黃剛哲 金勇男 (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院老年病科，延吉 133000)

風(fēng)濕性心臟病(RHD)是由甲組乙型溶血性鏈球菌感染引起變態(tài)反應(yīng)(風(fēng)濕熱)的后遺癥，屬自身免疫性疾病［1］。常見發(fā)生病理變化的部位是心臟瓣膜，二尖瓣為最常見受累部位［2］。TGF-β1 通過自身信號通路的調(diào)節(jié)能夠影響多種生命活動，包括細(xì)胞生長、增殖、凋亡等。IL-10 是近幾年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，具有抑制多種炎性分子及自身抗體合成的功效。TGF-β1 信號通路通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，調(diào)控基因的表達(dá)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。我們通過篩選發(fā)現(xiàn)血清IL-10、TGF-β1 濃度與風(fēng)濕性心臟病患者瓣膜組織自身抗原間可能存在異常關(guān)系。我們通過構(gòu)建噬菌體展示文庫篩選自身抗原的異常表達(dá)，并通過一系列外周血標(biāo)志性物質(zhì)比例和濃度的比較，分析其與RHD 之間存在的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 選取2008 年到2013 年我院心內(nèi)科收治的通過24 h 動態(tài)心電圖及超聲心動圖檢測確診為風(fēng)濕性心臟病的63 例患者作為實驗組，NY-HA 評級2～4 級，實驗組患者共計63 例，其中男性27 例，平均年齡(48.2±11.3)歲;女性36 例，平均年齡(52.1±9.8)歲。對照組患者為我院體檢中心隨機(jī)篩選出來的63 位健康志愿者，其中男性27 例，平均年齡(48.2±10.4)歲;女性36 例，平均年齡(52.1±8.9)歲。實驗組和對照組在年齡、性別等中無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。實驗開始前對實驗組和對照組患者均進(jìn)行提前告知并進(jìn)行相關(guān)介紹，征得患者及家屬同意后開始試驗。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)冠脈CT、X 光透視和肝功腎功檢測、癌胚檢測、血常規(guī)檢查排除存在冠心病、肺功能異常、肝腎功能不全、腫瘤、其他炎性感染性疾病和糖尿病、甲亢甲減等內(nèi)分泌疾病的存在。詢問近期藥物使用情況，確定患者無服用免疫調(diào)節(jié)劑。詢問病史，確定一月內(nèi)無其他自身免疫性疾病的發(fā)生。

排除標(biāo)準(zhǔn):排除存在冠狀動脈異常，肝、腎功能異常、存在惡性腫瘤及存在感染性和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者，對使用影響試驗的藥物的患者和存在其他自身免疫性疾病的患者，向患者和家屬解釋清楚后，排除出實驗組。

1.1.2 主要材料及試劑 實驗組及對照組均取抗凝血標(biāo)本5 ml×2 管，上海研晶生化試劑有限公司生產(chǎn)的鼠抗人CD4-FITC 熒光抗體(克隆:mPC-13);武漢科昊佳生物科技有限公司生產(chǎn)的鼠抗人CD25-PE(克隆:mPC-19);上海北諾生物科技有限公司分裝的eBioscince 公司生產(chǎn)的Anti-Human Foxp3 APC 100 testsebioscience 試劑盒。安迪生物科技(上海)有限公司銷售的R＆D IL-10 和TGF-β1 酶聯(lián)免疫試劑盒。北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的R1200 總RNA 提取試劑盒;北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的RNeasy Plus Mini Kit(250)74136 qiagen 試劑盒;Clontech 公司生產(chǎn)的SMARTTMcDNA Library Construction Kit 試劑盒以及馬克西姆公司生產(chǎn)的PCR 反應(yīng)試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 患者心肌組織噬菌體展示文庫的構(gòu)建與自身抗原RHDAG1 的獲得與鑒定 兩組間所有對象均取新鮮心耳組織保存于樣本保護(hù)液中，液氮下手工研缽制備組織勻漿，進(jìn)行心肌組織總RNA 提取。參照SMARTTMcDNA Library Construction Kit 試劑盒構(gòu)建心肌組織噬菌體展示文庫［3］。對文庫進(jìn)行包裝和鑒定后進(jìn)行文庫免疫篩選，并對自身抗原編碼基因進(jìn)行分析，確定相關(guān)自身免疫抗原。對自身抗原基因表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建并進(jìn)行體外表達(dá)和免疫性試驗。

