何恒果，王進軍

(1.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009) (2.西南大學植物保護學院,昆蟲學及害蟲控制工程重慶市重點實驗室,重慶 400716)

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桔全爪螨乙酰膽堿酯酶(AChE)生化特性研究

何恒果1，王進軍2

(1.西華師范大學生命科學學院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川 南充 637009) (2.西南大學植物保護學院,昆蟲學及害蟲控制工程重慶市重點實驗室,重慶 400716)

為明確桔全爪螨乙酰膽堿酯酶AChE與其抗藥性的關系，應用微量滴度酶標板法對桔全爪螨敏感品系(SS)、甲氰菊酯抗性品系(FeR)和阿維菌素抗性品系(AvR)的乙酰膽堿酯酶(AChE)的生化特性進行了比較研究.結果表明：3個品系中，以甲氰菊酯抗性品系FeR的AChE活力、比活力以及最大反應速率Vmax值最大；兩抗性品系的AChE活力、比活力和Vmax值均顯著高于敏感品系(P<0.05)，且兩抗性品系之間也存在顯著差異(P<0.05)；米氏常數(shù)Km值在3個品系間無顯著差異(P>0.05).這說明AChE活力提高是桔全爪螨對甲氰菊酯和阿維菌素產(chǎn)生抗性的原因之一.

桔全爪螨；乙酰膽堿酯酶(AChE)；甲氰菊酯；阿維菌素；抗性

桔全爪螨Panonychuscitri(McGregor)，又稱柑橘紅蜘蛛,屬蜘蛛綱蜱螨目葉螨科,是一種世界性的柑橘害螨，除危害柑橘外，還危害梨、蘋果、花椒、苦楝、桂花等多種經(jīng)濟作物和觀賞植物[1].由于螨體小、世代多、繁殖速度快、發(fā)育歷期短等特點，極易對藥劑產(chǎn)生抗性.當前，化學防治仍是控制其為害的重要手段之一.但由于不合理用藥，桔全爪螨已對許多殺螨劑產(chǎn)生了抗藥性[2-6].

乙酰膽堿酯酶，AChE(Acetylcholinesterase,AChE;EC 3.1.1.7)是生物神經(jīng)傳導中一種關鍵性酶，能夠迅速水解興奮性神經(jīng)遞質—乙酰膽堿(ATC)而使神經(jīng)突觸傳導正常進行.AChE的主要作用是催化昆蟲(螨)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿突觸中的神經(jīng)傳導物乙酰膽堿的水解，為有機磷類和氨基甲酸酯類農藥的主要作用靶標[7,8].在正常情況下，昆蟲(螨)神經(jīng)沖動傳導到神經(jīng)末梢后，立即釋放乙酰膽堿，從而引起后突觸膜電位的改變，因而效應器官后突觸產(chǎn)生興奮，釋放在突觸間隙的乙酰膽堿會立即被神經(jīng)細胞表面的AChE所分解，這樣，神經(jīng)傳導會繼續(xù)進行；如果AChE的活性被有機磷殺蟲(螨)劑所抑制，釋放在突觸間隙的乙酰膽堿則不能被分解，這時昆蟲(螨)就會出現(xiàn)中毒癥狀甚至死亡[7,8].所以，AChE對這些殺蟲(螨)劑的敏感性高低與昆蟲(螨)對有機磷等殺蟲(螨)劑的抗性有著密切的關系.在抗性昆蟲(螨)中，AChE活性降低或上升，降低是由于發(fā)生了基因突變所致[8]，而升高是其本身未發(fā)生改變而只是活性增強[8].

為了明確桔全爪螨抗性的產(chǎn)生與體內AChE的關系，本實驗通過微量滴度酶標板法，對桔全爪螨不同品系體內AChE活性及動力學常數(shù)進行了比較研究.研究結果為進一步豐富葉螨AChE的研究內容，并為桔全爪螨的綜合防治及其抗性治理提供一定的理論指導.

1 材料與方法

1.1 供試螨

供試桔全爪螨采自重慶中國農科院柑桔研究所種質資源圃的枳殼苗上(該苗圃至少10年未用藥)，帶回室內后移接到盆栽枳殼苗上，在溫度為26±1℃，RH為70-75%左右的人工氣候室內飼養(yǎng).種群數(shù)量足夠后將這一種群分為3個亞種群，其中一個亞種群不用藥,視作敏感品系(SS)；另兩個亞種群分別用92%甲氰菊酯和93%阿維菌素原藥定期用藥處理.其中甲氰菊酯抗性品系(FeR)經(jīng)19代中不連續(xù)汰選16次獲得，阿維菌素抗性品系(AvR)19代中不連續(xù)汰選11次獲得.

