謝吉容， 陳　媛

(重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 重慶　永川　402168)

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鐵皮石斛菌根研究進(jìn)展

謝吉容， 陳媛

(重慶文理學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 重慶永川402168)

[摘要]鐵皮石斛是名貴中藥，由于過度開采其野生資源已十分稀少.現(xiàn)今鐵皮石斛的快繁技術(shù)已趨于成熟，但移栽難度較大.幾乎所有蘭科植物都與真菌有共生關(guān)系，在蘭科植物的生長過程中，共生真菌有極其重要的作用.研究鐵皮石斛與真菌的共生關(guān)系及其共生菌的種類，有利于提高試管苗的移栽成活率.本文綜述了鐵皮石斛共生真菌的種類和特點(diǎn)，闡述了內(nèi)生共生菌對鐵皮石斛生長的影響和機(jī)理.

[關(guān)鍵詞]鐵皮石斛；菌根；共生菌；研究進(jìn)展

鐵皮石斛(DendrobiumcandidumWall.exLindl)又名黑節(jié)草,俗稱鐵皮楓斗,為蘭科石斛屬多年生常綠草本植物,是一種名貴藥材,具有生津益胃、清熱養(yǎng)陰的功用.現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：鐵皮石斛具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，對惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等疾病具有很好的療效[1,2].鐵皮石斛主產(chǎn)于我國安徽西南部，浙江東部，福建西部，廣西西北部，四川、云南東南部地區(qū)，生長在1 600 m的山地半陰濕的巖石上[3].

由于過度采挖，加之在自然條件下生長緩慢，成活率低等，現(xiàn)今野生石斛資源已十分稀少.自1960年法國人Gmorel利用石斛莖尖組織培養(yǎng)無病毒植株的無性繁殖技術(shù)創(chuàng)立以來，石斛組培快繁技術(shù)已比較成熟[4].相對于快繁而言，鐵皮石斛的移栽難度仍然較大，主要原因是在自然條件下所有蘭科植物都與真菌共生，而人工栽培基質(zhì)尚未接種能與石斛共生的真菌，難以模擬其自然生境條件.因此，對鐵皮石斛的共生菌進(jìn)行分離研究，是解決這一問題的關(guān)鍵.

1石斛共生菌的特點(diǎn)

在內(nèi)生菌的研究中，現(xiàn)在被廣泛接受的概念是由Petrini提出的.他將內(nèi)生菌定義為那些在植物生活史中的某一段生活在植物組織內(nèi),對植物組織沒有引起明顯病害的菌,包括那些在其生活史中的某一階段在表面生的腐生菌,以及對宿主暫時沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌[5].它生長于植物的組織細(xì)胞間，各個部位的含量不一[6,7].

蘭花的菌根真菌在根表面不形成菌套，疏松排列，不通過寄主細(xì)胞吸取碳水化合物，而是從其他有機(jī)物上提取碳源以及通過自身細(xì)胞的消解，為石斛提供必要的水分與養(yǎng)分[8,9].真菌通過根被的通道細(xì)胞向皮層細(xì)胞侵染，并通過紋孔使相鄰細(xì)胞相互感染，菌絲多棲居在皮層的薄壁細(xì)胞內(nèi)，形成共生體[10].鐵皮石斛屬于附生蘭，與地生蘭相比，在種子萌發(fā)階段，它與真菌具有更廣泛的共生關(guān)系.但大多數(shù)人認(rèn)為，真菌與石斛的共生不是高度專一的，具有一定的傾向性.這種傾向性與環(huán)境條件有關(guān)[11].

2石斛共生菌的分離鑒定

目前對蘭科共生真菌的研究方法主要有兩種：一是將文獻(xiàn)中查找到的共生真菌直接接種于無菌石斛試管苗，判斷該真菌對石斛生長發(fā)育的影響，從而判斷其共生關(guān)系；二是從野生的石斛根部分離真菌，分析其共生菌的種類.

內(nèi)源共生菌分離的具體方法為：先將石斛根清洗、切段，進(jìn)行消毒處理，以避免非內(nèi)原共生菌的干擾；然后將消毒好的根段放于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)內(nèi)源性真菌，根據(jù)其最后形態(tài)特征進(jìn)行種類鑒定.

在判斷所分離到的真菌是否有利于石斛的生長時，可將分離得到的真菌分別接種到無菌試管苗中，待生長一段時間后，測定其各項(xiàng)生理指標(biāo)，并與空白組進(jìn)行對照，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出不同真菌對石斛生長的影響.

3共生真菌的種類

目前對蘭科植物的共生真菌的大量研究中，已分離得到石斛屬共生真菌主要為擔(dān)子菌和半知菌類[5]，但專門針對鐵皮石斛的共生真菌分離較少.根據(jù)陳玉棟[7]、郭順星[12]、范黎[13,14]等的研究情況，將已分離并鑒定的內(nèi)生真菌種類及其特征列出如下：

柱孢霉屬(Cylindrocarponsp.)：半知菌類，黑盤孢目，黑盤孢科暗色轉(zhuǎn)隔孢族.分生孢子盤生于表皮下，盤形或鋪展?fàn)?；分生孢子線形，無隔膜或僅少數(shù)隔膜，無色，常屈曲.

