李麗敏，王 燕，崔貝貝，林 敏，張 磊，左玉柱，王家鑫

(河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院免疫學實驗室，保定 071000)

肥大細胞對重組口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式識別效應

李麗敏#，王 燕#，崔貝貝，林 敏，張 磊，左玉柱，王家鑫*

(河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院免疫學實驗室，保定 071000)

為研究肥大細胞對重組口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式識別作用，將VP1-VP4蛋白負載經TLR2/TLR4抑制劑、甘露糖受體抑制劑或清道夫受體抑制劑預處理的小鼠肥大細胞系P815，在不同時間點觀察其脫顆?，F象，并用ELISA檢測細胞上清液中TNF-α的含量。結果顯示，清道夫受體抑制劑處理組在負載VP1-VP4蛋白15和30 min時P815細胞脫顆粒數目均極顯著低于重組VP1-VP4蛋白組(P<0.001)。在負載VP1-VP4蛋白24 h時，各抑制劑處理組的TNF-α含量均極顯著低于VP1-VP4蛋白組(P<0.001)，其中以甘露糖受體抑制劑處理組含量最低。這表明小鼠肥大細胞系P815主要通過清道夫受體識別FMDV VP1-VP4并引起脫顆?，F象的發(fā)生，而甘露糖受體和TLR2/TLR4識別FMDV VP1-VP4則是引起P815細胞分泌TNF-α的主要模式識別機制，其中以甘露糖受體的作用最強。

肥大細胞；模式識別受體；重組口蹄疫病毒VP1-VP4；脫顆粒；α-腫瘤壞死因子

肥大細胞起源于造血干細胞前體，遷移至外周組織中發(fā)育成熟，廣泛分布于皮膚和黏膜等部位，與樹突狀細胞、巨噬細胞和NK細胞等共同組成抗感染的第一道防線。該細胞可分泌多種生物活性物質，在炎癥和超敏反應過程中發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現，病原體可刺激肥大細胞脫顆粒釋放組胺、前列腺素、白三烯和細胞因子，從而啟動固有免疫和適應性免疫[1-3]。A.L.St John等用流感病毒血凝素作抗原，以肥大細胞顆粒成分為佐劑制成的疫苗可使受免小鼠抵抗致死劑量的病毒攻擊，為新型疫苗佐劑的篩選研究開辟了新途徑[4]。

肥大細胞表達Toll樣受體 (toll-like receptor，TLR)、NOD樣受體(NOD-like receptor，NLR)、甘露糖受體(mannose receptor，MR)和清道夫受體(scavenger receptor，SR)等模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)。試驗證明，細菌LPS和病毒結構蛋白可被肥大細胞膜表面的TLR2和TLR4識別，導致肥大細胞活化并釋放TNF-α、IL-6、IL-4和IL-13[5-6]。與此相反，機體對金黃色葡萄球菌肽聚糖的細胞免疫應答雖然必須有肥大細胞的參與，但卻既不依賴TLR2和TLR4，也不依賴TNF-α，提示肽聚糖可能被其他PRR識別[7]。應用模式識別受體抑制劑或特異性抗體阻斷以及RNA干擾試驗對鼠源肥大細胞系P815的研究發(fā)現，該細胞可通過TLR2、TLR4、NOD樣受體、蛋白酶活化受體等受體識別鏈球菌、流感病毒和蛋白酶，并引起脫顆?；蚍置赥NF-α、IL-6、IL-4、IL-12[8-11]。由于咽部是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)入侵機體的門戶，而咽黏膜中有大量肥大細胞分布，那么肥大細胞能否以PRR識別FMDV并被激活呢？

