周佳民，黃文坤，崔江寬，蘇致衡，彭德良＊

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所，長沙 410125；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

大豆孢囊線蟲病是大豆生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，其病原為土傳的大豆孢囊線蟲（HeteroderaglycinesIchinohe）［1-3］。目前生產(chǎn)上主要是種植抗性品種、與非寄主作物輪作以及應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。這些措施雖具有一定的防治效果，但因品種單一使大豆的抗性喪失及環(huán)境污染等問題受到了很大的限制。因此，充分調(diào)查和挖掘出更多、更有效的新殺線蟲植物將成為未來發(fā)展的方向［4］。

目前，國內(nèi)外已報道的對植物寄生線蟲有活性的植物有40多科近100種［5］，但自然界植物資源極為豐富，許多具有殺線蟲作用的植物還未被發(fā)現(xiàn)，本試驗通過測定8種藥用植物甲醇和無菌水提取液對大豆孢囊線蟲抑殺效果，初步篩選出對大豆孢囊線蟲抑殺具有生物活性的植物，旨在為尋找新型植物源殺線蟲活性物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物及溶劑

供試的8種藥用植物經(jīng)湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱校奇研究員鑒定（表1），所用提取溶劑分別為甲醇及無菌水。

表1 供試植物名錄Table 1 The list of tested plants

1.1.2 供試線蟲

大豆孢囊線蟲從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北廊坊基地大豆種植地的土壤中分離。用漂浮法分離后在解剖鏡下挑取新鮮、飽滿的孢囊，用0.5%的次氯酸鈉處理3 min，再用無菌水沖洗3 次，置于0.5 mmol／L ZnSO4溶液中，在25 ℃恒溫條件下進(jìn)行孵化，得到2 齡幼蟲（J2），收集并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?-7］。

1.2 方法

1.2.1 植物活性成分提取

參照李大婧的超聲波提取法［8］分別采用甲醇和無菌水從植物中提取活性成分。將采集的植物用純凈水洗凈、晾干水分，放入105 ℃電熱鼓風(fēng)箱內(nèi)殺青30min，然后在50℃下烘干，粉碎機粉碎并過40目篩網(wǎng)，得到植物干粉為待測樣品。稱取樣品10.0 g于三角瓶中，分別以甲醇和無菌水為提取溶劑，加入100mL提取溶劑，室溫下超聲波提取30min，浸泡提取48h后，用濾紙過濾提取液，吸取提取液5 mL并用無菌水定容至100mL為室內(nèi)待測液。

1.2.2 毒殺活性測定

將收集到的2齡幼蟲加入無菌水，配制成濃度約為500條／mL 的線蟲懸浮液，吸取1 mL 線蟲懸浮液注入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個樣品孔內(nèi)，再加入待測提取液1 mL，以相應(yīng)的提取液為對照，重復(fù)4次。處理48h，滴加1mol／L 的氫氧化鈉溶液檢查各處理的線蟲死亡情況，線蟲死亡計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考以下的方法，即線蟲呈僵直不動為死蟲，線蟲呈彎曲蠕動狀態(tài)為活蟲［9］。殺線蟲強弱分級按Chandravadana等的方法進(jìn)行［10-11］。具體分級標(biāo)準(zhǔn)為：“-”表示無活性，校正死亡率≤10.0%；“＋”表示弱活性，校正死亡率為10.1%～30.0%，“＋＋”表示中等活性，校正死亡率為30.1%～50.0%；“＋＋＋”表示較強活性，校正死亡率為50.1%～80%；“＋＋＋＋”表示強活性，校正死亡率＞80.0%。

1.2.3 盆栽試驗

室內(nèi)盆栽以每種藥用植物的每種提取液為1個處理，每處理4次重復(fù)。試驗土壤取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所河北廊坊基地大豆孢囊線蟲發(fā)病嚴(yán)重的田塊，裝入盆口直徑27cm，高30cm 的塑料盆內(nèi)，混勻后稱取土樣200g，重復(fù)4次，采用漂浮法收集孢囊，在體視解剖鏡下記錄處理前孢囊的數(shù)量；5月10日，每盆播種10粒，大豆品種為市售‘中黃13’，出苗后定苗5株，在20～35℃條件下培養(yǎng)吸取20mL 各處理的提取液，稀釋到400mL，分別在播種前、苗期以灌根方式施藥2次。分別以甲醇稀釋液400mL和純凈水400mL為對照。

1.2.4 取樣及調(diào)查方法

大豆出苗60d后，測定大豆植株的株高，調(diào)查各種提取液對大豆生長的影響。在大豆開花期，采集大豆植株全部根系及根系周圍的土壤，混勻后稱取土樣200g，采用漂浮法收集孢囊，在體視解剖鏡下記錄孢囊的數(shù)量，重復(fù)4次，統(tǒng)計分析各處理對大豆孢囊線蟲病的防治效果［12］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所測數(shù)據(jù)用DPS軟件和Excel軟件進(jìn)行分析和處理，計算公式如下［12-14］：

