袁莉剛，閆振龍，陶金忠，劉 英，陳國娟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 ；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3.寧夏大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，銀川 750021)

PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的分布比較

袁莉剛1*，閆振龍2，陶金忠3，劉 英1*，陳國娟1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070 ；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；3.寧夏大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，銀川 750021)

探討PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的表達及在精子發(fā)生中的作用機制。采集性成熟未交配2～3歲成年雙峰駝?wù)２G丸及隱睪，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測PGP9.5和神經(jīng)肽Y在睪丸的定位，并通過圖像分析技術(shù)進行定量分析。結(jié)果表明：PGP9.5在正常睪丸支持細胞、各級生精細胞和動靜脈血管都有高密度陽性反應(yīng)；神經(jīng)肽Y在支持細胞呈中等陽性，各級生精細胞和動靜脈血管呈弱陽性，隱睪組中PGP9.5和神經(jīng)肽Y表達位置相似于正常組，但表達量顯著降低。PGP9.5和神經(jīng)肽Y在正常組和隱睪組Leydig細胞表達無差異，均為強陽性?？梢奝GP9.5及神經(jīng)肽Y參與了雙峰駝?wù)２G丸和隱睪生精功能的調(diào)節(jié)，二者通過支持細胞及管周肌樣細胞對于隱睪生精微環(huán)境的調(diào)控能力降低，但隱睪內(nèi)間質(zhì)細胞的分泌并未受明顯影響。本研究為進一步研究雙峰駝睪丸神經(jīng)遞質(zhì)變化與隱睪癥發(fā)生關(guān)系及調(diào)控機制提供了參考。

雙峰駝；隱睪；PGP9.5；神經(jīng)肽Y；免疫組織化學(xué)

哺乳動物睪丸功能主要受到交感神經(jīng)和局部激素分泌的調(diào)節(jié)。蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product，PGP 9.5)由212個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量27 ku，作為一種泛神經(jīng)標(biāo)記物廣泛表達于神經(jīng)元分化的各個階段，應(yīng)用于器官和組織的發(fā)病機制和診斷研究[1]。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)由36個氨基酸組成，是神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的短肽，具有參與激素分泌，調(diào)節(jié)生長發(fā)育、性行為等生物學(xué)功能[2]。研究表明，神經(jīng)肽Y通過參與調(diào)控下丘腦—促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH) 和垂體促性腺激素(Pituitary-gonadotropin)的釋放，調(diào)節(jié)睪丸生理功能。國內(nèi)外研究顯示，PGP9.5和神經(jīng)肽Y在人、豬、驢、單峰駝等哺乳動物睪丸內(nèi)有顯著分布，在睪丸正常生理功能方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3-6]。哺乳動物下丘腦—垂體—睪丸內(nèi)分泌軸和睪丸組織局部自分泌及旁分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與精子發(fā)生調(diào)控，睪丸受膽堿能神經(jīng)、去甲腎上腺素能神經(jīng)和肽能神經(jīng)支配，神經(jīng)遞質(zhì)水平變化對正常生精過程必不可少，且與不育癥發(fā)生關(guān)系密切[7-8]。雙峰駝為中國遺傳資源保護品種，目前關(guān)于雙峰駝隱睪神經(jīng)調(diào)控未見報道。本研究通過雙峰駝睪丸內(nèi)PGP9.5和神經(jīng)肽Y分布比較正常睪丸與隱睪內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的分布變化，對雙峰駝遺傳資源保護以及從神經(jīng)方面治療隱睪癥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2012年12月，自寧夏回族自治區(qū)吳忠市澇河橋清真牛羊肉批發(fā)市場，采集健康性成熟未交配2～3歲雙峰駝。經(jīng)頸部放血致死后立即采集睪丸組織標(biāo)本，共20例，其中正常睪丸14例，隱睪6例。以4%中性甲醛溶液固定3 d后，制作石蠟切片，常規(guī)染色、觀察。正常組選擇組織結(jié)構(gòu)發(fā)育良好的睪丸；隱睪組選擇結(jié)構(gòu)典型的歸為一組，進一步分別進行免疫組織化學(xué)研究。NPY兔抗鼠多克隆抗體(bs-0071R)和PGP9.5兔抗鼠多克隆抗體(bs-3806R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒(sp-0023，由美國ZYMED公司生產(chǎn))購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)和APES防脫玻片(ZLI-9502)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)SP法進行染色，NPY和PGP9.5兩種多克隆抗體均1∶400稀釋后使用。陰性對照組用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗(NPY和PGP9.5)。用OlympusDP71顯微鏡進行觀察并照相。

