孫自強(qiáng), 王　軍，陳明亮，程會(huì)軍，張　磊，李　慧，吉愛玲, 李彥章

(河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 河南 開封 475004)

小鼠眼球標(biāo)本石蠟切片制作方法的改進(jìn)

孫自強(qiáng), 王軍，陳明亮，程會(huì)軍，張磊，李慧，吉愛玲, 李彥章*

(河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院, 河南 開封 475004)

摘要：目的探討小鼠眼球標(biāo)本石蠟切片的制作方法。方法處死C57BL/6小鼠，取眼球固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%中性多聚甲醛中，通過(guò)嚴(yán)格控制脫水與浸蠟程序并制成石蠟切片，經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察。結(jié)果眼球外形均無(wú)明顯變形和收縮;顯微鏡下視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰，各層細(xì)胞排列緊密，無(wú)明顯裂隙。結(jié)論該方法適合小鼠眼球標(biāo)本切片，尤其是視網(wǎng)膜切片的一種有效制作方法。

關(guān)鍵詞：小鼠；眼球；固定液；HE 染色

中圖分類號(hào)：R322.91

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：編號(hào)： 1672-7606(2015)01-0036-04

收稿日期：2014-12-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31300884 )；河南省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(132300410012)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(14A310020,14A310021)；河南大學(xué)科研基金項(xiàng)目(0000A58152,0000A58214，0000A40566)；河南大學(xué)研究生科研創(chuàng)新(Y1326081)。

作者簡(jiǎn)介：孫自強(qiáng)(1988 -)，男，河南許昌人，在讀碩士研究生，從事視網(wǎng)膜損傷修復(fù)機(jī)制的研究工作。

通訊作者:*李彥章(1965-)，男，河南淅川人，博士，教授，從事肥胖和糖尿病及其并發(fā)癥的教學(xué)及研究工作。

Abstract:ObjectiveTo determine optimal HE staining procedures on paraffin sections of mice eyeball. MethodsThe C57BL/6 mice were killed by using CO2. The eyeballs of the mice were taken and immersed into 4% neutral paraformaldehyde (PFA) solution. The fixed eyeballs were dehydrated and embedded in paraffin. The eyeballs were cut to 5um thickness sections. After HE staining, the sections were observed under a light microscope. ResultsThere was no obvious eyeball distortion or retinal detachment.The structure of retinalthe eyeballs was clear and intact. The cells in retinal were arranged regularly and compactly. Conclusion The improved method for paraffin sections is more effective than others and fit to paraffinsections of mouse eyeball.

Improved method for paraffin sections of mouse eyeball

SUN Ziqiang, WANG Jun, CHEN Mingliang, CHENG Huijun, ZHANG Lei, LI Hui, JI Ailing, LI Yanzhang*

(MedicalcollegeofHenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)

Key words: mouse; eyeball; fixative solution; HE Staining

眼球是一個(gè)構(gòu)造精細(xì)復(fù)雜的球形體，眼球內(nèi)各種組織軟硬度相差懸殊。鞏膜為致密結(jié)締組織，視網(wǎng)膜柔軟容易脫落，晶體很堅(jiān)硬，玻璃體為膠狀物。由于各部分的結(jié)構(gòu)微細(xì)，各層次之間連接性很差，故在制作石蠟切片時(shí)較一般組織困難[1-3]：①固定液很難滲透到組織各層，尤其是不易滲入質(zhì)地堅(jiān)韌的鞏膜，造成眼球內(nèi)各結(jié)構(gòu)分離的現(xiàn)象；②眼球標(biāo)本不像其他組織標(biāo)本新鮮時(shí)可切開固定，需要整個(gè)眼球固定[4-6]；③各層組織由于收縮率的不同，采用常規(guī)脫水和透明的方法容易使視網(wǎng)膜嚴(yán)重收縮而脫離，嚴(yán)重影響切片的完整性，對(duì)組織學(xué)觀察造成影響，進(jìn)而對(duì)眼科病理學(xué)研究造成很大影響。目前，國(guó)內(nèi)外已有制作全眼球病理切片的特殊方法,但仍存在制片周期長(zhǎng)、材料要求特殊、購(gòu)置困難、成本高以及部分方法所用試劑毒性較大等缺點(diǎn)，不能適應(yīng)實(shí)際需要[7-8]。為克服現(xiàn)有方法的不足,我們?cè)诔Ｒ?guī)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行技術(shù)改進(jìn),獲得了滿意的結(jié)果。