1.2.2 血樣標(biāo)本的處理及使用 實驗組及對照組的5 ml×2 管抗凝血標(biāo)本，一管5 000 r/min×3 min離心后取血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行對IL-10、TGF-β1 血清濃度的檢測。另一管進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離。將樣本細(xì)胞濃度稀釋至106級別/ml。取樣20 μl 加入相關(guān)試劑盒，再分別取CD4-FITC 25 μl、CD25-PE 25 μl 加入，37℃避光保存30 min，5 000 r/min×3 min 離心棄上清。加入試劑盒相應(yīng)固定一裂解液3 ml 37℃避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后加入Foxp3-APC 30 μl 37℃避光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌、離心，使用流式細(xì)胞檢測儀檢測，CD4 設(shè)門，分析相應(yīng)CD4+CD25+Foxp3+亞群，每份標(biāo)記1 萬個細(xì)胞，以CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T淋巴細(xì)胞的比例表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 樣本資料采用PEMS 3.1 軟件處理。資料采用t 檢驗，以P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 具有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 對RHD 患者瓣膜組織自身抗原變化的比較將文庫制成雙層瓊脂板，37℃恒溫培養(yǎng)4.5 h，10 mmol/L IPTG 潤洗覆蓋培養(yǎng)6 h，標(biāo)記后取膜，脫脂奶粉4℃封閉培養(yǎng)10 h，抗血清37℃雜交結(jié)合2 h后洗膜3 次，多次雜交后選取陽性板繼續(xù)篩選，經(jīng)多次篩選得出三種疑似與RHD 相關(guān)的瓣膜組織自身抗原，分別是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三種，通過與對照組患者的比較，發(fā)現(xiàn)RHDAG1 與對照組間具有明顯的差異，且將體外表達(dá)的RHDAG1 與3例風(fēng)濕熱患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分別進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)試驗，發(fā)現(xiàn)RHDAG1 與風(fēng)濕熱和RHD 患者血清出現(xiàn)結(jié)合，與健康志愿者血清不結(jié)合，這提示RHDAG1 可能與風(fēng)濕熱及風(fēng)濕性心臟病的發(fā)展有關(guān)，結(jié)果見表1。

2.2 兩組間外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例的比較 我們對兩組實驗對象的血樣處理后，使用流式細(xì)胞檢測儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例并進(jìn)行比較，提示RHD 患者血清Treg 比例低于對照組的相關(guān)數(shù)據(jù)，具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表2。

2.2 兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較 我們對血樣離心后取血清酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-10、TGF-β1 血清濃度，結(jié)果顯示TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表達(dá)出現(xiàn)上升，使CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量上升，兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較具有差異性，CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞與IL-10、TGF-β1 的變化正相關(guān)。結(jié)果見表3。

表1 瓣膜組織自身抗原變化的比較Tab.1 Comparison of valvular tissue autoantigen changes

表2 兩組間外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例的比較Tab.2 Comparison peripheral regulatory T cell percentage of between two groups

表3 兩組間IL-10、TGF-β1 血清濃度的比較Tab.3 Comparison of IL-10，TGF-β1 serum concentration between two groups

3 討論

風(fēng)濕性心臟病是一種最典型的人類自身免疫性疾病，因為人體心肌組織與甲組乙型溶血性鏈球菌表面抗原相似，在甲組乙型溶血性鏈球菌感染后機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，誘發(fā)免疫反應(yīng)，在甲組乙型溶血性鏈球菌被消滅后繼續(xù)與人體組織蛋白產(chǎn)生交叉識別，導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)識別錯誤進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。甲組乙型溶血性鏈球菌細(xì)胞壁表面含有多糖及多種表面蛋白(M、T、R 等)［4］。在人體組織中諸如心肌球蛋白、原肌球蛋白以及多種瓣膜蛋白上均有M 蛋白的身影，M 蛋白作為甲組乙型溶血性鏈球菌最重要的抗原結(jié)構(gòu)，由于與體內(nèi)多種表面蛋白的交叉，構(gòu)成了人體對鏈球菌耐受和自身免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。