臨床研究證明，清除病毒感染不僅依賴高水平的中和抗體，而且還必須有活化CD8+T細胞參與。研究發(fā)現，口蹄疫病毒結構蛋白VP1富含T、B細胞抗原表位，既可刺激機體產生中和抗體，又可刺激機體產生對7種血清型FMDV具有交叉保護作用的CD8+T細胞應答[12]，VP4亦含T、B細胞抗原表位，且在不同血清型的FMDV中高度保守，可被多種單體型MHC分子識別[13]，并且研究表明樹突狀細胞可以通過MR和SR識別FMDV VP1-VP4蛋白[14]，故本試驗以重組FMDV VP1-VP4作為免疫原負載經TLR2/TLR4抑制劑OxPAPC[15]、MR抑制劑甘露聚糖[16]或SR抑制劑番瀉苷B[17]預處理的小鼠肥大細胞系P815，觀察其在不同時間的脫顆?，F象，檢測其分泌的TNF-α，以揭示肥大細胞對口蹄疫病毒結構蛋白的模式識別作用。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

小鼠肥大細胞系P815由河北大學免疫學教研室曹志然教授惠贈。10%胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司。TLR2和TLR4抑制劑OxPAPC購自Invivogen公司，清道夫受體抑制劑番瀉苷B(純度99%)購自成都曼斯特生物科技有限公司，甘露糖受體抑制劑甘露聚糖和甲苯胺藍購自Sigma公司，小鼠TNF-α ELISA試劑盒為eBioscience公司產品。

1.2 方法

1.2.1 重組FMDV VP1-VP4蛋白的制備 重組VP1-VP4的制備按本室報道的方法進行[18]。主要步驟如下：將陽性重組菌按1∶100的比例接種于含Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm=0.8～1.0。加入IPTG，30 ℃振搖誘導培養(yǎng)5 h。離心菌液棄上清，用PBS重懸后加入上樣緩沖液，離心，取上清液進行12% SDS-PAGE，回收目的蛋白VP1-VP4，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 肥大細胞培養(yǎng)與負載VP1-VP4蛋白濃度的確定 將生長良好的肥大細胞P815用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配成5×104·mL-1的細胞懸液，接種于放置有圓形蓋玻片的12孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于24 h分別用質量濃度為5、10、15和20 μg·mL-1的VP1-VP4蛋白負載，每個質量濃度和每個時相均設3個重復孔。

于負載后15、30、45和60 min用4%多聚甲醛(4 ℃)固定肥大細胞3 min，用PBS(pH 7.2)沖洗3次，然后置甲苯胺藍染液中30 s，快速水洗，并用300 mL·L-1乙醇-PBS(pH 7.2) 分色，用光學樹膠封片。在400倍放大的視野中隨機取5個視野，每個視野中隨機觀察30個肥大細胞，分別記錄體積增大和脫顆粒的肥大細胞數，以肥大細胞充分脫顆粒為活化指標[19]，確定活化肥大細胞所需的最佳VP1-VP4蛋白質質量濃度。

1.2.3 肥大細胞識別VP1-VP4模式識別受體的研究 由于肥大細胞的吞噬功能較弱，并且樹突狀細胞可通過MR和SR識別VP1-VP4[14，18]，所以我們假設TLR2、TLR4、MR和SR可能參與肥大細胞對VP1-VP4的識別。為此，在12孔細胞培養(yǎng)板每孔各接種5×104肥大細胞，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄上清。然后加入新配制的含不同抑制劑和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，每個時間點每種抑制劑均設三個重復孔，其中OxPAPC、甘露聚糖和番瀉苷B的濃度分別為30 μg·mL-1、3 mg·mL-1和0.23 mg·mL-1。作用1 h，按照1.2.2確定的最佳質量濃度加入VP1-VP4。上述處理組分別記為MC+OxPAPC+VP1-VP4、MC+Mannan+VP1-VP4和MC+番瀉苷B+VP1-VP4，同時設只負載VP1-VP4對照組(MC+VP1-VP4)及肥大細胞空白對照組(MC)。

