退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度值為54℃時，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結(jié)果。優(yōu)化引物濃度，在引物濃度為0.2～1.2μmol/ L對PCR擴增效率的影響不大，在0.6μmol/L時擴增效率相對較高，而在1.2μmol/L時擴增效率相對較差。敏感性試驗結(jié)果顯示，引物的檢測靈敏度可以達到10pgRNA。特異性試驗結(jié)果顯示，本試驗所建立的雙重RT-PCR檢測JEV的方法能夠擴增出513bp目的片段，而對常見的豬病病毒如PRRSV、PCV2、PPV、PRV、CSFV均無擴增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的JEV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了138份在不同地方采集的豬病料，檢出陽性樣品56份。

本試驗建立的JEV一步法RTPCR檢測方法與傳統(tǒng)的JEV二步法RT-PCR檢測方法相比具有操作簡單，不需要單獨做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增一步完成，節(jié)約了檢測時間。鑒于經(jīng)費、時間等多方面的原因，筆者僅做了40份JEV病料的一步法RT-PCR檢測方法與傳統(tǒng)的JEV二步法RT-PCR的檢測比對試驗，結(jié)果二者的符合率為100%，但能節(jié)省檢測時間，更快地指導(dǎo)臨床用藥。JEV一步法RTPCR檢測方法有多種優(yōu)點如敏感性高、特異性強、快速簡便、檢測成本低，市場應(yīng)用前景較好。該方法方便、實用，更適合基層獸醫(yī)工作者使用。因此本試驗所建立的方法為國內(nèi)JE的流行病學(xué)調(diào)查等提供一種實用、有效的分子生物學(xué)診斷方法。

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