1.3 圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，每組切片中隨機選取5張，在400倍和1 000倍顯微鏡下進行拍照，對400倍照片用DP軟件采集5個視野，首先參照A.M.Suburo等[9]采用半定量的形式對染色結(jié)果的分布密度進行描述，-，無陽性表達；+/-，偶有陽性表達；+，陽性表達；++，中等強度陽性表達；+++，強陽性表達；++++，高密度強陽性。然后用Image-Pro Plus6.0軟件進行圖像分析，測定陽性反應(yīng)物的平均光密度，用SAS(1996)統(tǒng)計軟件中GLM模型，以ANOVA方法對數(shù)據(jù)進行分析。若各處理間差異顯著，則用Duncan’s多重比較進行檢驗。結(jié)果用最小二乘法的均值及平均標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪表達的免疫組織化學(xué)染色見圖1、2。

2.1 PGP9.5在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的定位及分布特點

雙峰駝?wù)２G丸組織中PGP9.5肽能神經(jīng)分布廣泛，結(jié)果顯示血管周圍、睪丸間質(zhì)、曲精小管以及周邊均有不同程度分布(圖1a、b、c)。PGP9.5在支持細胞為高密度強陽性，精原細胞為強陽性，初級精母細胞和精子細胞為高密度強陽性，偶有中等陽性，管周肌樣細胞為中等陽性，Leydig細胞為強陽性，間質(zhì)組織中偶有少量PGP9.5中等陽性的神經(jīng)纖維分布。各級動脈血管管壁和其內(nèi)皮細胞以及各級靜脈血管的內(nèi)皮細胞PGP9.5為強陽性(表1)。在 14例正常組睪丸PGP9.5肽能神經(jīng)的免疫組化結(jié)果顯示一致。

隱睪組織中PGP9.5肽能神經(jīng)免疫陽性表達位置與正常組相似(圖1e、f、g)，但在表達程度上低于正常組，組間差異極顯著(圖3，P<0.01)。PGP9.5在隱睪支持細胞和初級精母細胞為強陽性，精原細胞為中等陽性，管周肌樣細胞為陽性。Leydig細胞為中等陽性，間質(zhì)組織中有少量陽性神經(jīng)纖維分布。各級動脈血管和靜脈血管管壁PGP9.5為中等陽性(表1)。 6例隱睪組睪丸內(nèi)PGP9.5肽能神經(jīng)分布結(jié)果顯示一致。

PS.初級精母細胞；←.神經(jīng)纖維；△.Leydig細胞；↑.動脈血管；↓↓.靜脈血管；.肌樣細胞；.精原細胞；◇.支持細胞；?.精子。a、b.正常組，標(biāo)尺20 μm；c.正常組，標(biāo)尺10 μm；d.正常組對照，標(biāo)尺20 μm；e、f.隱睪組，標(biāo)尺20 μm；g.隱睪組，標(biāo)尺10 μm；h.隱睪組對照，標(biāo)尺20 μmPS.Primary spermatocytes;←.Nerve fibers；△.Leydig cells；↑.Arterial wall；↓↓.Vein wall；.Myoid peritubular cells；.Spermatogonia；◇.Sertoli cells；?.Sperm.a，b.The normal Bactrian camel testis，Bar=20 μm；c.The normal Bactrian camel testis，Bar=10 μm；d.The control of the normal Bactrian camel testis，Bar=20 μm；e，f.The cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=20 μm；g.The cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=10 μm；h.The control of the cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=20 μm圖1 PGP9.5在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的分布(免疫組化染色)Fig.1 Expression of PGP 9.5 in the normal and cryptorchidism Bactrian camel testis (immunohistochemical staining)

PS.初級精母細胞；←.神經(jīng)纖維；△.Leydig細胞；↑.動脈血管；↓↓.靜脈血管；.肌樣細胞；.精原細胞；◇.支持細胞；?.精子。a、b.正常組，標(biāo)尺20 μm；c.正常組，標(biāo)尺10 μm；d.正常組對照，標(biāo)尺20 μm；e、f.隱睪組，標(biāo)尺20 μm；g.隱睪組，標(biāo)尺10 μm；h.隱睪組對照，標(biāo)尺20 μmPS.Primary spermatocytes;←.Nerve fibers；△.Leydig cells；↑.Arterial wall；↓↓.Vein wall；.Myoid peritubular cells；.Spermatogonia；◇.Sertoli cells；?.Sperm.a，b.The normal Bactrian camel testis，Bar=20 μm；c.The normal Bactrian camel testis，Bar=10 μm；d.The control of the normal Bactrian camel testis，Bar=20 μm；e，f.The cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=20 μm；g.The cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=10 μm；h.The control of the cryptorchidism Bactrian camel testis，Bar=20 μm圖2 NPY在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的分布(免疫組化染色)Fig.2 Expression of NPY in the normal and cryptorchidism Bactrian camel testis (immunohistochemical staining)

