孫海波+鄒美智+任洪巖+王景余+李艷萍+馮瑞光

摘 ? ?要：利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)62份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行篩選攜帶Xa23、Stvb-i、Pi-1抗病基因種質(zhì)資源。結(jié)果表明：經(jīng)PCR檢測(cè)，從中選擇出含兩種抗病基因的材料有10個(gè)，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽(yáng)性的材料有4個(gè)，Xa23和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有1個(gè)，Pi-1和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有5個(gè);含有一種抗病基因材料40個(gè)，占64.5%，其中Xa23呈陽(yáng)性的材料有3個(gè)，占4.8%;Pi-1呈陽(yáng)性的材料有17個(gè)，占27.4%;Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有20個(gè)，占32.3%;本試驗(yàn)為實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇水稻抗病育種打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻種質(zhì)資源;分子標(biāo)記輔助選擇;抗病;Xa23;Stvb-i;Pi-1

中圖分類(lèi)號(hào)：S511 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.04.001

Screening the Rice Germplasm Containing Disease-resistant Genes Xa23， Stvb-I， Pi-1 by Molecular Marker-assisted Method

SUN Hai-bo，ZOU Mei-zhi，REN Hong-yan，WANG Jing-yu，LI Yan-ping，F(xiàn)ENG Rui-guang

（Tianjin Crops Research Institute， Tianjin 300384，China）

Abstract：In the study， the rice germplasm containing disease-resistant genes Xa23， Stvb-i， Pi-1 was screened from 62 anther culture descendants by molecular marker-assisted method. The results showed that 10 rice cultivars having two disease resistant genes was obtained， which was 16.1%. Among them， 4 cultivars contained Xa23 and Pi-1， one cultivar had Xa23 and Stvb-I， and 5 cultivars contained Pi-1 and Stvb-i. There are 40 cultivars carrying one disease resistant gene， which was 64.5%. In which 3 cultivars carried Xa23 （4.8%）， 17 ones carried Pi-1 （27.4%） and 20 ones had Stvb-i （32.3%）. Such findings in the paper provided basis for breeding of disease-resistant rice by molecular marker-assisted method.

Key words： rice germplasm;marker-assisted selection;resistance;Xa23;Stvb-i;Pi-1

病害是水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因子。在水稻生產(chǎn)中，白葉枯病、稻瘟病和條紋葉枯病，廣泛發(fā)生在全國(guó)各個(gè)稻區(qū)，流行年份一般減產(chǎn)10%～20%，重者高達(dá)40%～50%，甚至絕收 [1]。實(shí)踐證明，選育和應(yīng)用水稻抗病品種，利用其自身的抗病性是目前防治水稻病害的最經(jīng)濟(jì)、最有效的措施[2]。因此，為了高效地培育出抗病品種，開(kāi)展水稻抗病基因型分子標(biāo)記輔助選擇，充分利用抗病基因的表達(dá)來(lái)防止和控制這三大病害的發(fā)生，具有實(shí)際意義。

分子標(biāo)記輔助選擇是直接通過(guò)與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來(lái)選擇基因型[3]，因其不易受環(huán)境影響，選擇結(jié)果科學(xué)可靠，并可以在早代進(jìn)行選擇，故被廣泛地用于水稻白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病等抗病育種中，已成為水稻抗病育種的一個(gè)重要輔助手段。Xa23是一個(gè)來(lái)自普通野生稻的抗白葉枯病、抗譜最廣、全生育期抗性導(dǎo)入效應(yīng)強(qiáng)的完全顯性基因[4]，已報(bào)道常用的Xa23標(biāo)記主要有RM206[5]、C189[6]等。Pi-1是一個(gè)來(lái)源于秈稻品種AC23中的具廣譜抗性的顯性抗稻瘟病基因[7]，已報(bào)道常用的Pi-1標(biāo)記主要有MRG4766[8]、RM144[9]等;Stvb-i是一個(gè)顯性的全生育期高抗條紋葉枯病基因[10]，已報(bào)道常用的Stvb-i標(biāo)記主要有ST10[11]、RM11-8[12]等。