于負載VP1-VP4蛋白后15、30、45、60 min，固定肥大細胞，進行甲苯胺藍染色，觀察肥大細胞的形態(tài)變化與脫顆?，F象。于負載VP1-VP4后0.5、1、6、12和24 h收集肥大細胞上清液，以3 000 r·min-1的轉速離心10 min，按照ELISA試劑盒說明書中的方法測定上清液中TNF-α的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學分析 將上述試驗所獲得的數據按照Two-way ANOVA進行統(tǒng)計分析，所用軟件為Graphpad Prism 5，以P<0.05為差異顯著，以P<0.01為差異極顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 負載VP1-VP4蛋白劑量的確定

由于肥大細胞脫顆粒被視為其在受到免疫原(immunogen)刺激后充分活化的標志[19]，故以脫顆粒為指標篩選活化肥大細胞所需負載的VP1-VP4蛋白用量。通過對甲苯胺藍染色的肥大細胞觀察發(fā)現，重組VP1-VP4可引起肥大細胞的脫顆粒(圖1A)。從圖1B可以看出，以15與20 μg·mL-1劑量的VP1-VP4蛋白負載肥大細胞后15 min，脫顆粒的細胞數量顯著大于對照組(P<0.05或P<0.001)，而5與10 μg·mL-1的劑量則不能充分誘導肥大細胞脫顆粒。然而至負載后45和60 min，小劑量的VP1-VP4蛋白也誘導了十分明顯的脫顆?，F象，與空白對照組有極顯著差異(P<0.001)。值得注意的是，15 μg·mL-1的VP1-VP4不僅可在第一時間引起肥大細胞脫顆粒，而且這種誘導作用呈現出隨時間延長而逐漸增強的變化。與此不同，20 μg·mL-1的VP1-VP4蛋白則可迅速誘導肥大細胞脫顆粒，但此后脫顆粒作用則無明顯變化，故將15 μg·mL-1劑量作為后續(xù)試驗負載肥大細胞的用量。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖1 重組VP1-VP4蛋白刺激肥大細胞脫顆粒的劑量確定Fig.1 Titration of the dosage of recombinant VP1-VP4 protein that stimulates mast cell degranulation

2.2 肥大細胞識別VP1-VP4的模式識別受體

大量試驗證明，細菌、病毒和真菌都可激活肥大細胞，根據活化肥大細胞的結構與功能變化，將活化作用分為脫顆粒和細胞因子分泌兩個時相，前者發(fā)生在早期，后者通常在脫顆粒后數小時發(fā)生，其中TNF-α是最早釋放的細胞因子之一[1，20]。

2.2.1 VP1-VP4負載經不同抑制劑處理的肥大細胞脫顆粒觀察 上述試驗證明，重組VP1-VP4蛋白可以活化肥大細胞。那么，肥大細胞是通過哪些模式識別受體識別FMDV VP1-VP4的呢？為此，用TLR2/4抑制劑、MR抑制劑和SR抑制劑阻斷肥大細胞利用這四種受體對VP1-VP4的識別，觀察負載VP1-VP4后肥大細胞的變化。結果顯示，體積增大的細胞數目在各個時相的不同處理組間均差異不顯著(P>0.05)(圖2A)。但抑制SR處理組在負載蛋白質15和30 min脫顆粒的肥大細胞數目均顯著低于 MC+VP1-VP4處理組(P<0.005或P<0.001)(圖2B)。若以活化細胞總數(即體積增大的細胞數目與脫顆粒的細胞數目之和)為指標，抑制SR處理組在負載蛋白質15 min極顯著低于MC+VP1-VP4處理組(P<0.01)，其他處理組雖然有不同程度的減少，但是與MC+VP1-VP4處理組差異不顯著(圖2C)，這表明肥大細胞在受到VP1-VP4刺激后發(fā)生脫顆?，F象主要是通過SR的模式識別所介導的。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖2 VP1-VP4負載經不同抑制劑處理的肥大細胞脫顆粒狀態(tài)Fig.2 The degranulation profile of mast cells triggered by VP1-VP4 after individual inhibitor treatments