2.2 神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的定位及分布特點

雙峰駝?wù)２G丸組織中神經(jīng)肽Y的表達主要定位在各級動靜脈血管管壁、Leydig細胞和支持細胞(圖2a、b、c)。結(jié)果顯示，神經(jīng)肽Y在支持細胞為強陽性，精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞為中等陽性，精子細胞為中等陽性。管周肌樣細胞呈陽性表達。Leydig細胞為中等陽性，偶有強陽性。各級動靜脈為陽性，靜脈血管陽性表達較動脈血管弱(表1)。14例正常組睪丸內(nèi)神經(jīng)肽Y分布結(jié)果顯示一致。

雙峰駝隱睪組中支持細胞排列散亂，而且無明顯界限(圖2e、f、g)，神經(jīng)肽Y在支持細胞為中等陽性。精原細胞胞膜界限不清楚，為弱陽性表達。管周肌樣細胞偶有陽性表達。Leydig細胞為中等強度表達，間質(zhì)組織中存在少量陽性神經(jīng)纖維。各級動靜脈血管管壁或內(nèi)皮細胞神經(jīng)肽Y為中等強度或陽性，且在毛細血管為陰性表達(表1)。PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝隱睪不同部位分布密度與正常組之間組間差異極顯著(圖3，P<0.01)。6例隱睪組睪丸內(nèi)神經(jīng)肽Y分布結(jié)果顯示一致。

表1 PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝睪丸正常組和隱睪組中不同部位的分布密度

Table 1 The density of PGP9.5 and NPY in different parts of the normal and cryptorchidism of Bactrian camel testis

組別Group支持細胞Sertolicells精原細胞Spermatogonia精子細胞SpermatidLeydig細胞Leydigcells管周肌樣細胞Myoidperitubularcells動脈血管壁Arterialwall靜脈血管壁VeinwallPGP9.5-正常組PGP9.5-Thenormalgroup++++++++++++++++++++++PGP9.5-隱睪組PGP9.5-Thecryptorchidismgroup++++++++++++NPY-正常組NPY-Thenormalgroup++++++++++++NPY-隱睪組NPY-Thecryptorchidismgroup++++++/-+++

標(biāo)有不同字母的組間差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)有相同字母的組間無差異(P>0.05)Different letters mean significant difference between the groups (P<0.01)，the same letters mean no difference between groups (P>0.05)圖3 PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝睪丸正常組和隱睪組中免疫組織化學(xué)表達Fig.3 The Immunohistochemistry expression of PGP9.5 and NPY in the normal and cryptorchidism of Bactrian camel testis

3 討 論

哺乳動物睪丸內(nèi)分布著豐富的神經(jīng)纖維，其主要來自精索上神經(jīng)和精索下神經(jīng)。國內(nèi)外研究顯示諸多哺乳動物的睪丸內(nèi)均有PGP9.5和神經(jīng)肽Y的大量表達，A.Sainsbury等[10]研究發(fā)現(xiàn)PGP9.5在牛生精細胞、精原細胞以及精原母細胞均陽性表達；位蘭等[11]報道雛鴕鳥睪丸精母細胞神經(jīng)肽Y陽性表達,表明PGP9.5和神經(jīng)肽Y可能參與了睪丸生精功能調(diào)節(jié)。睪丸內(nèi)神經(jīng)對精子的發(fā)生有著重要的調(diào)節(jié)作用，S.H.Chow等及龔永光等[12-13]研究表明切除小鼠精索神經(jīng)引起精原細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示在雙峰駝睪丸中PGP9.5和神經(jīng)肽Y在正常組各級生精細胞中表達較強，而在隱睪表達較弱，且組間差異極顯著(表1，P<0.01)，表明PGP9.5及神經(jīng)肽Y參與了雙峰駝?wù)２G丸和隱睪生精功能的調(diào)節(jié)，二者通過支持細胞及管周肌樣細胞對于隱睪生精微環(huán)境的調(diào)控能力降低。

