重金屬脅迫背景下的任豆幼苗抗性生理試驗

覃勇榮，盤芳麗，吳達(dá)偉，牟光福，劉旭輝

(河池學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300)

在礦產(chǎn)資源開發(fā)過程中，由于管理不善以及環(huán)保工作滯后等原因，資源浪費和環(huán)境破壞的問題十分嚴(yán)峻［1］，重金屬污染是金屬礦區(qū)普遍存在的現(xiàn)象之一［2－3］。

土壤重金屬污染治理越來越受到政府和學(xué)術(shù)界的關(guān)注。目前，土壤重金屬污染修復(fù)方法主要有:工程物理方法、化學(xué)方法、農(nóng)業(yè)方法和生物方法等。工程物理方法是比較經(jīng)典的土壤重金屬污染治理方法，它具有相對徹底、穩(wěn)定的優(yōu)點，但工程量大，成本高，破壞土壤結(jié)構(gòu)，容易引起生物活性下降和土壤肥力退化;化學(xué)方法的優(yōu)點是治理效果相對明顯且簡單易行，但化學(xué)修復(fù)是在土壤原位上進(jìn)行的，它只改變了重金屬在土壤中存在的形態(tài)，金屬元素仍保留在土壤中，容易再度活化造成危害，故不可作為一項永久的修復(fù)措施;農(nóng)業(yè)方法具有操作簡單、投資費用低的優(yōu)點，但治理周期長，效果不顯著;生物方法主要是利用生物削減、凈化土壤中的重金屬或降低重金屬毒性，此法簡便易行、投資費用少、對環(huán)境破壞小，且效果相對顯著，因此成為土壤重金屬污染修復(fù)研究的熱點。在生物方法中，植物修復(fù)屬于原位修復(fù)技術(shù)，具有保護(hù)表土，不破壞土壤結(jié)構(gòu)，減少土壤侵蝕和水土流失的功效，不僅對環(huán)境影響小，產(chǎn)生的廢物少，又可回收重金屬，因此被認(rèn)為是一項成本低廉、環(huán)境友好的污染處理技術(shù)［4］。

任豆(Zenia insignis)是我國特有的樹種，生長速度快，適應(yīng)性廣，根穿透力、萌芽力、耐旱性及抗病蟲能力都比較強，是石山造林綠化的優(yōu)良樹種，具有良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟價值。研究發(fā)現(xiàn)，任豆幼苗具有較強的重金屬耐性，可作為土壤重金屬污染的修復(fù)材料［5－6］。廣西礦產(chǎn)資源豐富，但重金屬污染問題比較嚴(yán)重，選擇優(yōu)良的植物品種(尤其是鄉(xiāng)土樹種)進(jìn)行重金屬污染治理是比較現(xiàn)實的利民之舉。為此，筆者用人工模擬(盆栽試驗)方法，分析重金屬脅迫下的任豆幼苗抗性生理特征，以便為廣西及相鄰地區(qū)土壤重金屬污染的植物修復(fù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

101－2－BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、AL204電子天平(梅特勒－托利多儀器上海有限公司)、艾柯DZG－303A純水儀(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)、UV－765紫外可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、80－2臺式電動離心機(常州國華電器有限公司)、KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)、FZ102微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.1.2 主要試劑

三氯乙酸，2－硫代巴比妥酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，硝酸鋁(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，氫氧化鈉、亞硝酸鈉(汕頭市西隴化工股份有限公司)。以上試劑均為分析純(AR)，實驗用水均為去離子水。

1.2 實驗材料及處理

1.2.1 發(fā)芽及育苗

選取大小均勻、顆粒飽滿、外觀完好的任豆種子(種子由廣西田東縣種植戶提供)，用60～75℃的溫水浸泡1 h，催芽后，轉(zhuǎn)移至無重金屬污染旳沙床進(jìn)行培育。定期用去離子水噴灑，保持沙床濕潤，以提高任豆種子的發(fā)芽率和幼苗成活率。在幼苗株高達(dá)15 cm后，再用于重金屬脅迫的模擬實驗。