1材料和方法

1.1　儀器設(shè)備和主要試劑

TS-12A生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、BM-Ⅸ生物組織包埋機(jī)(湖北省孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；LEICA RM 2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó) Leica 公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%中性多聚甲醛固定液(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；Harris蘇木精(廣州市秀成貿(mào)易有限公司)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%伊紅水溶液(廣州市凱秀貿(mào)易有限公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)了河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。8周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)在IVC籠具系統(tǒng)，恒溫恒濕、12 h/12 h的光明/黑暗環(huán)境中，自由獲取水和食物。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1　取材和固定

處死動(dòng)物，迅速用鑷子摘取眼球,并保存較長(zhǎng)的一段視神經(jīng)(約4 mm)，用生理鹽水洗去血污后立即置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%中性多聚甲醛溶液中，固定 48~72 h。取材時(shí)應(yīng)防止損傷眼球。

2.2　脫水與透明

從固定液取出小鼠眼球，流水沖洗2 h，沖洗時(shí)將組織置廣口瓶中，瓶口罩紗布并用線系牢，置接有橡皮管的自來(lái)水龍頭下，橡皮管的另一端插入瓶?jī)?nèi)，讓水從瓶底向上緩慢溢出。水洗時(shí)水流的速度不要快，以免破壞組織的完整性。流水洗滌的目的是為了去除組織中結(jié)合的固定液及沉淀物，避免組織中留有較多的固定液而妨礙脫水，甚至在組織中生成沉淀物或結(jié)晶而影響染色和結(jié)果[9]。用TS-12A生物組織自動(dòng)脫水機(jī)將所有固定后的組織脫水、透明。注意嚴(yán)格控制無(wú)水乙醇、二甲苯和浸蠟時(shí)間，防止組織變硬變脆影響切片。特別要掌握好透明的時(shí)間，既要完全透明，又不可過(guò)度，一般約30~40 min為宜(眼球已完全下沉，說(shuō)明液體已完全滲透入組織中)。具體步驟為：①脫水：在梯度乙醇中分別進(jìn)行。體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇 2 h→體積分?jǐn)?shù)為 70%乙醇 1.5 h→體積分?jǐn)?shù)為 80%乙醇 1 h→體積分?jǐn)?shù)為 90%乙醇1 h→體積分?jǐn)?shù)為 95%乙醇 30 min→體積分?jǐn)?shù)為 95%乙醇 30 min→體積分?jǐn)?shù)為100%乙醇 15 min→體積分?jǐn)?shù)為 100%乙醇 15 min。②透明：二甲苯 15 min→二甲苯 15 min。

2.3　浸蠟與包埋

透明后的組織在軟蠟(二甲苯和石蠟按1∶1混合，56～58 ℃)中浸 30 min→蠟 I (56～58 ℃)浸 1 h→蠟 II (58～60 ℃)浸 1 h，繼而用石蠟 (56～58 ℃) 包埋 (包埋時(shí)置眼球標(biāo)本水平位)。蠟塊冷卻后即可修整、切片，亦可保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

2.4　切片與貼片

在LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)上，調(diào)整切片刀平面與組織切面間呈 15°左右的夾角，沿視神經(jīng)上下方，從角膜頂點(diǎn)至球壁后極，平行于視神經(jīng)矢狀軸連續(xù)切 5 μm厚的切片(見圖1)。切片刀要鋒利，最好用一次性刀片。切片完成后，將切片投入到 48 ℃的溫水浴中，切片自然展平后，用載玻片傾斜著插入水面撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，將切片置 56～60 ℃烤箱內(nèi)烤 2~3 h，然后進(jìn)行脫蠟、反水和HE染色[10-11](蘇木精浸染 10 min→水洗去浮色→體積分?jǐn)?shù)為 1%鹽酸乙醇分色→自來(lái)水堿化 30 min→浸染伊紅乙醇 5 min→體積分?jǐn)?shù)為 70%乙醇 1 min→體積分?jǐn)?shù)為 80%乙醇 1 min→體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇 1 min→體積分?jǐn)?shù)為 100%乙醇 1 min→體積分?jǐn)?shù)為 100%乙醇 1 min分色→二甲苯 5 min→二甲苯 5 min進(jìn)行透明，然后用中性樹膠封片，最后用光鏡觀察)。

3結(jié)果

切片厚薄均勻，沒(méi)有脫片現(xiàn)象。顯微鏡下 20 個(gè)眼球的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，各層細(xì)胞排列緊密，無(wú)明顯裂隙，染色良好；細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)膨脹、收縮和變形，細(xì)胞核清晰，顏色對(duì)比明顯(見圖2)。改良組織處理方法制片過(guò)程簡(jiǎn)便，所需時(shí)間短，在花費(fèi)較低情況下獲得了滿意結(jié)果。