本研究試圖利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇攜帶抗Xa23、Stvb-i、Pi-1三種病害基因的種質(zhì)資源，以期掌握水稻種質(zhì)資源是否含有抗病基因，為分子設(shè)計(jì)水稻抗病育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 ? ?材料和方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

陽(yáng)性植株對(duì)照親本分別為攜帶抗白葉枯病Xa23基因的水稻材料BG152、攜帶抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118（由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供）和攜帶抗條紋葉枯病Stvb-i基因的花育409，以及從天津、北京、遼寧、江蘇等省市引進(jìn)或自育水稻種質(zhì)資源59份。

1.2 ? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ? ?種植方式 ? ?每份資源同期播種、插秧，插3行區(qū)，每行9穴，每穴單株，株行距為13.3 cm×30 cm。田間管理同一般水田。

1.2.2 ? ?PCR檢測(cè)

1.2.2.1 ? ?DNA提取及引物的合成 ? ?在分蘗期對(duì)引進(jìn)的水稻種質(zhì)資源，采用簡(jiǎn)易SDS抽提法[5]提取單株水稻幼嫩葉片DNA。

按文獻(xiàn)檢閱[5，8，12]，設(shè)計(jì)與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2.2 ? ?PCR擴(kuò)增 ? ?PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL 10×Buffer（含20 mmol·L-1 Mg2+），10～30 ng 模板DNA，0.2 mmol·L-1 dNTP（2.5 mmol·L-1），正向和反向引物各0.2 μmol·L-1，1 U Taq酶，ddH2O補(bǔ)至20 μL。

PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2.3 ? ?電泳 ? ?每管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加2 μL的溴酚藍(lán)（含0.25%溴酚藍(lán)、40%蔗糖水溶液）混勻，點(diǎn)入8%聚丙酰胺變性測(cè)序凝膠上電泳，EB染色顯帶，記錄結(jié)果。其中含有目的基因帶型記為“+”，不含目的基因帶型的記為“-”。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?Stvb-i的PCR檢測(cè)

用攜帶抗條紋葉枯病Stvb-i基因的花育409作陽(yáng)性植株對(duì)照，利用與Stvb-i基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)61份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行PCR檢測(cè)，其 PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗條紋葉枯病Stvb-i基因的26份，分別為GQ-C2、GQ-C3、GQ-C4、GQ-C6、GQ-C9、海平稻選、07-15、SX867、LD30、LD12、ZD99、ZD9424、ZD88、XYG200、ZF9號(hào)、YJ689、H028、WYJ8號(hào)、XD3號(hào)、XD5號(hào)、XA931、ZD18、ZD19、LJ6號(hào)、LJ7號(hào)、LJ9號(hào)等。

2.2 ? ?Xa23的PCR檢測(cè)

用攜帶抗白葉枯病Xa23基因的中間材料BG152作陽(yáng)性植株對(duì)照，利用與Xa23基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)61份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行PCR檢測(cè)，其 PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗白葉枯病Xa23基因的7份，分別為皖香早稻、GQ-C6、GQ-C11、CA1、W21621、HD5號(hào)、W0625-5等。

2.3 ? ?Pi-1的PCR檢測(cè)

用攜帶抗稻瘟病Pi-1基因的水稻材料R118作陽(yáng)性植株對(duì)照，利用與Pi-1基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)61份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行PCR檢測(cè)，其 PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，從61份水稻種質(zhì)資源中篩選出含抗稻瘟病Pi-1基因的27份，分別為GQ-C3、GQ-C5、GQ-C7、GQ-C8、GQ-C11、JD263、JD1007、LP-104、07-15、09XB107、W21621、LD12、WXJ21號(hào)、ZD99、ZD9424、W2845、WLJ1號(hào)、HD5號(hào)、YD8號(hào)、WYJ3號(hào)、WXJ14號(hào)、JH香稻、W0625-5、XA931、XXF2號(hào)、XF2號(hào)等。