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、考馬斯亮藍G-250(上海化學試劑公司)、牛血清白蛋白(上海伯奧生物科技有限公司)、碘化硫代乙酰膽堿(ATChI，美國Fluka公司)、5,5-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB，美國Fluka公司)、99%毒扁豆堿(美國Sigma公司)、92%甲氰菊酯Fenpropathrin、93%阿維菌素Avermectin原藥(成都生物藥檢所).

主要儀器：酶標儀(奧地利TECAN公司)、Mikro22R型高速冰凍離心機(Whatman Biometra公司)、FA1004A型電子天平(上海精天電子儀器廠)、PHS-4C型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 生物測定

桔全爪螨生物測定采用FAO推薦的玻片浸漬法[9].為減少因試驗個體受藥不均勻帶來的誤差，生測時所選個體均為3-5日齡的健康雌成螨，并且在浸藥5s后立即用小塊濾紙或吸水紙的邊緣迅速吸干附在螨體和粘膠表面的藥液.每一濃度設3個重復，另以丙酮水溶液(丙酮<1%)為對照，對照組死亡率在10%以內為有效試驗，所得數(shù)據(jù)在SPSS 12.0 for Windows軟件上進行處理，求出毒力回歸直線方程和致死中濃度LC50值.

1.3.2 酶源制備

挑取100頭雌成螨，用1.2mL 0.1M pH7.0冷凍磷酸緩沖液勻漿，于4℃、10 000g下離心15min，上清液作為酶源.重復3次以上.

1.3.3 蛋白質含量測定

酶源蛋白含量的測定參照Bradford[10]的方法.

1.3.4 乙酰膽堿酯酶(AChE)活性測定

參照Ran[5]、Ren[11]等的方法.用碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)作底物，經(jīng)AChE水解后生成硫代膽堿和乙酸，與顯色劑DTNB生成黃色物質，以毒扁豆堿終止反應，在412nm處測其OD值.連續(xù)掃描20min，每1min讀一次數(shù)，重復3次以上.AChE活性計算參照Ellman[12]方法.

1.3.5 乙酰膽堿酯酶(AChE)動力學常數(shù)測定

將1.5mmol/L ATChI分別稀釋為0.15、0.3、0.375、0.495、0.6、0.75和1.5mmol/L的濃度，測定方法同活性測定.計算方法參照Wilkinson[13].

2 結果與分析

2.1 生物測定結果

生測結果表明，桔全爪螨對甲氰菊酯的抗性發(fā)展迅速，經(jīng)19代共16次用藥篩選，桔全爪螨雌成螨對甲氰菊酯的敏感度(LC50值)由選育前的4.1871mg·L-1提高為選育后的125.2653mg·L-1，抗性增長了29.92倍(表1).而桔全爪螨對生物源農藥阿維菌素的抗性發(fā)展較為緩慢，經(jīng)19代共11次噴藥的篩選，桔全爪螨雌成螨對阿維菌素的敏感度由選育前的0.0221mg·L-1(LC50值)提高為選育后的0.0839mg·L-1，抗性增長3.80倍(表1).

表1 甲氰菊酯和阿維菌素對桔全爪螨不同品系的毒力

2.2 桔全爪螨不同品系AChE活性比較

桔全爪螨不同品系體內AChE的酶源蛋白含量、活力及比活力測定結果見表2.從表中可以看出，桔全爪螨不同品系體內酶源蛋白含量雖有一定差異，但差異不顯著.兩個抗性品系的AChE活力和比活力都有提高.其中，兩抗性品系FeR和AvR的AChE比活力分別是敏感品系的1.61和1.40倍.說明其AChE活力提高可能是桔全爪螨對甲氰菊酯和阿維菌素產(chǎn)生抗性的原因之一.

表2 桔全爪螨不同品系乙酰膽堿酯酶活性的比較

注：表中同一列數(shù)據(jù)后面的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 桔全爪螨不同品系AChE動力學常數(shù)比較

以ATChI為底物，桔全爪螨兩抗性品系AChE的Km值與敏感品系相比無顯著差異(見表3)，說明AChE對底物的親和力沒有發(fā)生改變.但Vmax與敏感品系的相比都有所增加，且分別為敏感品系的1.59倍和1.25倍，差異達顯著水平(P<0.05)(見表3)，說明這兩個抗性品系體內AChE對底物的催化能力顯著增強.