1.2.2 試驗設(shè)計

(1)水培適應(yīng)性試驗。

從苗床中選取生長狀況良好、大小規(guī)格一致的任豆幼苗，用泡沫塑料板將任豆苗固定好，將任豆幼苗培養(yǎng)于裝有4 L Hoagland氏培養(yǎng)液［7］的培養(yǎng)盆中。水培適應(yīng)期為兩周，期間定期用充氧機給培養(yǎng)液充氧，以提供任豆幼苗根部呼吸所需的氧氣。

(2)重金屬脅迫試驗。

將經(jīng)過水培適應(yīng)性試驗的任豆幼苗分別轉(zhuǎn)入添加重金屬元素Cu2+、Cd2+、Pd2+和Zn2+的Hoagland氏培養(yǎng)液中培養(yǎng)。其中 Cu2+和 Cd2+的濃度分別為 0、5、10、15、20、25、30 mg/L，Pd2+和 Zn2+的濃度分別為 0、25、50、75、100、125、150 mg/L，每盆培養(yǎng)液總體積均為4 L。定期向培養(yǎng)液充氧，重金屬脅迫的幼苗培養(yǎng)時間為30 d。

1.2.3 樣品處理

用去離子水將采收后的任豆幼苗清洗3次，將任豆幼苗的根、莖、葉分開，編號。將每盆任豆幼苗的葉片混合均勻，稱取1 g以上的新鮮葉片，用于測定任豆幼苗葉片中的葉綠素含量和丙二醛含量。將根、莖及余下葉片置于60℃烘箱中烘干后，分別用微型植物粉碎機粉碎，置干燥陰涼處保存，備用。干燥的任豆幼苗葉片樣品用于總黃酮含量的測定。

1.3 抗性生理指標(biāo)測定

葉綠素含量的測定用比色法，丙二醛含量的測定用硫代巴比妥酸法［8］，總黃酮含量的測定用超聲波輔助―乙醇浸提，三氯化鋁比色法［9－10］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)的處理及相關(guān)分析使用Excel 2010、SPSS 20.0和Origin8.0等軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對任豆幼苗生理性狀的影響

從圖1可見，在低濃度的重金屬Cu2+的脅迫下，任豆幼苗葉綠素含量逐漸增加，當(dāng)Cu2+濃度為20 mg/L達(dá)到最大值，然后逐漸下降，當(dāng)Cu2+濃度為25 mg/L時，葉綠素含量基本上趨于穩(wěn)定。所有添加重金屬Cu2+處理的任豆幼苗，其葉綠素含量均比空白對照的高。丙二醛含量的變化則比較復(fù)雜，當(dāng)培養(yǎng)液中的Cu2+濃度低于10 mg/L時，任豆幼苗葉片的丙二醛含量逐漸降低(在Cu2+濃度為10 mg/L時達(dá)到最小值)，之后，丙二醛含量逐漸增加，在Cu2+濃度為20 mg/L時，丙二醛含量達(dá)到最大值，然后逐漸下降?？傸S酮含量的變化則比較簡單，當(dāng)Cu2+濃度小于25 mg/L時，任豆幼苗葉片總黃酮含量一直呈下降趨勢(在Cu2+濃度為25 mg/L時達(dá)到最小值)，之后，總黃酮含量又逐漸增加。

圖1 Cu2+脅迫下的任豆幼苗生理指標(biāo)變化

2.2 鎘脅迫對任豆幼苗生理性狀的影響

從圖2可以看出，當(dāng)Cd2+＜10 mg/L時，任豆幼苗葉片的葉綠素含量逐漸增加;當(dāng)10 mg/L＜Cd2+＜20 mg/L時，任豆幼苗葉片的葉綠素含量則逐漸降低;當(dāng)Cd2+＞20 mg/L時，任豆幼苗葉片的葉綠素含量又逐漸增加。在不同濃度的Cd2+脅迫下，任豆幼苗葉片的丙二醛含量均比對照低，尤其是Cd2+為10 mg/L時，任豆幼苗葉片的丙二醛含量最低?？傸S酮含量則呈先下降后升高的趨勢，當(dāng)Cd2+為10 mg/L時，總黃酮含量達(dá)到最低值。