2.4 ? ?水稻種質(zhì)資源的PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)

62份水稻種質(zhì)資源的PCR檢測(cè)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。

從表3可以看出，62份水稻資源經(jīng)PCR檢測(cè)，從中篩選出含有一種抗病基因資源40份，占64.5%，其中Xa23呈陽(yáng)性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈陽(yáng)性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有20份，占32.3%。含兩種抗病基因的資源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽(yáng)性的材料有4份，Xa23和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有1份，Pi-1和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有5份。無(wú)目的基因的資源有12份，占19.4%。

3 ? ?討 論

選擇是水稻育種中的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的水稻育種選擇方法是對(duì)符合育種目標(biāo)的農(nóng)藝性狀如株高、穗數(shù)、穗粒數(shù)、米質(zhì)、抗逆、抗病等進(jìn)行直接選擇，即是通過(guò)個(gè)體表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，而不是對(duì)基因型進(jìn)行直接選擇。一般而言，這種方法對(duì)質(zhì)量性狀的選擇是有效的，對(duì)數(shù)量性狀的選擇，由于存在一因多效、多因一效等作用，個(gè)體的表現(xiàn)型與基因型存在較大的差異，尤其是水稻的抗病育種，通過(guò)田間表現(xiàn)型進(jìn)行個(gè)體選擇的準(zhǔn)確性較低[13-15]。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離關(guān)系的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。利用分子標(biāo)記輔助選擇已應(yīng)用于水稻抗病育種的實(shí)踐中，并取得一些實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。在聚合多個(gè)單一病害抗性基因方面：鄧其明等[16]利用分子標(biāo)記將3個(gè)抗白葉枯病基因Xa21、Xa4和Xa23聚合到綿恢725中。秦剛等[17]利用分子標(biāo)記技術(shù)將水稻白葉枯病基因Xa4、Xa23進(jìn)行了聚合，并成功獲得聚合體。柳武革等[18]通過(guò)雜交、回交和自交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將Pi-1、Pi-2基因?qū)霚孛艉瞬挥礕D-7S中，獲得5個(gè)攜帶兩個(gè)抗性基因的純合改良不育株系。陳紅旗等[19]利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-2、Pi-33，獲得6個(gè)金23B導(dǎo)入系。在聚合多個(gè)不同抗病基因方面：倪大虎等[20]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合高抗白葉枯病的Xa23基因和高抗稻瘟病Pi9（t）基因，獲得了漢川基因的優(yōu)良株系L10～L13。倪大虎等[21]通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)的雜交、自交相結(jié)合的方法，將抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白葉枯病的Xa21、Xa23基因聚合到同一株系中，經(jīng)多代大田或和溫室接菌鑒定、室內(nèi)標(biāo)記選擇和田間農(nóng)藝性狀的篩選，獲得了4個(gè)三基因聚合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系。Sugiura等[22]利用分子標(biāo)記輔助選擇將水稻條紋葉枯病基因Stvb-i和抗稻瘟病基因pb1聚合，選育出新的雙抗水稻品種愛(ài)知106。王軍等[23]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b和抗條紋葉枯病基因Stvb-i，選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗水稻新品系74121。

本研究利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，快速高效地篩選出了含廣譜顯性抗白葉枯病Xa23基因、抗稻瘟病Pi-1基因和抗條紋葉枯病Stvb-i基因的水稻種質(zhì)資源，從中篩選出含有一種抗病基因資源40份，占64.5%，其中Xa23呈陽(yáng)性的材料有3份，占4.8%;Pi-1呈陽(yáng)性的材料有17份，占27.4%;Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有20份，占32.3%。含兩種抗病基因的資源有10份，占16.1%，其中Xa23和Pi-1呈陽(yáng)性的材料有4份;Xa23和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有1份;Pi-1和Stvb-i呈陽(yáng)性的材料有5份，為今后作為水稻抗性育種的骨干親本，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇水稻抗病育種奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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