李德增+陳波

摘要：介紹了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，并以此為背景圍繞著如何突破衍射極限提高分辨率這一核心問題，通過衍射極限產(chǎn)生的原因、突破的途徑及新型顯微技術(shù)發(fā)展的歷程及特點(diǎn)等幾個(gè)方面展開闡述，以期更好地認(rèn)識新型光學(xué)顯微技術(shù)在探索納米世界時(shí)的作用和意義。

關(guān)鍵詞：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；衍射極限；瑞利判據(jù)；超分辨率；熒光顯微技術(shù)

文章編號：1005–6629（2015）1–0012–05 中圖分類號：G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

1 引言

2014年10月8日，2014年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)揭曉，美國科學(xué)家埃里克·白茲格（Eric Betzig）、威廉姆·艾斯科·莫爾納爾（William E. Moerner）和德國科學(xué)家斯特凡·W·赫爾（Stefan W. Hell）三人獲獎(jiǎng)，以表彰他們在超分辨率熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域取得的成就。

長期以來，光學(xué)顯微鏡的分辨率被認(rèn)為是有極限的，它不可能超過二分之一個(gè)光波長度，對于可見光波長而言，約200納米。1873年德國物理學(xué)家阿貝（E. Abbe）指出衍射極限是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡存在最大分辨率的物理限制。然而，在熒光分子的幫助下，今年諾貝爾獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng)的幾位獲得者巧妙地繞開了這種限制，并突破了這一極限。他們劃時(shí)代的貢獻(xiàn)將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡技術(shù)帶進(jìn)了納米領(lǐng)域，使光學(xué)顯微鏡步入了納米時(shí)代。

根據(jù)納米熒光顯微技術(shù)，科學(xué)家實(shí)現(xiàn)了活體細(xì)胞中單個(gè)分子通路的可視化。他們能夠觀察到分子是如何在大腦神經(jīng)細(xì)胞之間生成神經(jīng)突觸；還可以追蹤帕金森病、阿爾茲海默癥和亨廷頓癥患者體內(nèi)相關(guān)蛋白的累積情況等等。然而科學(xué)家在最小分子水平上對活體細(xì)胞細(xì)節(jié)進(jìn)行研究時(shí)，卻受到了限制。由于今年三位諾獎(jiǎng)得主的貢獻(xiàn)，我們可以利用突破衍射極限的光學(xué)顯微鏡對納米世界一探究竟。

這次獲獎(jiǎng)的是兩項(xiàng)獨(dú)立的技術(shù)。第一項(xiàng)是Stefan Hell于2000年研制的受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)采用了兩束激光。一束負(fù)責(zé)激發(fā)熒光分子使其發(fā)光，另一束則負(fù)責(zé)抵消大部分熒光，只留下一塊納米大小體積的熒光區(qū)域。用該技術(shù)仔細(xì)掃描樣本，得出的圖像分辨率打破了Abbe提出的顯微分辨率極限。Eric Betzig和William Moerner分別獨(dú)立地進(jìn)行研究，為第二種技術(shù)即單分子顯微技術(shù)打下了基礎(chǔ)。這種方法依賴于開關(guān)單個(gè)分子熒光的可能性?？茖W(xué)家對同一區(qū)域進(jìn)行了多次“繪圖”，每次僅僅讓很少量的分散分子發(fā)光。將這些圖像疊加起來產(chǎn)生了密集的納米尺寸超分辨率圖像。2006年，Eric Betzig首次采用了這一技術(shù)[1]。

今天，超分辨納米顯微技術(shù)已被世界廣泛采用，新知識源源不斷地產(chǎn)生，造福著人類。利用超高分辨率顯微鏡，可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究，如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子與細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平上進(jìn)行表達(dá)及編碼，對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。

本文圍繞著如何突破分辨率極限這一核心問題，通過分辨率極限產(chǎn)生的原因、突破的途徑及新型顯微技術(shù)發(fā)展的歷程及特點(diǎn)等幾個(gè)方面展開闡述，以期更好地理解新型光學(xué)顯微技術(shù)在探索納米世界時(shí)的作用和意義。

2 衍射極限與瑞利判據(jù)

