丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化過程中CTGF及Par-3的干預(yù)作用

趙任杰 吳丹彤 李 均 姚 蘭

(1 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都，610083； 2 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),珠海，519000)

丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化過程中CTGF及Par-3的干預(yù)作用

趙任杰1吳丹彤2李 均2姚 蘭2

(1 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎內(nèi)科，成都，610083； 2 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),珠海，519000)

目的：觀察丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對腎纖維化中CTGF及Par-3表達(dá)的影響。方法：采用50只雄性SPF級SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常組、造模組、丹酚酸A組、丹酚酸B組及丹酚酸A+B組。除正常組外，其余大鼠均造成UUO模型。各組予相應(yīng)藥物治療2周，腹主動脈采血檢測大鼠Cr、BUN；免疫熒光觀察大鼠腎組織CTGF、Par-3表達(dá)情況。結(jié)果：1)腎功能檢測：模型組大鼠血清Cr，BUN水平顯著高于正常組(P<0.05)。丹酚酸A組大鼠血清Cr水平明顯低于模型組(P<0.05)；丹酚酸A組和丹酚酸B組大鼠血清BUN水平明顯低于模型組(P<0.05)；各治療組間比較，血清Cr和BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2)CTGF免疫熒光檢測：和正常組相比，模型組大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(+++)；經(jīng)丹酚酸A、B及組分配伍治療后，CTGF熒光強(qiáng)度較模型組明顯減弱，其中以丹酚酸A+B組減弱較為明顯(±)，丹酚酸B組次之(+)。3)Par-3免疫熒光檢測結(jié)果：模型組大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目比正常組明顯減少，熒光強(qiáng)度明顯減弱(±)；經(jīng)丹酚酸A、B及組分配伍治療后，丹酚酸A、B、A+B組Par-3熒光強(qiáng)度較模型組明顯增強(qiáng)，其中以丹酚酸A+B組增強(qiáng)較為明顯(+++)，丹酚酸B組次之(++)。結(jié)論：經(jīng)丹酚酸A、B及其分子藥對配伍治療后，可一定程度改善大鼠腎功能，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹酚酸組分配伍組能顯著抑制大鼠腎組織CTGF的表達(dá)、促進(jìn)Par-3的表達(dá)，其效果優(yōu)于丹酚酸A和丹酚酸B組。該機(jī)制可能與其促進(jìn)Par-3在UUO大鼠腎組織中的表達(dá)和減少CTGF的表達(dá)有關(guān)。

腎纖維化；丹酚酸A；丹酚酸B；CTGF；Par-3

腎間質(zhì)纖維化是各類慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同通路，其發(fā)生、發(fā)展和多種細(xì)胞因子密切相關(guān)[1]。結(jié)締組織生長因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)對成纖維細(xì)胞具有趨化、促有絲分裂及分化等作用。大量研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CTGF與包括血管、心臟[2]、腎臟[3-4]、胰腺[5]、肺[6]及肝臟[7]等許多組織器官纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CTGF被認(rèn)為是TGF-β1的直接下游效應(yīng)遞質(zhì)[8]，主要在瘢痕形成、損傷修復(fù)與病理狀態(tài)下纖維化的形成方面起作用。細(xì)胞極性蛋白-3(Polarity complex protein-3，Par-3)是Par復(fù)合物的一種核心蛋白，在維持細(xì)胞間緊密鏈接、上皮細(xì)胞極性及足細(xì)胞形態(tài)上有重要作用[9-11]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高表達(dá)Par-3可部分減輕腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)的程度。因此，通過干預(yù)CTGF及Par-3的表達(dá)有可能成為治療腎纖維化疾病一個新的靶點(diǎn)。

本課題采用體內(nèi)單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)模型，觀察臨床常用防治腎纖維化的藥物丹參水溶性成分(丹酚酸A、丹酚酸B及其分子藥對配伍)對UUO模型CTGF和Par-3表達(dá)的影響，國內(nèi)外未見臨床報道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠50只(購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(粵)2008-0002，合格證號NO.440072000)，鼠齡7～8周，體重220～250 g。飼養(yǎng)于SPF級動物房，自由飲水，日常光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，無不良反應(yīng)即進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丹酚酸A、丹酚酸B購買自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,有效組分純度均為98%,(批號分別為120821、120910)。兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(Abcam：產(chǎn)品編號ab6692)；兔抗大鼠Par-3多克隆抗體(Santa cruz：產(chǎn)品編號sc-5598)；熒光二抗—山羊抗兔IgG-FITC(中杉金橋：產(chǎn)品編號ZF-0311)；肌酐(Cr)檢測試劑盒(Roche：產(chǎn)品編號62154001)；尿素氮(BUN)檢測試劑盒(Roche：產(chǎn)品編號62098501)；DAPI工作液(Roche：產(chǎn)品編號NO.10236276001)。