枝頂孢霉屬(Acremoniumsp.)：半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科單孢亞科，葡萄孢族.腐生或近于腐生，常常具有寄生性，分生孢子光滑或超微粗糙，常單生；分生孢子梗長，不分枝或近乎不分枝，無小齒，疏松，蛛網(wǎng)狀.

蝕絲霉屬(Myceliophthoreaesp.)：半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科單孢亞科，簡梗孢霉族.寄生于真菌，分生孢子單生，至少不聚成頭狀，似卵形，光滑；分生孢子梗短或無.

頭孢霉屬(Cephalosporiumsp.)：半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科單孢亞科，頭孢霉族.不孕菌絲長并呈匍匐狀；分生孢子短圓筒形，生于小柄或小梗上，分生孢子聚生呈頭狀，埋于膠質(zhì)物內(nèi).

簡梗孢霉屬(Chromosporiumsp.)：半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科單孢亞科，簡梗孢霉族.腐生，分生孢子幾乎不存在，分生孢子散生.

絲核菌屬(Rhizoctomiasp.)：無孢菌群.菌絲褐色，在分枝處略縊束，離此不遠(yuǎn)處形成隔膜；菌核從菌絲生出，以菌絲與基質(zhì)相連，褐色，漸呈紅棕色，表面粗糙，內(nèi)外顏色一致，表面細(xì)胞稍小，但與內(nèi)部無明顯的界限，不形成無性孢子.

鐮刀菌屬 (Fusariumsp.)：半知菌類，瘤痤孢目，瘤痤孢科，鮮色多孢族.分生孢子梗單生或集成分生孢子座，細(xì)長或粗短，單枝或分枝，或產(chǎn)生輪輻射狀排列的瓶形小梗；分生孢子無色，變異很大，常埋藏于膠質(zhì)物內(nèi).

毛殼菌屬 (Chaetomiumsp.)：子囊菌類，鹿角菌目，毛殼菌科.子囊殼表生，球形，壁初期半透明，成熟時扁球形或長圓形，壁暗色，膜質(zhì)，頂有孔口，四周有毛；子囊有柄，棍棒形，壁薄，成熟時融化，含孢子8個，也有4個的；子囊孢子單細(xì)胞，欖褐色，常呈檸檬形，先釋入子囊殼腔中，后成團(tuán)從孔口擠出.

曲霉屬 (Aspergillussp.)：半知菌類，叢梗孢目，叢梗孢科單孢亞科，曲霉族.菌絲發(fā)育良好，分生孢子成串，聚生呈頭狀；分生孢子梗頂端膨大，基部有厚膜足細(xì)胞.

盧東升等[15]還對鐵皮石斛的根圍真菌做了鑒定，但根圍真菌并不一定會和鐵皮石斛形成共生關(guān)系，所以未列出.其實(shí)，比較不同研究中的內(nèi)生真菌的分離結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)其所分離到的真菌種類并不完全統(tǒng)一，甚至有較大差異.這可能與所采鐵皮石斛樣品周圍的環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件有關(guān).

4共生菌對鐵皮石斛生長的影響及影響機(jī)制

4.1　共生菌對鐵皮石斛生長的影響

從目前的研究看，共生菌對鐵皮石斛的影響是多方面的，多表現(xiàn)為促進(jìn)作用.根據(jù)金輝等[16，17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，共生菌能顯著提高石斛的鮮重，并且促進(jìn)其對礦質(zhì)元素的吸收.陳小霞等[18]通過在鐵皮石斛圓球莖固體培養(yǎng)后期加入真菌的方法，證明真菌對圓球莖的生長和生物堿含量都有正影響.陳瑞蕊等[19]的研究也表明：有的共生真菌能使鐵皮石斛的株數(shù)增多，株高增加，落葉減少等.郭順星等[12，20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明了真菌對鐵皮石斛種子萌發(fā)的促進(jìn)作用.但是，也有人指出蘭科植物在種子萌發(fā)階段的共生真菌和幼苗生長時期的共生真菌有所不同，在后期與植物生長有關(guān)的共生菌類也可能會阻礙種子的萌發(fā)[21].

除了共生真菌菌絲體之外，還有實(shí)驗(yàn)表明：內(nèi)生真菌的代謝物也能提高鐵皮石斛圓球莖的生長率[22].

4.2　影響機(jī)制

菌根的主要功能是增強(qiáng)植物對養(yǎng)分的吸收能力.在植物周圍養(yǎng)分缺乏時，菌根所產(chǎn)生的菌絲超出植物根的范圍吸收養(yǎng)分，增大了根的吸收面積，并把遠(yuǎn)距離的養(yǎng)分運(yùn)送到根的皮層，再通過菌絲釋放到寄主細(xì)胞中[23].當(dāng)蘭科菌根真菌形成優(yōu)勢菌后，能拮抗其他病原菌侵入蘭根，大大降低了植物染病的幾率，從而提高了成活率[8].