傳統(tǒng)（透鏡式、傳輸光）光學(xué)顯微鏡的有效放大倍率是有限的，它取決于成像的衍射極限。光在傳播過程中，遇到障礙物或小孔時(shí)，光將偏離直線傳播的途徑而繞到障礙物后面?zhèn)鞑?，即光的衍射現(xiàn)象。衍射效應(yīng)使障礙物后空間的光強(qiáng)重新分布，使得一切幾何影界失去了明銳的邊緣。衍射極限是指一個(gè)理想物點(diǎn)經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)成像，由于衍射的限制，系統(tǒng)所成的像不再是理想的幾何點(diǎn)像，而是得到形成明暗相間的衍射圖樣（夫朗和費(fèi)衍射像）。許多成像光學(xué)儀器就是一個(gè)低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息，透鏡口徑限制了高頻信息通過，只許一定的低頻通過，因此，丟失了高頻信息的光束再合成，圖像的細(xì)節(jié)變模糊。這是顯微鏡分辨率受到限制的根本原因。因?yàn)橐话愎鈱W(xué)系統(tǒng)的口徑都是圓形，大約有84%的光能量集中在中央亮斑，即愛里斑（Airydisk）（圖1a），這樣每個(gè)物點(diǎn)的像就是一個(gè)彌散斑。當(dāng)兩個(gè)物點(diǎn)過于靠近，其彌散斑重疊在一起，就可能分辨不出是兩個(gè)物點(diǎn)的像，這樣就限制了系統(tǒng)的分辨率，這個(gè)斑越大，分辨率越低。這個(gè)限制是物理光學(xué)的限制，是光的衍射造成的，即光學(xué)系統(tǒng)中存在著一個(gè)分辨極限。

Abbe用衍射理論預(yù)言了分辨率極限的存在[2]，這個(gè)分辨極限通常采用瑞利（Rayleigh）提出的判據(jù)[3]：當(dāng)一個(gè)愛里斑的中心與另一個(gè)愛里斑的第一級暗環(huán)重合時(shí)，兩個(gè)愛里斑像就可分辨或恰可分辨，如圖1b所示。如果兩個(gè)愛里斑的中心間距小于愛里斑的半徑（圖1c），兩個(gè)愛里斑像就不能分辨。對于顯微鏡物鏡，錐形光束聚焦的焦斑最小可分辨尺度設(shè)為CD，則：

3 突破衍射極限

阿貝推導(dǎo)的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像中的衍射極限，與海森伯不確定性原理同為物理學(xué)中的兩大著名的物理極限定理。用海森伯原理可說明光子發(fā)射不確定性，因而也可說明限制傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨極限的關(guān)鍵所在和突破光學(xué)顯微鏡分辨極限所要求的條件。

4 打破衍射極限：近場光學(xué)顯微技術(shù)

當(dāng)光源照射到物體表面時(shí)，在物體表面的場分布可劃分為兩個(gè)區(qū)域：一部分是從近場區(qū)域至無窮遠(yuǎn)稱為遠(yuǎn)場；另一部分是物體表面小于一個(gè)波長（或λ/2）尺度范圍內(nèi)的區(qū)域，稱為近場。近場光學(xué)之所以能突破衍射極限成像，其核心問題是依賴于對隱失波的探測，這是實(shí)現(xiàn)超分辨成像的關(guān)鍵。其原理是采用亞波長尺度的探針在距離樣品表面幾個(gè)納米的近場范圍進(jìn)行掃描而將隱失場轉(zhuǎn)換成忠實(shí)地復(fù)制隱失場局域的劇烈變化的傳播場，并導(dǎo)向合適的遠(yuǎn)端探測器進(jìn)行分析。近場光學(xué)顯微鏡（NOM）可粗分為兩大類型：掃描近場光學(xué)顯微鏡（SNOM）和光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）。基于近場光學(xué)技術(shù)的光學(xué)分辨率可以達(dá)到納米量級，這將為科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，尤其是納米科技的發(fā)展提供有力的操作、測量方法和儀器系統(tǒng)。

