黃文明，沈明華

（1.青海省海南州同德縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海 同德813200 ；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016）

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一種傳染性極強(qiáng)的急性、病毒性傳染病，宿主范圍較廣泛，能夠使犬、貂、貉、狐、熊、小熊貓、大熊貓、狼、獅、虎、金貓、猞猁等多種動(dòng)物發(fā)生自然感染和發(fā)病。CDV在我國犬中的發(fā)病率和致死率都很高，寵物犬一旦感染后發(fā)病率可達(dá)100 %，死亡率也高達(dá)80 %，許多經(jīng)濟(jì)動(dòng)物如水貂等一旦感染發(fā)病也會(huì)給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。近年來國內(nèi)不斷有犬瘟熱病毒感染發(fā)病的報(bào)道，應(yīng)引起對(duì)該病毒的重視，加快相應(yīng)新型疫苗與診斷試劑的研究。本研究對(duì)臨床上1 例發(fā)病犬進(jìn)行臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷，并分離到了病毒，最后確診發(fā)病犬感染了犬瘟熱病毒，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 取臨床發(fā)病的分泌物和排泄物進(jìn)行相關(guān)診斷；犬瘟熱抗原快速檢測(cè)卡，購自深圳市康百得生物科技有限公司；一步法RT-PCR檢測(cè)試劑盒、DL-2 000 DNAMarker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 臨床癥狀 發(fā)病犬2 月齡，臨床可見眼結(jié)膜潮紅，分泌物多，有眼屎。精神沉郁，臥地不愿走動(dòng)，發(fā)熱，體溫高達(dá)41.5 ℃，吃食減少，便血，未進(jìn)行過犬瘟熱疫苗的免疫接種，根據(jù)臨床癥狀初步懷疑為犬瘟熱病毒感染。

1.3 鏡檢 取病犬的分泌物和排泄物，涂片、染色、做美藍(lán)和革蘭染色電鏡鏡檢。

1.4 試紙條檢測(cè) 利用商品化的犬瘟熱病毒檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。用干凈的棉簽蘸取病犬的分泌物和排泄物，放到專用稀釋液中充分?jǐn)嚢?，用吸管吸取上清液，在試紙條樣品孔正中滴加1滴吸液，10 min 后，觀察結(jié)果。

1.5 RT-PCR 檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]合成犬瘟熱病毒檢測(cè)引物，提取病犬的分泌物和排泄物的病毒基因組，按照參考文獻(xiàn)[3]的RT-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳觀察結(jié)果。

1.6 病毒的分離培養(yǎng) 將1.4 中病犬的分泌物和排泄物稀釋液用0.45 μm 的濾器過濾除菌作為病毒液，接種單層非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）貼壁細(xì)胞，37 ℃作用1 h 后，加入含2 %新生牛血清的DMEM維持液培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，當(dāng)出現(xiàn)70 %～80 %細(xì)胞病變時(shí)收獲病毒，盲傳3 代，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 分離毒株血凝價(jià)測(cè)定 96 孔V型板第一排的12 個(gè)孔中依次加入生理鹽水25 μL，取第3 代分離毒株25 μL 加入第一孔，混合后取25 μL 加入第二孔，依次稀釋到第11 個(gè)孔，即211稀釋，第12 孔作為空白對(duì)照，取25 μL 1 %雞紅細(xì)胞加入上面孔中，37 ℃放置1 h，觀察血凝試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 分離毒株毒價(jià)測(cè)定 用96 孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)定細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50），將分離毒株做10-1～10-10倍梯度稀釋，分別接種96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8 個(gè)孔，0.1 mL/孔，置5 % CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)7 d，逐日觀察記錄細(xì)胞病變情況，根據(jù)Reed-Munch 法計(jì)算TCID50。

1.9 分離毒株RT-PCR 檢測(cè) 按照1.5 的方法對(duì)第3 代分離毒株進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。

1.10 分離毒株的中和試驗(yàn) 將第3 代分離毒株與等量抗犬瘟熱病毒特異性血清混合均勻后，置4 ℃中和反應(yīng)過夜，次日接種單層Vero 貼壁細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況，同時(shí)設(shè)不接種和接種第3 代分離毒株分別作為陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果 病犬的分泌物和排泄物鏡檢未見任何致病菌。