1.1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡(DMIRB，DIC)，Leica，Germany；-80 ℃低溫冰柜，F(xiàn)orma Scientic,Germany。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 50只清潔級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對照組(n=10)和造模型組(n=40)。正常對照組給予自由進(jìn)食和飲水，造模組按文獻(xiàn)方法制備單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型[12]：以3%戊巴比妥鈉，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后用橡皮筋固定大鼠，使其呈俯臥位，剃去右背部毛發(fā)，暴露皮膚，用碘伏消毒其擬行手術(shù)切口位置及周圍約5 cm左右，共3遍，鋪無菌手術(shù)洞巾。在距脊柱約1～1.5 cm處做長約1～1.5 cm的縱行切口，逐層剝離皮下組織，鈍性剝離肌肉，打開腹膜，暴露出腎盂及右輸尿管，玻璃分針分離輸尿管，先于近腎門處結(jié)扎輸尿管，再于遠(yuǎn)離腎門處結(jié)扎輸尿管，最后在兩結(jié)扎線之間離斷輸尿管，術(shù)中避免損傷腎臟及臨近組織或器官，而后逐層縫合，關(guān)閉腹腔，碘伏消毒皮膚切口，無菌敷料覆蓋包扎。造模后隨機(jī)分為4組，第2天開始灌胃，連續(xù)14 d：UUO模型組(n=10)，每天按2 mL/200 g予生理鹽水灌胃；丹酚酸A組(n=10)，丹酚酸A溶液12.5 mg/kg·d灌胃；丹酚酸B組(n=10)，丹酚酸B溶液12.5 mg/kg·d灌胃；丹酚酸A+B組(n=10)，丹酚酸A及丹酚酸B各6.25 mg/kg·d灌胃。正常組(n=10)，每天按2 mL/200 g予生理鹽水灌胃。

1.2.2 觀察指標(biāo)及方法 1)大鼠腎功能測定：大鼠用藥后2周，腹主動脈采血，通過149全自動生化分析儀檢測大鼠血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。2)免疫熒光檢測CTGF、Par-3：麻醉狀態(tài)下取出結(jié)扎側(cè)腎臟，制備腎組織切片。將切片置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃干燥60 min，予以常規(guī)脫蠟至水；抗原修復(fù)完后，予PBS洗3次，每次3 min；滴加山羊血清封閉液，置于37 ℃下孵育10 min，甩干后加入CTGF多克隆抗體(1∶100)或PAR3多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜；在室溫中復(fù)溫45 min，予PBS洗3次，5 min/次，再滴加按比例稀釋的含F(xiàn)ITC標(biāo)示的熒光二抗(1∶80)，遮光，60 min，然后再用PBS洗3次，5 min/次；滴加DAPI工作液，37 ℃復(fù)染10 min，PBS充分洗滌；免疫熒光專用封片劑封片，熒光顯微鏡觀察采圖。同時用PBS作陰性對照，其他操作程序同上。3)CTGF、Par-3結(jié)果判定：采用目前通用的5級分法，即(±～++++)級：(±)級：低倍鏡下熒光信號不能被查見，高倍鏡下似乎可見；(+)級：低倍鏡下模糊可見熒光信號而高倍鏡下可顯見；(++)級：低倍鏡下熒光信號顯見，高倍鏡下清晰顯見熒光信號；(+++)級：低倍鏡下熒光信號清楚顯見，高倍鏡下炫目；(++++)級：高倍鏡下熒光信號刺眼。

2 結(jié)果

2.1 丹酚酸A、B及其分子配伍對UUO大鼠腎功能的影響 如表1所示：UUO組大鼠血清Cr和BUN水平均比正常組明顯上升(P<0.05)，說明造模后大鼠腎功能受損。與模型組比較，丹酚酸A組可明顯降低大鼠血清Cr水平(P<0.05)，余治療組大鼠血清Cr水平均呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明丹酚酸A、B可在一定程度上改善UUO大鼠的腎功能；與模型組比較，丹酚酸A組和丹酚酸B組可明顯降低大鼠血清BUN水平(P<0.05)，余治療組血清BUN水平呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠腎功能的檢測結(jié)果±s)