我們通過尋找能夠引起RHD 發(fā)生自身免疫反應(yīng)的抗原，希望能為RHD 的研究找到一條新路。通過構(gòu)建心肌組織噬菌體展示文庫，對文庫進(jìn)行鑒定和免疫篩選，并對自身抗原編碼基因進(jìn)行分析，最終確定三組疑似與RHD 相關(guān)的瓣膜組織自身抗原，分別是THYN1V1、THYN1V2、RHDAG1 三種，通過與對照組患者的比較，發(fā)現(xiàn)RHDAG1 與對照組間具有明顯的差異。將在體外通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄表達(dá)的RHDAG1 與3 例風(fēng)濕熱患者、5 例RHD 患者和5 例健康志愿者的血清分別進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)試驗，發(fā)現(xiàn)RHDAG1 與風(fēng)濕熱和RHD 患者血清出現(xiàn)結(jié)合，與健康志愿者血清不結(jié)合，這提示RHDAG1 可能與風(fēng)濕熱及風(fēng)濕性心臟病的發(fā)展有關(guān)。我們通過對組織展示文庫的構(gòu)建和與相關(guān)樣本的血清進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)闡釋了交叉抗原RHDAG1 與RHD 之間相關(guān)聯(lián)的直接證據(jù)。

各實驗樣本血樣經(jīng)處理后使用流式細(xì)胞檢測儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例，各組結(jié)果進(jìn)行比較，提示RHD 患者血清Treg 比例低于對照組樣本中的相關(guān)數(shù)據(jù)，具有統(tǒng)計學(xué)差異。有研究顯示Treg 細(xì)胞有抑制自身免疫疾病發(fā)生的功效［5］。當(dāng)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量減少時，患者免疫功能下降，促使B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一定數(shù)量的自身抗體，極易發(fā)生自身免疫性損傷。鑒于這種抗體會隨血液循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)散，造成了無法清除和長時間持續(xù)存在的影響，容易引起疾病的復(fù)發(fā)［6］。通過臨床跟蹤我們也可發(fā)現(xiàn)，RHD 患者體內(nèi)Treg 細(xì)胞低于正常水平，且大部分患者病史長，出現(xiàn)病情反復(fù)，這也說明與抗體的無法清除和長時間持續(xù)有關(guān)。心肌組織通過長時間的抗擊自身抗體的攻擊，最終會導(dǎo)致瓣膜部位發(fā)生病變，導(dǎo)致嚴(yán)重的病理后果。

IL-10 是近幾年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，又稱細(xì)胞素合成抑制因子［7］。具有抑制多種炎性分子及自身抗體合成的功效［8］。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)目前共發(fā)現(xiàn)三種類型，分別為TGF-β1、TGF-β2 和TGFβ3。TGF-β1 由體內(nèi)單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞分泌，在RHD 中表達(dá)增強(qiáng)，提示可能與瓣膜纖維化有關(guān)［9］。TGF-β1 的上升可以使Treg 中Foxp3 表達(dá)升高，使CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量上升，這也印證了實驗中兩組間外周血調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例較RHD 患者CD4+CD25+Foxp3+-Treg/CD4+T 細(xì)胞的比例明顯低于對照組健康志愿者的比例?？鼓獦?biāo)本離心后取血清進(jìn)行ELISA，檢測IL-10、TGF-β1 血清濃度，結(jié)果顯示兩組間IL-10、TGF-β1 血清的濃度間的比較均具有明顯的差異性。

綜上所述，自身抗原RHDAG1 的表達(dá)對RHD的進(jìn)展有一定作用，檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的比例和IL-10、TGF-β1 血清濃度對于RHD 的診斷具有重要意義。

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