圖2 Cd2+脅迫下的任豆幼苗生理指標(biāo)變化

2.3 鉛脅迫對任豆幼苗生理性狀的影響

由圖3可知，在不同濃度重金屬Pb2+的脅迫下，任豆幼苗葉片的葉綠素含量呈現(xiàn)先升后降再升再降的變化，當(dāng)Pb2+濃度為150 mg/L時，任豆幼苗葉片的葉綠素含量最低;丙二醛含量的變化起伏較大，值得注意的是，當(dāng)Pb2+濃度為25、75、150 mg/L時，任豆幼苗葉片丙二醛含量均比對照的低;隨著Pb2+濃度的增加，總黃酮含量也出現(xiàn)波動，但總的趨勢是上升，當(dāng)Pb2+濃度為150 mg/L時，任豆幼苗葉片的總黃酮含量也達(dá)到最大值，所有添加重金屬Pb2+脅迫的任豆幼苗，其總黃酮含量均比對照的高。

圖3 Pb2+脅迫下的任豆幼苗生理指標(biāo)變化

2.4 鋅脅迫對任豆幼苗生理性狀的影響

由圖4可以看出，在不同濃度重金屬Zn2+的脅迫下，任豆幼苗葉片的葉綠素含量呈下降趨勢，總的來看，Zn2+濃度越大，任豆幼苗葉片中的葉綠素含量越低;與之相反，丙二醛含量呈逐漸上升趨勢，隨著Zn2+濃度的增加，丙二醛含量逐漸增加;隨著Zn2+濃度的增加，總黃酮含量則先升后降，添加不同濃度Zn2+脅迫的任豆幼苗，其總黃酮含量均比對照的高。在濃度為125 mg/L和150 mg/L重金屬Zn2+脅迫下，實驗盆栽的任豆幼苗幾乎全部死亡，因此無法獲得足夠的實驗材料測定相關(guān)的實驗數(shù)據(jù)。

圖4 Zn2+脅迫下的任豆幼苗生理指標(biāo)變化

2.5 不同重金屬脅迫對任豆幼苗生理的影響

為了更加直觀地說明不同重金屬脅迫對任豆幼苗生理的影響，將不同重金屬脅迫下任豆幼苗同一生理性狀的變化繪制于同一曲線圖，如圖5、圖6和圖7。由此可見，不同重金屬元素對任豆幼苗生理的影響不同，從葉綠素含量這一生理指標(biāo)看，任豆幼苗對Pb2+的耐性比較強，對Zn2+的耐性次之，對Cu2+和Cd2+的耐性較差(見圖5)。從丙二醛含量的變化來看，任豆幼苗對Pb2+的耐性明顯比對Zn2+的耐性強，對Cd2+的耐性比對Cu2+的耐性稍強，但任豆幼苗耐受Cu2+和Cd2+的濃度明顯比Pb2+和Zn2+的濃度低，與Pb2+相比，Zn2+脅迫下的任豆幼苗，其丙二醛含量急劇增加，說明其細(xì)胞傷害程度比較嚴(yán)重，實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Zn2+濃度超過100 mg/L時，任豆幼苗幾乎全部死亡，而Pb2+濃度在150 mg/L時，部分任豆幼苗還能存活(見圖6)。從總黃酮含量的變化來看，任豆幼苗對Cu2+、Cd2+、Zn2+脅迫的反應(yīng)比較敏感，對Pb2+脅迫的反應(yīng)比較遲鈍;在能夠耐受的范圍內(nèi)，隨著重金屬離子濃度的增高，任豆幼苗總黃酮含量也呈上升的趨勢。因此，在重金屬脅迫下，植物體內(nèi)總黃酮的作用值得關(guān)注(見圖7)。