注:用*表示與正常組比較，P<0.05；△表示與模型組比較,P<0.05。

2.2 丹酚酸A、B及其分子配伍對UUO大鼠腎組織CTGF、Par-3表達(dá)的影響

2.2.1 CTGF免疫熒光結(jié)果 熒光顯微鏡下察見：CTGF陽性表達(dá)信號呈綠色，在UUO大鼠腎組織表達(dá)部位主要定位于腎小管上皮細(xì)胞。正常組大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞多呈陰性，熒光強(qiáng)度較弱(±)；和正常組相比，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(+++)；經(jīng)丹酚酸A、B及組分配伍治療后，CTGF熒光強(qiáng)度較模型組明顯減弱，其中以丹酚酸A+B組減弱較為明顯(±)，丹酚酸B組次之(+)，丹酚酸A組較模型組熒光略有減弱(++)，詳見圖1-圖5。

2.2.2 Par-3免疫熒光表達(dá)結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察可見：Par-3陽性表達(dá)信號呈綠色，在UUO大鼠腎組織表達(dá)部位主要在腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)。正常組大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞多呈陽性，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)(+++)；模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目比正常組明顯減少,熒光強(qiáng)度明顯減弱(±)；經(jīng)丹酚酸A、B及組分配伍治療后，丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸A+B組Par-3表達(dá)信號較之模型組顯著加強(qiáng)，而以丹酚酸A+B組增強(qiáng)較為明顯(+++)，丹酚酸B組次之(++)，丹酚酸A組熒光略有增強(qiáng)(+)，詳見圖6-圖10。

3 討論

本課題選用臨床抗腎纖維化常用中藥丹參水溶性活性成分中結(jié)構(gòu)相似的丹酚酸A、丹酚酸B組分進(jìn)行分子藥對配伍(1∶1)應(yīng)用，丹酚酸B采用最佳劑量12.5 mg/kg·d給藥[13]，丹酚酸A等劑量代換，丹酚酸A+B均按照1∶1比例配伍給藥(根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定用藥劑量和比例)。

結(jié)締組織生長因子(CTGF)屬于CNN生長因子家族(也稱CCN2)[5]。CTGF被認(rèn)為是一種由TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生的致纖維化蛋白[14]，CTGF在功能上與TGF-β1具有很大的相似性,較之TGF-β1，CTGF的最大特點(diǎn)就是生物學(xué)功能比較單一，主要表現(xiàn)在對纖維化的影響[15]。在CTGF啟動子序列128～162位置上存在著一個重要的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)調(diào)控元件。經(jīng)研究證實(shí)，CTGF可被TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)，并作TGF-β1主要的下游遞質(zhì)介導(dǎo)其促纖維化作用，其在成纖維細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)，與腎纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[16]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，減少CTGF表達(dá)可減輕UUO大鼠模型的腎間質(zhì)纖維化[3]。在慢性間質(zhì)性腎疾病，隨腎間質(zhì)損害程度加重，表達(dá)CTGF mRNA細(xì)胞數(shù)量顯著增多，并隨間質(zhì)纖維化程度加重而增多[17]。在腎纖維化模型中，用CTGF的反義治療可以減輕腎纖維化的反應(yīng)[18]。此外有實(shí)驗(yàn)報道：CTGF在糖尿病腎病的腎纖維化中發(fā)揮重要作用[19-20]。Par-3屬于蛋白酶激活受體(PARs)家族，是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的一個亞家族，是一種極性蛋白[21-23]。研究證實(shí)：在哺乳動物的上皮細(xì)胞，Par-3有兩個亞型(Par3A和Par3B)，它與Par-6、aPKC蛋白共同構(gòu)成蛋白激酶復(fù)合體，參與緊密連接的組成[24]。Par-3不僅是蛋白激酶復(fù)合體的一個核心蛋白，而且也是緊密連接所必需的，起著極其重要的作用。鄰近細(xì)胞間形成的緊密連接是細(xì)胞極性的一個重要體現(xiàn)。腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)被認(rèn)為可致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的不斷積聚，最終導(dǎo)致腎功能的不可逆損害[25-27]。細(xì)胞極性的喪失和連接的破壞是EMT過程中的始動關(guān)鍵環(huán)節(jié)[28]。有研究表明，當(dāng)基因敲除Par-3分子后，將導(dǎo)致細(xì)胞連接松散，細(xì)胞分化改變[29-30]。此外，實(shí)驗(yàn)證實(shí)：通過誘導(dǎo)PAR-3蛋白表達(dá)增加，可發(fā)揮延緩腎纖維化的作用[31]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組CTGF熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，各治療組熒光強(qiáng)度減弱，以丹酚酸A+B組減弱較為明顯；模型組Par-3熒光強(qiáng)度減弱，各治療組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，以丹酚酸A+B組增強(qiáng)較為明顯。說明丹酚酸A、B及其分子藥對可減少CTGF表達(dá)、增多Par-3表達(dá)，且組分配伍效果更明顯。