血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)主要由支持細胞的緊密連接，曲細精管的基膜及其間質(zhì)組成，為精子的發(fā)生提供了一種特定的免疫微環(huán)境。血睪屏障的通透性改變可刺激機體產(chǎn)生抗體，進而損害生精上皮，致使睪丸生精功能降低或者丟失[14]。支持細胞是睪丸免疫微環(huán)境的主要參與者，可使攜帶自身特異抗原的生精細胞免受自身免疫系統(tǒng)的攻擊。除此之外，還為生精細胞提供必須的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子以及物理支撐[15]。本研究中PGP9.5與神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)＝M和隱睪組睪丸支持細胞陽性表達，表明肽能神經(jīng)對支持細胞具有調(diào)節(jié)作用。研究表明[16]，摘除犬睪丸交感神經(jīng)后引起曲細精管的退化和間質(zhì)組織增生，進而影響精母細胞分裂和精子產(chǎn)生。隱睪組在支持細胞的表達顯著弱于正常組，提示肽能神經(jīng)對支持細胞的調(diào)控能力減弱，但關(guān)于肽能神經(jīng)分布減弱是否導(dǎo)致支持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，仍需進一步研究。管周肌樣細胞一方面參與構(gòu)成曲細精管的固有膜，另一方面通過分泌收縮素等因子調(diào)節(jié)精子發(fā)生和睪丸的發(fā)育[17]。研究表明，肌樣細胞運輸功能與肽能神經(jīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)[18-19]，其形態(tài)及分泌成分的改變會影響生精小管局部微環(huán)境從而導(dǎo)致男性不育[20]。本研究中PGP9.5和神經(jīng)肽Y在管周肌樣細胞的陽性表達，且正常組顯著高于隱睪組(表1，P<0.01)，表明隱睪內(nèi)PGP9.5和神經(jīng)肽Y通過管周肌樣細胞對微環(huán)境的調(diào)控能力減弱。

睪丸Leydig細胞睪酮的分泌主要受下丘腦—垂體調(diào)控，神經(jīng)肽Y參與調(diào)控下丘腦—GnRH的脈沖釋放，通過旁分泌或者通過釋放多種神經(jīng)肽對Leydig細胞類固醇激素的合成進行調(diào)節(jié)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，精索去神經(jīng)支配或者電刺激精索神經(jīng)均會引起睪酮水平異常[21-22]。本研究PGP9.5和神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)＝M和隱睪組中Leydig細胞均有顯著陽性表達，且無明顯組間差異，表明肽能神經(jīng)對隱睪內(nèi)間質(zhì)細胞的分泌調(diào)控并未明顯改變。

睪丸神經(jīng)遞質(zhì)水平變化與不育癥發(fā)生關(guān)系密切，PGP9.5及神經(jīng)肽Y在雙峰駝?wù)２G丸和隱睪的定位及分布特點比較表明， PGP9.5及神經(jīng)肽Y參與了睪丸生精功能的調(diào)節(jié)，且對隱睪支持細胞及管周肌樣細胞的調(diào)控能力減弱，進而影響睪丸內(nèi)部免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，但是隱睪內(nèi)睪酮的正常分泌并未受影響，本研究為進一步研究雙峰駝隱睪生精細胞發(fā)育微生態(tài)環(huán)境與神經(jīng)調(diào)控機制提供了參考。

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(編輯 白永平)

The Distribution of PGP9.5 and NPY in the Normal Testis and Cryptorchidism of Bactrian Camel

YUAN Li-gang1*，YAN Zhen-long2，TAO Jin-zhong3，LIU Ying1*，CHEN Guo-juan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China； 2.CollegeofLifeScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China； 3.CollegeofVeterinaryMedicine，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China)

The aim of the present study was to investigate the expression of PGP9.5 and NPY in the normal testis and cryptorchidism of Bactrian camel.The cryptorchidism and the normal testis of bactrian camel were studied by immunohistochemical SP technique and IPP (Image-Pro Plus) statistics method.The results showed that the PGP9.5 immunoreactive products distributed strongly in the Sertoli cells，sperm cells，arteries and veins of the normal testis，as well as NPY was moderate positive in Sertoli cell，sperm cells and arteries but weak positive in veins，in addition，Leydig cells in adult camels were strongly immunostained with NPY not only in normal testis but also in cryptorchidism.However，immunoreactivity of PGP9.5 and NPY were detected in cryptorchidism testis with significant differences intensities compared with the normal.These findings suggest that PGP9.5 and NPY are detected in the majority of cells in the seminiferous tubules and the blood vessels are involved in spermatogenesis and secretion of testosterone in Bactrian camel testis，they may play important roles in Bactrian camel male fertility and infertility.

Bactrian camel；cryptorchidism；PGP9.5；NPY；immunohistochemistry

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.018

2014-06-16

國家自然科學(xué)研究基金(31160488)；甘肅省自然科學(xué)基金項目(145RJZA223)；甘肅省教育廳(0902B-03)

袁莉剛(1974-)，女，甘肅隴南人，教授，主要從事動物發(fā)育生物學(xué)研究，Tel：0931-7631229

*通信作者：袁莉剛， E-mail:yuan2918@126.com；劉 英，E-mail：Liuy11@gsau.edu.cn

S852.162

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0366-6964(2015)02-0303-06