表3 桔全爪螨不同品系AChE動力學常數(shù)的比較

注：表中同一列數(shù)據(jù)后面的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 結果與討論

1964年，Smissaert研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨(T.urticae)抗有機磷品系膽堿酯酶(Cholinesterase)活性僅為敏感品系的1/3，首次證明了在葉螨抗藥性中存在靶標部位敏感性降低的抗性機理[14].以后在昆蟲和蜱螨中則陸續(xù)有了這方面的相關研究[15-20].已經(jīng)證實，AChE是多種藥劑如有機磷和氨基甲酸酯類的主要靶標酶.在正常的昆蟲(蜱螨)中，殺蟲(螨)劑使AChE活性降低，神經(jīng)突觸間的傳遞物質乙酰膽堿的正常釋放或接收遭到破壞，打斷神經(jīng)傳導，使昆蟲(蜱螨)死亡.但在抗性昆蟲(螨)中，由于藥劑的長期選擇作用，突觸間的物質傳遞活動已對藥劑的干擾或破壞作用有了很強的適應性，發(fā)生了某些改變，甚至完全可以不受藥劑的干擾而進行正常的神經(jīng)傳導活動，表現(xiàn)為抗藥性[8].害蟲(螨)對這類殺蟲(螨)劑產(chǎn)生抗藥性是由于AChE對藥劑的不敏感性造成的，而這種不敏感多表現(xiàn)為昆蟲(蜱螨)體內AChE活性的降低，這在許多蜱螨類和昆蟲中得到證實，如微小牛蜱(B.microplus)[21]，家蠅(M.domestica)[22]，庫蚊(Cx.pipiens)[23]等.另一方面，在某些昆蟲(蜱螨)的抗性品系中也有AChE活性增高的現(xiàn)象.如嗜卷書虱(L.bostrychophila)敵敵畏抗性品系和磷化氫抗性品系AChE的比活力高于其敏感品系[11].淡色庫蚊(Cx.pipiens)DDVP抗性品系和殘殺威抗性品系的AChE比活力高于其敏感品系[23].桃蚜(M.persicae)高效氯氰菊酯抗性品系的AChE比活力高于其敏感品系[15].

有關桔全爪螨AChE的研究還很少.研究發(fā)現(xiàn)桔全爪螨體內乙酰膽堿酯酶活性的提高是其對噠螨靈產(chǎn)生抗性的原因之一，也是對齊墩螨素產(chǎn)生抗性的主要原因[19]；桔全爪螨對辛硫磷的抗性也與AChE活性增加有關[20]，不同地區(qū)桔全爪螨田間種群體內AChE活性的不同與其對藥劑的敏感性差異有一定的相關關系[4].本研究結果表明，桔全爪螨甲氰菊酯和阿維菌素抗性品系AChE活性有一定升高，這與前人研究結果一致[19].何林[17]在研究朱砂葉螨(T.cinnabarinus)抗性機理時卻發(fā)現(xiàn)，朱砂葉螨甲氰菊酯抗性品系和阿維菌素抗性品系的AChE活力均降低，這與本試驗結果不同.這說明，蜱螨對殺蟲殺螨劑的抗性機理極其復雜，不同種類的葉螨抗性機理可能存在很大的差異.

本實驗結果表明，桔全爪螨不同品系之間的AChE活性具有一定的差異，抗性品系AChE活性高于敏感品系，這說明桔全爪螨AChE活性增強可能與其抗藥性產(chǎn)生有關.要進一步確定其相關性，還應該加強其分子毒理學方面的研究.

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Biochemical Characteristics of Acetylcholinesterase (AChE) in the Citrus Red Mite,Panonychus citri McGregor (Acari:Tetranychidae)

HE Heng-guo1,WANG Jin-jun2

(1.College of Life Science,China West Normal University,Sichuan 637009;2.Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering,College of Plant Protection,Southwest University,Chongqing 400716)

In order to clarify the relationship between AChE and resistance ofPanonychuscitri,the biochemical characteristics of AChE from three strains (Susceptible strain,SS;Fenpropathrin resistance strain,FeR;Avermectin resistance strain,AvR) ofP.citriwere studied by microplate reader method.The results showed that,among three strains,the activity per mite and specific activity of AChE,as well as theVmaxvalue were highest in FeR.Compared to SS strain,these values in FeR and AvR were significantly higher (P<0.05),and significant difference was observed between two resistant strains (P<0.05).However,there was no significant difference ofKmvalue among three strains (P>0.05).The above results indicated that increased activity of AChE can play important roles in fenpropathrin and avermectin resistance inP.citri.

Panonychuscitri;AChE;fenpropathrin;avermectin;resistance

1673-5072(2015)01-0012-05

2014-11-04

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201103020)；四川省教育廳項目(11ZA293)；西華師范大學博士啟動基金(10B029)

何恒果(1978-)，女，四川宜賓人，西華師范大學生命科學學院副教授，博士，主要從事農林害蟲綜合治理.

S666

A