綜上所述，丹酚酸A、B及其分子藥對配伍對UUO大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減少腎組織CTGF的表達(dá)，促進(jìn)Par-3的表達(dá)，從而影響腎纖維化過程中腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有關(guān)。丹酚酸A、B及其分子藥對可干預(yù)CTGF和Par-3的表達(dá)，且丹酚酸A、B分子藥效果更明顯。

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(2014-12-23收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

Intervention Effect of Salvianolic acid A, B on CTGF and Par-3 Expression in the Process of Renal Fibrosis

Zhao Renjie1, Wu Dantong2, Li Jun2, Yao Lan2

(1ChengDuMilitaryGeneralHospitalDepartmentofNephrology,Chengdu610083,China; 2ZhuhaiCampus,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519000,China)

Objective: To investigate the intervention effect of Salvianolic acid A, B and their component molecules of drug compatibility on expression of CTGF and Par-3 in the process of renal fibrosis. Methods: A total of 50 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups: normal group (n=10), the control group (n=10), salvianolic acid A group (n=10), salvianolic acid B group (n=10) and salvianolic acid A and B group (n=10). All rats were made into unilateral ureteral obstruction (UUO) model except the normal group. After two weeks of treatment, we took blood sample from abdominal aorta and examined Cr and BUN levels; and observed CTGF, Par-3 protein expression in kidney tissue by immunofluorescence. Results: 1)Results of renal function test: model group's serum Cr level was significantly higher than the normal group (P<0.05); the Sal A group's serum Cr level was obviously lower than the model group (P<0.05); the serum BUN levels in the Sal group A and group B significantly lower than the model group; among the treatment groups, serum Cr and BUN levels showed no significant difference (P> 0.05). 2)Results of CTGF immunofluorescence test: the number of rat renal tubular epithelial cells showing positive in model group significantly increased compared to the control group and the fluorescence intensity significantly enhanced (+++); after treatment of Sal A, B, and component compatibility, CTGF fluorescence intensity was reduced compared with the model group , among which the Sal A+B group decreased significantly (±) and followed by the Sal B group (+). 3)Results of Par-3 immunofluorescence test: the number of positive cells in rat renal tubular epithelial cells in the model group was significantly decreased than the normal group and the fluorescence intensity was significantly reduced (±); after treatment of Sal A, B and component compatibility, Par-3 the fluorescence intensity in the Sal A, Sal B, Sal A+B group was significantly enhanced compared with the model group , among which the Sal A+B group enhanced most obviously (+++), and followed by the Sal group B (++). Conclusion: Sal A, B and component compatibility treatment could partly improve rat's renal function, but showed no significant difference. The Sal A+B group could significantly inhibit the expression of CTGF in renal tissue and promote expression of Par-3, and its effect was better than the Sal A group and Sal B group. It may be related to promoting the expression of Par-3 and reducing the expression of CTGF in UUO kidney tissue of rats.

Renal interstitial fibrosis; Salvianolic acid A; Salvianolic acid B; CTGF; Par-3

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目丹酚酸A、B、C分子藥對配伍對腎纖維化過程中PDGF-C/PDGFR-α信號途徑的干預(yù)作用(編號：81260603)

李均(1966.12—)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，博士，主要從事中醫(yī)藥防治慢性腎臟病的研究，E-mail：lijun69-1214

R285.6;R256.5

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10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.024