2.2.2 VP1-VP4負載經不同抑制劑處理的肥大細胞分泌TNF-α的檢測 業(yè)已證明，肥大細胞可合成并儲存TNF-α，當其受到刺激時可迅速分泌，所以TNF-α分泌也被作為衡量肥大細胞活化的指標[5-6]。本試驗為探明TLR2、TLR4、MR和SR四種模式識別受體在VP1-VP4活化肥大細胞中的作用，先用相應的抑制劑阻斷這些受體，然后負載VP1-VP4，并在不同時間點收集上清液，用ELISA檢測不同抑制劑處理組肥大細胞上清液中TNF-α的含量。結果顯示，在0.5、1、6和12 h，四種受體抑制劑處理組與MC+VP1-VP4組及空白對照組的TNF-α含量相比差異不顯著。但是在24 h，各抑制劑處理組的TNF-α含量均極顯著低于MC+VP1-VP4組(P<0.001)，其中以MR抑制劑處理組含量最低，幾乎與空白對照組相同(圖3)。此結果表明，肥大細胞可能通過MR、TLR2/TLR4和SR識別FMDV VP1-VP4，從而引起肥大細胞分泌TNF-α，其中以MR介導的模式識別作用最強。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖3 不同處理組肥大細胞上清液中TNF-α的含量Fig.3 The contents of TNF-α in mast cell supernatants from every group

3 討 論

雖然對肥大細胞在機體抗感染免疫中作用研究歷史很短，但對肥大細胞在抗細菌免疫應答中的作用已經得到了廣泛的認可。然而，對肥大細胞在抗病毒免疫應答中的作用卻仍然了解很少[5，21]。盡管目前已經證實哺乳動物的肥大細胞可識別登革熱病毒、單純皰疹病毒、流感病毒、新城疫病毒、呼吸道合胞體病毒、仙臺病毒和腦心肌炎病毒等[9，22]，這些病毒或誘導肥大細胞脫顆粒，或刺激其分泌細胞因子、趨化因子和蛋白酶，但對于肥大細胞識別病毒的受體還知之甚少[5，6]，而且也未見肥大細胞通過模式識別受體感知FMDV的報道。

本研究將重組FMDV VP1-VP4蛋白負載小鼠肥大細胞系P815，發(fā)現其可以引起該細胞脫顆粒(圖1和圖2)，并在負載該蛋白質后24 h分泌TNF-α(圖3)，這表明FMDV VP1-VP4蛋白可以活化小鼠肥大細胞系P815，但誘導該細胞分泌TNF-α的時間卻明顯晚于其他病原體對肥大細胞的刺激[1，5]。由于TNF-α可促進樹突狀細胞的成熟，增強其抗原提呈功能，所以FMDV結構蛋白(即使用大劑量)延遲肥大細胞系P815分泌TNF-α的現象可能與滅活FMDV疫苗免疫保護誘導期長有關。值得注意的是，大劑量的VP1-VP4可以迅速激活P815，使其脫顆粒，而小劑量的VP1-VP4雖然在早期不能誘導其脫顆粒，但隨著負載時間的延長，其刺激鼠源肥大細胞系P815脫顆粒的作用甚至還強于大劑量的VP1-VP4。由于活化肥大細胞所釋放的生物介質是決定樹突狀細胞抗原提呈方向的重要因素[1，4-5]，所以該研究結果可能對科學設計與正確使用口蹄疫疫苗具有一定的指導意義。