1928年，英國的辛格（Synge EH）[5]和1956年奧·基夫（Okeefe JA）先后獨(dú)自提出了概念設(shè)計(jì)。60年代，工作在微波區(qū)域的近場顯微鏡，由E. A. Ash和G. Nichols研制成功，在人類歷史上第一個(gè)制成了突破衍射極限的顯微鏡。1982年，瑞士蘇黎世IBM的G. Binning和H. Rohrer等[6]發(fā)明的掃描隧道顯微鏡（STM），在被應(yīng)用到光學(xué)領(lǐng)域時(shí)，極大推動(dòng)了近場光學(xué)顯微鏡的誕生和發(fā)展。1984年，瑞士蘇黎世IBM的D. W. Pohl等人[7]利用微孔徑作為微探針制成第一臺掃描近場光學(xué)顯微鏡，首次實(shí)現(xiàn)了可見光波段顯微鏡分辨極限的突破。1986年，美國康奈爾大學(xué)的E. Betzig等[8]制成改進(jìn)的近場光學(xué)顯微鏡。1989年R. C. Reddick等人[9]研制成了另一類突破分辨率衍射極限的光學(xué)顯微鏡——光子掃描隧道顯微鏡（PSTM）。1991年，E. Betzig等人[10]對近場掃描光學(xué)顯微鏡進(jìn)行重大技術(shù)改進(jìn)。隨后，各種各樣的近場光學(xué)顯微鏡逐漸走向成功，開始應(yīng)用于表面超精細(xì)結(jié)構(gòu)的光學(xué)現(xiàn)象觀測校樣[11]。

5 繞開衍射極限：超分辨率熒光顯微技術(shù)

近場光學(xué)顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)了衍射極限的突破，但由于其制備工藝及觀察活細(xì)胞和細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化過程中的限制，探索既具有亞微米甚至納米尺度的光學(xué)分辨本領(lǐng)，又可以連續(xù)監(jiān)測生物大分子和細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)的演化，而并不影響生物體系的生物活性和新型超分辨顯微技術(shù)顯得尤為重要。近年來，隨著新型熒光分子探針的出現(xiàn)和成像方法的改進(jìn)，可以在活細(xì)胞上看到納米尺度的蛋白質(zhì)。這些技術(shù)上的進(jìn)步勢必極大地推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展。

本年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)即是對兩項(xiàng)獨(dú)立的超分辨率熒光顯微技術(shù)的肯定。在這里首先介紹單分子顯微技術(shù)。通過確定單個(gè)熒光分子位置的精度的提高，可以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級[12]。在此基礎(chǔ)上，人們開始測量一些熒光標(biāo)記生物分子的納米級定位和運(yùn)動(dòng)。1981年，Barak和Webb[13]首先將單分子跟蹤技術(shù)引入到生命科學(xué)中，在成纖維細(xì)胞上跟蹤了一個(gè)熒光標(biāo)記的低密度脂蛋白受體的動(dòng)力學(xué)過程。2006年Eric Betzig[14]提出了光激活定位顯微技術(shù)（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）的概念。應(yīng)用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這種熒光蛋白的發(fā)光特性，突破了光學(xué)分辨率的極限。如圖6所示，（A，A′）為未激活任何感光熒光蛋白分子（PA-FP）時(shí)；（B，B′）為用405nm的激光激活了4個(gè)熒光分子；（C，C′）為用488nm的激光觀察一段時(shí)間后漂白了第一輪激活的4個(gè)熒光分子；（D，D′）為第二輪重新激活的另外的幾個(gè)熒光分子；（E，E′）為兩輪激活的熒光分子總和組成的圖像；（F，F(xiàn)′）為E圖的局部放大。PALM顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達(dá)到1nm的數(shù)量級。2006年美國霍華德-休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇[15]實(shí)驗(yàn)組開發(fā)出來一種類似于PALM的方法：隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM），推進(jìn)了此領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

盡管單分子的定位精度可以達(dá)到納米級，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個(gè)或者多個(gè)點(diǎn)光源時(shí)的分辨率。不管是PALM還是STORM的超分辨率成像方法，其點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（Point-spread Function，PSF）成像仍然與傳統(tǒng)顯微成像一致。相對近場光學(xué)顯微技術(shù)來說，是一種繞過衍射極限的超分辨方法。