2.2 試紙條檢測(cè)結(jié)果 如圖1 所示，試紙條檢測(cè)線的位置出現(xiàn)清晰可見的條帶，表明試紙條檢測(cè)犬瘟熱病毒陽性。

圖1 試紙條檢測(cè)結(jié)果

2.3 臨床樣品RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 如圖2 所示，RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳顯示在242 bp 的位置具有特異性的擴(kuò)增條帶，與郭玲等[3]的報(bào)道相一致，RT-PCR 檢測(cè)犬瘟熱病毒陽性。

圖2 R T-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.4 病毒的分離培養(yǎng)結(jié)果 如圖3 所示，病毒液接種72 h 后開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞出現(xiàn)變小、圓縮，細(xì)胞顆粒增多，許多細(xì)胞融合聚集呈多核巨細(xì)胞，部分細(xì)胞壞死脫落，而未接毒的Vero 細(xì)胞無變化。

圖3 正常Vero細(xì)胞和接毒病變細(xì)胞

2.5 分離毒株血凝試驗(yàn)（HA）結(jié)果 觀察血凝試驗(yàn)結(jié)果可見血凝板的1～8 個(gè)孔出現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞凝集，該病毒可以凝集1 %雞紅細(xì)胞，與犬瘟熱病毒能與雞、豚鼠等紅細(xì)胞發(fā)生不規(guī)律的凝集反應(yīng)特性相符。

2.6 分離毒株毒價(jià)測(cè)定結(jié)果 按Reed-Muench 法測(cè)定分離毒株的TCID50為10-4.25/0.1 mL。

2.7 分離毒株RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 第3 代分離毒株RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽性。

2.8 分離毒株中和試驗(yàn)結(jié)果 分離毒株與犬瘟熱病毒陽性血清中和反應(yīng)后接種的Vero 細(xì)胞未見任何細(xì)胞病變，表明分離毒株可被犬瘟熱病毒陽性血清所特異性中和。

3 討論

發(fā)生犬瘟熱病毒感染后，應(yīng)該盡早診斷并采取對(duì)癥治療措施，治療原則是加強(qiáng)機(jī)體免疫力，同時(shí)采取抗菌消炎方法防止繼發(fā)感染發(fā)生。故對(duì)疫病的準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要，隨著CDV研究的深入，RTPCR、熒光定量RT-PCR、RT-LAMP、ELISA、膠體金等各種技術(shù)不斷應(yīng)用到CDV的檢測(cè)中，本研究根據(jù)自身試驗(yàn)條件分別選擇了膠體金免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)和RT-PCR分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)臨床診斷疑似CDV感染的病例進(jìn)行了檢測(cè)，經(jīng)后續(xù)的病毒分離鑒定證實(shí)此次診斷結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。對(duì)CDV的分離培養(yǎng)，接種細(xì)胞的選擇至關(guān)重要，魏風(fēng)等[4]研究表明，CDV能在多種細(xì)胞上生長，但在Vero 細(xì)胞上病變最明顯，毒價(jià)最高。故本研究選擇Vero 細(xì)胞作為了CDV的分離培養(yǎng)細(xì)胞，取得了良好的試驗(yàn)結(jié)果，分離的毒株TCID50達(dá)10-4.25/0.1 mL，經(jīng)細(xì)胞病變觀察、血凝試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、RT-PCR 鑒定分離株病毒為CDV。

隨著我國特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和寵物業(yè)的不斷發(fā)展，CDV的發(fā)病率一直居高不下，加強(qiáng)CDV診斷與流行病學(xué)方面研究工作，了解不同地區(qū)CDV的流行情況，對(duì)預(yù)防和控制犬瘟熱病毒感染具有重要意義。該病的診斷就是要盡可能做到早診斷，早治療，加大疾病治愈的幾率。要控制和消滅CDV，應(yīng)該加強(qiáng)該病毒的免疫接種，臨床上好些病例都是由于未進(jìn)行疫苗免疫接種導(dǎo)致，由于該病的傳播迅速，易感動(dòng)物種類繁多，給該病的綜合防控提出很高要求。本試驗(yàn)分離鑒定了1 株CDV病毒，豐富了我國地方毒株資源，為疾病的相關(guān)診斷和防治提供參考，也為本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行犬瘟熱疫苗與診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]李鑫，楊霞.菏澤市犬瘟熱發(fā)病調(diào)查[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（4）：68-70.

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[3]郭玲，萬莉，馬磊，等.犬瘟熱病毒RT-PCR 檢測(cè)方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（2）：60-64.

[4]魏鳳，管宇，王金良，等.犬瘟熱病毒在不同組織細(xì)胞上增殖特性的研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（2）：83-86.