為了探明VP1-VP4活化肥大細胞的觸發(fā)機制，本試驗利用OxPAPC抑制TLR2和TLR4，用番瀉苷B抑制清道夫受體，用甘露聚糖抑制甘露糖受體，然后負載VP1-VP4，并與正常肥大細胞進行比較，藉此明確肥大細胞識別VP1-VP4的模式識別受體。從圖2可以看出，阻斷SR可顯著抑制肥大細胞系P815脫顆粒，但對其分泌TNF-α的抑制作用很弱(圖3)。與此相反，阻斷MR則對該細胞分泌TNF-α的抑制作用十分明顯，而對肥大細胞系P815脫顆粒的抑制作用相對較弱。這提示SR是肥大細胞系P815識別VP1-VP4后觸發(fā)脫顆粒的主要受體，而MR則是肥大細胞系P815識別VP1-VP4后觸發(fā)分泌TNF-α的主要受體。然而我們注意到，雖然阻斷TLR2和TLR4處理組的脫顆粒肥大細胞數量與MC+VP1-VP4處理組差異不顯著，但是該組TNF-α的分泌水平卻在負載蛋白質后24 h極顯著低于MC+VP1-VP4處理組(圖2C和圖3)，這提示TLR2或TLR4可能與MR協(xié)同調節(jié)肥大細胞系P815識別FMDV VP1-VP4后的TNF-α分泌過程，盡管這種抑制作用弱于MR阻斷的效果。

需要指出的是，SR不僅是肥大細胞系P815識別VP1-VP4觸發(fā)脫顆粒的最主要受體，而且SR對VP1-VP4的識別也可促進其分泌TNF-α，這表明SR不僅是肥大細胞的吞噬性受體，而且也是介導信號轉導的模式識別受體。樹突狀細胞也表達SR、MR和TLR等受體，但樹突狀細胞通過SR和MR對口蹄疫病毒VP1-VP4的識別卻可抑制其抗原提呈功能[14，18]。因此如何協(xié)調肥大細胞與樹突狀細胞對VP1-VP4模式識別作用之間的關系，從而有效調動二者參與對FMDV的免疫應答將是一個很值得深入研究的課題。

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(編輯 白永平)

The Effectiveness of Mast Cell Pattern Recognition of Recombinant VP1-VP4 of Foot-and-mouth Disease Virus

LI Li-min#，WANG Yan#，CUI Bei-bei，LIN Min，ZHANG Lei，ZUO Yu-zhu，WANG Jia-xin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071000，China)

The objective of this study was designed to investigate the effectiveness of mast cell pattern recognition of recombinant VP1-VP4 of foot-and-mouth disease virus(FMDV).To this end，murine mast cell line P815 were pulsed with the recombinant VP1-VP4 of FMDV after inhibitors of Toll-like receptor 2/4(OxPAPC)，mannose receptors(Mannan)，and scavenger receptors(Sennoside B) were administered to murine mast cell line，respectively.Degranulation of P815 mast cells stained with toluidine blue was observed at the given time.And the levels of TNF-α in P815 mast cell culture supernatants were determined by ELISA at different timepoints.It was showed that the number of degranulated P815 mast cells with administration of scavenger receptor inhibitor was significantly lower than that of cells pulsed with recombinant VP1-VP4 protein at 15 min and 30 min(P<0.001).Intriguingly，the TNF-α release from the mast cell line activated by recombinant VP1-VP4 at 24 h was significantly blocked with three inhibitors(P<0.01)，of which，mannan，a mannose receptor inhibitor，showed the strongest inhibition on TNF-α release.Our data indicate that murine mast cell line P815 degranulation triggered by recombinant VP1-VP4 was predominantly mediated via the recognition of scavenger receptors,while the TNF-α release from the activated mast cells was constitutively initiated with the recognition of mannose receptors，TLR2，and TLR4.Of note，recognition of recombinant VP1-VP4 through mannose receptors plays a predominant role in triggering TNF-α release from P815 mast cells activated by recombinant VP1-VP4.

mast cell；pattern recognition receptor；recombinant FMDV VP1-VP4 protein；degranulation；TNF-α

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.021

2015-01-07

國家自然科學基金(31402174)；河北省預防獸醫(yī)學重點學科青年基金 (20130101)

李麗敏(1982-)，女，河北元氏人，講師，博士，主要從事免疫學教學與科研工作，E-mail:lilimin03@163.com；王 燕(1987-)，女，河北廣平人，碩士生，主要從事肥大細胞的模式識別研究，E-mail:wangyan871203@163.com。二人并列第一作者

*通信作者：王家鑫，教授，E-mail：mastwang@163.com

S852.4

A

0366-6964(2015)09-1644-06