邢小科等[24]觀察到當(dāng)菌絲進(jìn)入根的細(xì)胞質(zhì)后，部分菌絲細(xì)胞壁被降解，細(xì)胞內(nèi)含物得以釋放，有些細(xì)胞中菌絲已被消化吸收.這說明真菌產(chǎn)生的代謝物可能具有調(diào)節(jié)植物生長的作用.已有實(shí)驗(yàn)從石斛小菇的發(fā)酵液中檢測到玉米素(Z)及玉米素核苷(ZR)，它能促進(jìn)細(xì)胞的分裂分化[25，26].同樣，蘭小菇的乙酸乙酯提取物也能提高鐵皮石斛圓球莖的增殖率[21].

由于蘭科植物的種子小，儲存養(yǎng)分少，不能完全滿足其萌發(fā)的需要.這一階段真菌侵入蘭花種子后,把胚和基質(zhì)連接起來,形成一個共生系統(tǒng),真菌從外界獲取養(yǎng)分，以滿足種子萌發(fā)的需要.此系統(tǒng)起著傳遞營養(yǎng)的重要作用，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)[27，28].

5存在的問題及展望

真菌的發(fā)酵液也能對石斛的生長產(chǎn)生影響,利用特定內(nèi)生菌制成伴菌劑，混合于組培苗栽培基質(zhì)中，形成有內(nèi)生菌的移栽環(huán)境.同時，石斛共生菌能提高植物拮抗不良環(huán)境的能力，能治療特定病癥，促進(jìn)生長，從而提高移栽成活率和保證苗的健康生長.

生活在植物體這一特殊進(jìn)化環(huán)境中的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的具有生理活性的代謝產(chǎn)物.于能江等從金釵石斛(Dendrobiumnobile.Lindl.) 的根中分離出來的頭孢霉屬(Cephalosporium.Cost.)真菌，并從其菌絲體和發(fā)酵液中分離出虎珀酸、3-異丙基-6-異丁基-2, 5哌嗪二酮、硫酸膽堿、麥角甾醇、吡啶-3-羧酸和鞘安醇等多種化學(xué)成分.這些物質(zhì)被證明具有心血管方面的藥理活性.可見，內(nèi)生真菌與宿主在共生的過程中可能會發(fā)生基因的漂移，使內(nèi)生真菌帶上植物的功能基因，而使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物[29].因此可以通過分離鐵皮石斛的內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)，再從內(nèi)生真菌發(fā)酵液中提取石斛活性物質(zhì).同時，對這些內(nèi)生真菌進(jìn)行改造培養(yǎng)之后，還能使目的產(chǎn)物的量大大增加，降低生產(chǎn)成本.但內(nèi)生真菌與宿主之間基因漂移機(jī)理還需要進(jìn)一步研究.

目前已經(jīng)證實(shí)有4個鐵皮石斛共生菌株被接種到其組織培養(yǎng)基中，組培苗的平均鮮重增長率、營養(yǎng)元素、葉綠素和內(nèi)源激素都比對照要高[30]，說明內(nèi)生菌接種促進(jìn)了組培苗的快速生長和繁殖.但實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果在實(shí)際生產(chǎn)中有何運(yùn)用效果，需要進(jìn)一步做田間試驗(yàn).因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室是一個相對穩(wěn)定的環(huán)境，真菌與石斛的共生關(guān)系不受外界環(huán)境的干擾，但這并不能代表該種真菌在自然環(huán)境中就能與鐵皮石斛形成穩(wěn)定的共生聯(lián)合體.因?yàn)榄h(huán)境中除了該種共生真菌之外還有其他菌類，在其他菌類以及各種不穩(wěn)定的環(huán)境因素的干擾下，所獲得真菌是否能與鐵皮石斛穩(wěn)定共生，這一點(diǎn)有待進(jìn)一步的研究.

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(責(zé)任編輯穆剛)

Research progress in Dendrobium candidum mycorrhiza

XIE Jirong, CHEN Yuan

(Department of Life Science and Technology, Chongqing University of Arts and Sciences, Yongchuan Chongqing 402168, China)

Abstract：Dendrobium candidum is one of the rare Chinese herbals which are in danger because of the over picking. Nowadays the technology of artificial propagation is mature, but it’s hard to be alive after transplanting from the aseptic environment. Almost all the orchidaceae and endophytic fungi are symbiotic relationship, which plays an important role in the process of orchidaceae growing. Knowing more about the symbiotic relationship and the endophytic fungi species is better for the survival of transplanting. The paper reviewed the species and their characteristic of endophytic fungi on Dendrobium, and expounded effect of endophytic fungi on the growth and its mechanism of Dendrobium.

Key words：Dendrobium candidum; mycorrhiza; symbiotic fungi; research progress

[中圖分類號]S567

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1673-8004(2015)05-0099-04

[作者簡介]謝吉容(1966-)，女，重慶永川人，博士，教授，主要從事植物種質(zhì)資源和品種選育方面的研究.

[基金項(xiàng)目]重慶市科委自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(CSTC2008BB1205).

[收稿日期]2014-10-22