死亡率（%）＝（死亡線蟲數(shù)／供試線蟲數(shù)）×100；

校正死亡率（%）＝［（處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率）／（1-對照組線蟲死亡率）］×100；

孢囊減退率（%）＝（施藥前孢囊數(shù)-施藥后孢囊數(shù)）／施藥前孢囊數(shù)×100；

防治效果（%）＝［（防治區(qū)孢囊減退率-對照區(qū)孢囊減退率）／（100-對照區(qū)孢囊減退率）］×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取液對大豆孢囊線蟲活性評價

從表2可見，藥用植物青蒿甲醇和無菌水提取液對大豆孢囊線蟲毒殺能力最強，處理48h線蟲的校正死亡率分別為94.23%和82.15%，薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸、小飛蓬等藥用植物提取液的毒殺活性次之，其甲醇提取液處理48h后，線蟲的校正死亡率分別為76.94%、76.80%、75.00%、76.69%、86.93%、46.15%；無菌水提取液處理48h后，線蟲的校正死亡率分別為63.58%、69.05%、76.23%、63.62%、55.05%、21.16%；卷丹甲醇提取液表現(xiàn)中等的殺蟲能力，處理48h 線蟲的校正死亡率為47.89%，藥用植物小飛蓬無菌水提取液表現(xiàn)出較弱的殺蟲能力，處理48h校正死亡率為21.16%，卷丹無菌水提取液對大豆孢囊線蟲抑殺效果不理想，不表現(xiàn)活性或活性較弱，處理48h 的校正死亡率為2.51%；與卷丹和小飛蓬相比，青蒿、薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸等處理對大豆孢囊線蟲抑殺效果均存在顯著差異。

表2 植物提取液對大豆孢囊線蟲2齡幼蟲活性1）Table 2 Toxicity of plant extracts to Heterodera glycines J2

2.2 不同植物提取液對大豆孢囊線蟲的盆栽防效

通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，植物提取液各處理的土壤中孢囊數(shù)量比對照明顯減少，植物提取液各處理對大豆孢囊線蟲的防治效果，與對照均存在顯著差異；其中，水蓼甲醇提取液與無菌水提取液處理對大豆孢囊線蟲的防治效果均最好，分別為72.37%和57.10%（表3），與除臭椿外其他處理存在顯著差異；另外，同一植物提取液處理中，甲醇提取液處理的防治效果比無菌水提取液的有增高的趨勢，尤其是水蓼和臭椿甲醇提取液對線蟲防治效果都達(dá)到65.79%以上，與其他處理存在顯著差異，具有較好的生防潛力。從表3還可以看出，各處理株高比對照有增高的趨勢但沒有顯著差異。

表3 植物提取液對大豆孢囊線蟲的防病效果Table 3 Control efficacy of plants extracts against Heterodera glycines

3 結(jié)論與討論

大豆孢囊線蟲病是一種土傳病害，減少孢囊在土壤中的積累，抑制孢囊線蟲卵孵化，是防治大豆孢囊線蟲病的有效途徑。我國具有豐富的藥用植物資源，從植物中分離、提純殺線蟲化合物，開發(fā)高效、環(huán)保型的植物源殺線蟲劑防治大豆孢囊線蟲，有很好的現(xiàn)實和生態(tài)意義。本試驗測定了8種藥用植物甲醇和無菌水提取液的殺線蟲活性，結(jié)果表明薄荷、苦楝、臭椿、水蓼、商陸等藥用植物甲醇和無菌水提取液對大豆孢囊線蟲表現(xiàn)出較強的毒殺活性，尤其是藥用植物青蒿的甲醇和無菌水提取液對大豆孢囊線蟲均表現(xiàn)出極強的毒殺活性。前人測定了苦楝提取物對南方根結(jié)線蟲的毒殺活性，結(jié)果表明，苦楝的乙醇提取物有較強的殺線活性［15-16］，Adegbite 等［17］的研究認(rèn)為，楝樹的提取物具有很好的殺線活性，是一種廉價和有效的殺線蟲劑原料，但翁群芳等［18］的研究認(rèn)為，苦楝、青蒿的提取液對南方根結(jié)線蟲的毒殺活性較弱。本研究通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，水蓼、臭椿甲醇提取液對大豆孢囊線蟲病防治效果好，具有較好的生防潛力，豐富了前人的研究結(jié)果。本試驗還表明，各植物提取液處理株高比對照有增高的趨勢但差異不顯著，說明植物提取液對大豆的生長發(fā)育沒有不利影響，為水蓼、臭椿等植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

在本試驗研究中，薄荷、苦楝、水蓼、商陸、小飛蓬、青蒿、卷丹等藥用植物甲醇提取液對大豆孢囊線蟲的毒殺活性均優(yōu)于無菌水提取液，這可能是因為這些藥用植物中的某種功能性成分易溶于有機溶劑［19-21］；本試驗對部分藥用植物提取物的殺線蟲活性進(jìn)行了研究，但起作用的殺線蟲活性物質(zhì)的成分及其作用機理以及對土壤微生物的影響還有待進(jìn)一步研究。

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