圖5 不同重金屬脅迫對任豆幼苗葉綠素含量的影響

圖6 不同重金屬脅迫對任豆幼苗丙二醛含量的影響

圖7 不同重金屬脅迫對任豆幼苗總黃酮含量的影響

2.6 相關(guān)性分析

為了說明任豆幼苗不同生理指標(biāo)對重金屬脅迫的響應(yīng)，對任豆幼苗葉綠素含量、丙二醛含量及總黃酮含量與不同濃度重金屬脅迫的相關(guān)性進(jìn)行分析。從表1可以看出，任豆幼苗總黃酮含量與Cu2+濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)，葉綠素含量和丙二醛含量與Cu2+濃度有一定的正相關(guān)，但不顯著;任豆幼苗的葉綠素含量與Zn2+濃度呈顯著的負(fù)相關(guān)，丙二醛含量與Zn2+濃度呈極顯著的負(fù)相關(guān)，總黃酮含量與Zn2+濃度呈顯著的正相關(guān);葉綠素含量、丙二醛含量及總黃酮含量與Cd2+、Pb2+濃度有一定的相關(guān)性，但并不顯著。

表1 不同濃度重金屬脅迫與任豆幼苗生理指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

葉綠素含量是植物營養(yǎng)狀況、光合作用能力及發(fā)育階段的生理指標(biāo)，也是評價植物健康狀態(tài)及受環(huán)境脅迫程度的重要指標(biāo)［11］。由圖1至圖4可看出，在0～30 mg/L的濃度范圍內(nèi)，添加Cu2+、Cd2+處理的任豆幼苗，其葉綠素含量均比對照的高;添加低濃度(＜50 mg/L)Pb2+處理的任豆幼苗，其葉綠素含量也比對照稍高;而所有添加Zn2+處理的任豆幼苗，其葉綠素含量均比對照的低。說明任豆幼苗對重金屬Zn2+的反應(yīng)比較敏感，而低濃度的部分重金屬元素(Cu2+、Cd2+和Pb2+)對任豆幼苗生長有一定的促進(jìn)作用，這與覃勇榮等人對桑樹幼苗的相關(guān)研究結(jié)果相似［12］。

丙二醛含量可以反映植物細(xì)胞膜受損害的程度，也可以作為植物抗逆生理的重要指標(biāo)［13－17］。重金屬鎘脅迫下的任豆幼苗，其葉片中的丙二醛含量反而比對照組的低(見圖2)，說明在一定濃度范圍內(nèi)，任豆幼苗對重金屬鎘有較好的耐性，重金屬鎘對任豆的傷害不一定是破壞其細(xì)胞膜。由此可見，重金屬對植物的傷害途徑、方式和機理可能是多種多樣的，破壞植物細(xì)胞膜僅是其中一種方式和途徑而已。如果以丙二醛含量高低作為判斷植物對重金屬的耐性強弱，任豆幼苗對重金屬Cu2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+的耐性排序為:Cd2+＞Cu2+＞Pb2+＞Zn2+。

黃酮類化合物具有抗氧化、延緩衰老、清除自由基等作用［18］。由表1可知，在Zn2+的脅迫下，Zn2+濃度與任豆幼苗的葉綠素、丙二醛含量均有顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)，與總黃酮含量有顯著的正相關(guān)，說明任豆幼苗對Zn2+的脅迫比較敏感;在另一組試驗中，在Cu2+的脅迫下，任豆幼苗的總黃酮含量卻與Cu2+濃度呈極顯著的負(fù)相關(guān)。因此，黃酮類化合物在植物生理調(diào)控及解除重金屬毒害的作用，尚需進(jìn)一步的研究。

根據(jù)任豆幼苗水培試驗可知，Cu2+和Cd2+脅迫下的任豆幼苗，除對照組和5 mg/L的Cu2+處理組外，其余處理組均出現(xiàn)部分葉子枯黃掉落現(xiàn)象，部分處理組出現(xiàn)枝條枯萎現(xiàn)象，高濃度處理組的情況更為嚴(yán)重。而加入重金屬Pb2+和Zn2+2 d后，濃度為150 mg/L處理組的任豆幼苗均有枯萎的現(xiàn)象，15 d后，濃度為100 mg/L的Zn2+脅迫下的任豆幼苗部分葉子發(fā)黃嚴(yán)重，有枯萎跡象，濃度為125 mg/L和150 mg/L Zn2+脅迫下的任豆幼苗幾乎全部死亡。收苗前，對照組的任豆幼苗長勢良好，添加Cu2+和Cd2+處理的任豆幼苗葉片均有部分枯萎現(xiàn)象，且老葉表現(xiàn)較為明顯，Cu2+處理的任豆幼苗葉片枯萎情況比Cd2+處理的嚴(yán)重;而添加Pb2+處理的任豆幼苗在收苗時長勢依然良好，葉片茂盛濃密，Zn2+處理的任豆幼苗新葉發(fā)白，并有葉片發(fā)黃脫落現(xiàn)象。