2000年，德國科學(xué)家Stefan Hell[16，17]開發(fā)了另一種超高分辨率顯微技術(shù)，其基本原理是通過物理過程來減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高寬來提高分辨率。當(dāng)特定的熒光分子被比激發(fā)波長更長的激光照射時(shí)，可以被強(qiáng)行猝滅回到基準(zhǔn)態(tài)[18]。利用這個(gè)特性，Hell等開發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（Stimulated Emission Depletion，STED）。其基本的實(shí)驗(yàn)過程如圖7所示，紫色代表的是激發(fā)激光，黃色代表的是用來受激發(fā)射損耗的激光，兩束激光經(jīng)過時(shí)間空間調(diào)制后同時(shí)照射在樣本上。由圖中可以看出，激發(fā)光光斑（紫色）經(jīng)STED激光（黃色）的調(diào)制后極大地減少了激發(fā)的熒光分子的光斑大?。ňG色），其半高寬可以達(dá)到66nm，運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行樣品觀察探測，即可得出突破衍射極限的超分辨率圖像。

6 結(jié)語

人們對于未知世界的探索是無止境的。起初，人類關(guān)于周圍世界的觀念局限在用肉眼，或者靠手持透鏡幫助肉眼所看到的東西。然后，人類的認(rèn)識并不局限于此，有太多未知世界的奧秘激勵(lì)著人們?nèi)ヌ角?，四季輪回，斗轉(zhuǎn)星移，對人類來說，都是那么神秘。當(dāng)伽利略于幾百年前第一次把自制的望遠(yuǎn)鏡對向浩瀚的太空，他的腦海里一定滿是震驚，一個(gè)新的世界展現(xiàn)在他的視野里，也把人類的目光延伸到了數(shù)以光年計(jì)的宏觀領(lǐng)域。而同時(shí)人類也把目光投向了另一個(gè)未知的世界，一個(gè)尺寸小于人眼所能辨別的領(lǐng)域——微觀領(lǐng)域。這要?dú)w功于另一個(gè)偉大的發(fā)明——顯微鏡——它同樣在人類的視野里展現(xiàn)了一個(gè)全新的世界，第一次看到了數(shù)以百計(jì)的“新的”微小動(dòng)物和植物，以及從人體到植物纖維等各種東西的內(nèi)部構(gòu)造，至今仍令人著迷。后來，慢慢地發(fā)現(xiàn)通過普通的光學(xué)顯微鏡所能分辨的尺寸有著一個(gè)極限，無論如何設(shè)計(jì)這個(gè)極限都是無法逾越的。這時(shí)，阿貝給出了極限存在的科學(xué)解釋，瑞利給出了判據(jù)，并進(jìn)而激發(fā)了人們?nèi)ネ黄七@個(gè)極限。分辨率有著質(zhì)的飛躍的是用電子和離子作信息載體的顯微鏡，如掃描電子顯微鏡、掃描隧道顯微鏡和場離子顯微鏡等。雖然分辨率在提高，但卻未真正地突破衍射極限。直到充分認(rèn)識到近場隱失波的物理意義，并制備出近場顯微鏡，才真正地突破了衍射極限。隨之，各種各樣的近場顯微技術(shù)出現(xiàn)并探索著納米尺度的微小世界。而在認(rèn)識生命相關(guān)的生物動(dòng)態(tài)變化過程中，激發(fā)人們?nèi)で笠环N兼具微尺度要求及生物活性的新的顯微技術(shù)。超分辨率顯微鏡成像技術(shù)的出現(xiàn)、應(yīng)用和進(jìn)一步完善，將使得科學(xué)家實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察生物有機(jī)體內(nèi)的生化反應(yīng)過程成為現(xiàn)實(shí)，為深刻認(rèn)識復(fù)雜生命現(xiàn)象的本質(zhì)打開了一扇窗。人類探索的步伐定會繼續(xù)進(jìn)行下去，在更微觀的世界里去更好地認(rèn)識事物的本質(zhì)、變化規(guī)律及作用機(jī)制，進(jìn)而根據(jù)認(rèn)識的規(guī)律去設(shè)計(jì)特殊功能的納米體系，為人類的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。

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