4討論

眼球是外觀近似球形的結(jié)構(gòu)，外層由致密交錯(cuò)的膠原纖維組成，內(nèi)層視網(wǎng)膜質(zhì)地比較柔軟且容易脫離[12]。眼球腔內(nèi)被質(zhì)地較硬的晶體和透明膠樣玻璃體所充填，故構(gòu)成眼球各層的組織細(xì)胞成分不同，質(zhì)地的軟硬程度也不同。由于眼球外圍由含膠原纖維且致密的鞏膜包裹，常常造成脫水和透明困難，從而引起組織過(guò)硬、變脆，導(dǎo)致切片困難。因此，國(guó)內(nèi)外的研究者[13-15]在眼球制片技術(shù)上的改進(jìn)方法較多。查閱以往文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)有關(guān)眼球切片技術(shù)的改良集中在3個(gè)方面：①尋找合適的固定液；②采用火棉膠包埋法；③剪開眼球，利于固定液浸入。但是上述的方法都有一定的不足。首先是組織固定的作用在于使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分沉淀或凝固，保持原有的結(jié)構(gòu)和位置，增加組織的硬度便于切片[16]。固定是制作石蠟切片標(biāo)本的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，固定液化學(xué)成分的滲透力、pH值、固定時(shí)間等諸多因素都影響固定效果[17]，已有的方法存在制片周期長(zhǎng)、步驟繁瑣費(fèi)時(shí)、材料要求特殊、購(gòu)置困難、成本高以及部分方法所需試劑毒性較大等缺點(diǎn)[18-21]。如Helly固定液,主要成分是氯化汞、重鉻酸鉀和甲醛等。雖然經(jīng)此固定液固定的組織結(jié)構(gòu)完整，清晰，染色鮮艷，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)比度好，但此固定液的配制和固定后需去除組織內(nèi)的重鉻酸鉀和“汞色素”步驟均復(fù)雜，且此固定液中氯化汞屬于劇毒藥品，管理很嚴(yán)格，廢液需要妥善處理，以避免環(huán)境污染[22]。其次是采用火棉膠包埋法，可以避免纖維組織的過(guò)度硬化，減少纖維組織的收縮和扭轉(zhuǎn)，有利于保存原有的組織結(jié)構(gòu)，特別適用于整個(gè)眼球包埋[23]。其操作流程為取出眼球固定、水洗后放入體積分?jǐn)?shù)為 50%、60%乙醇各 6~12 h→體積分?jǐn)?shù)為 70%、80%和 90%乙醇各 6~24 h→體積分?jǐn)?shù)為 95%和無(wú)水乙醇各 12~24 h→乙醚和無(wú)水乙醇等量混合液 24 h→體積分?jǐn)?shù)為2%火棉膠液 24~48 h→體積分?jǐn)?shù)為4%、8%火棉膠液各 24 h至數(shù)周→體積分?jǐn)?shù)為16%火棉膠液1周→用 體積分?jǐn)?shù)為16%或30%火棉膠液包埋組織→用蓋遮擋并留出縫隙使火棉膠液緩慢蒸發(fā)→用手指輕壓火棉膠檢查其硬度(以不出現(xiàn)指紋為宜)→倒入 2 倍量三氯甲烷硬化 24 h→移入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇硬化 6 h→浸入乙醚乙醇混合液中→待乙醚乙醇混合液揮發(fā)后，再次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇硬化→切片。該法非常繁瑣復(fù)雜，而且不能有效保留抗原，無(wú)法進(jìn)行免疫組化，還需要火棉膠切片機(jī)，已經(jīng)不能適應(yīng)需要。另外一種改良方法是在顯微鏡下沿角鞏膜緣剪開眼球，依次去除角膜、虹膜、晶狀體、玻璃體，制作成眼杯再進(jìn)行包埋切片，但是這種方法很容易傷及視網(wǎng)膜，造成人為損傷[23-24]。我們通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫水時(shí)間的控制及脫水劑的濃度,對(duì)能否做出結(jié)構(gòu)完整的眼球切片有著重要影響[25]。故在制作石蠟切片的每一步驟均要防止眼球收縮而引起視網(wǎng)膜凹陷、變形、剝離和組織變硬、變脆等。

綜上所述,我們的方法省時(shí)、操作簡(jiǎn)單,使用試劑均為普通試劑,所制切片完整,各層結(jié)構(gòu)清楚,是制作眼球切片的好方法。

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[責(zé)任編輯姬荷]