4 結(jié)論

根據(jù)實驗研究結(jié)果及以上分析討論，可以初步得到以下結(jié)論:

(1)任豆幼苗葉綠素、丙二醛含量等生理指標(biāo)對不同重金屬脅迫的響應(yīng)不同，對Zn2+脅迫比較敏感，對Pb2+、Cu2+和Cd2+脅迫的響應(yīng)情況比較復(fù)雜。

(2)植物減輕和解除重金屬毒害有多種方式和復(fù)雜的機制，評價任豆幼苗對重金屬Cu2+、Cd2+、Pd2+、Zn2+耐性的強弱，不能從單一的生理指標(biāo)輕易下結(jié)論，而應(yīng)根據(jù)相關(guān)生理指標(biāo)的測定數(shù)據(jù)及植物長勢等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷。

(3)任豆幼苗對不同重金屬脅迫的耐性有差異，綜合考慮各種形態(tài)和生理指標(biāo)，任豆幼苗對Cu2+、Cd2+、Pd2+、Zn2+耐性強弱排序為:Pd2+＞Zn2+＞Cd2+＞Cu2+。

［1］王亞平，鮑征宇，王蘇明.礦山固體廢物的環(huán)境效應(yīng)研究進(jìn)展及大冶銅綠山尾礦的環(huán)境效應(yīng)［J］.礦物巖石地球化學(xué)通報，1998，17(2):97－100.

［2］李永庚，蔣高明.礦山廢棄地生態(tài)重建研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報，2004，21(1):95－99.

［3］Dudkas S，Adriano D C.Environmental impacts of metal ore mining and processing:A review［J］.Journal of Environmental Quality，1997(26):590－602.

［4］萬云兵，仇榮亮，陳志良，等.重金屬污染土壤中提高植物提取修復(fù)功效的探討［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2002，3(4):56－59.

［5］覃勇榮，覃艷花，嚴(yán)軍，等.EDTA對桑樹和任豆幼苗吸收重金屬Pb的影響［J］.南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，42(2):168－172.

［6］覃勇榮，陳燕師，劉旭輝，等.土壤重金屬污染背景下的任豆修復(fù)試驗［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2010，29(2):282－287.

［7］中國科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會.現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南［M］.北京:科學(xué)出版社，1999.

［8］王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2006:190－191，241－242.

［9］王萬能，全學(xué)軍，陸天健.超聲波循環(huán)提取桔皮總黃酮的研究［J］.中成藥，2007，29(2):279－281.

［10］馬陶陶，張群林，李俊，等.三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19(1):54.

［11］王小平，吳向華，毛善國.鹽脅迫對九粒白根系活力及葉綠素含量與抗性生理的影響［J］.北方園藝，2013(10):32－34.

［12］覃勇榮，馮濟梅，梁文忠，等.鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態(tài)分析［J］.河池學(xué)院學(xué)報，2012，32(2):17－22.

［13］蔣靚，莊杰云，樊葉楊，等.與水稻耐逆性相關(guān)的葉片丙二醛含量的QTL分析［J］.中國水稻科學(xué)，2007，21(4):436－438.

［14］張憲政.作物生理研究法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1992.

［15］楊素欣，王振鎰.鹽脅迫下小麥愈傷組織生理生化特性的變化［J］.西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，27(2):48－52.

［16］Demidchik V，Sokolik A，Yurin V.The effect of Cu2+ion transport systems of the plant cell plasmalemma［J］.Plant Physiology，1997，114:1 313－1 325.

［17］劉鵬，楊玉愛.鉬、硼對大豆葉片膜脂過氧化及體內(nèi)保護(hù)系統(tǒng)的影響［J］.植物學(xué)報，2000，42(5):461－466.

［18］王燕，李琳玲，許峰，等.金屬離子對盆栽銀杏葉PAL酶活及黃酮含量的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007(2):68－72.