張?zhí)炝?，?潤*，楊潤霞，魏 姣，萬學瑞，劉 霞，劉 磊，張小麗

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州 730070)

雞朊樣蛋白Doppel基因的克隆及其與PrPC相互關系分析

張?zhí)炝?，吳 潤1*，楊潤霞1，魏 姣1，萬學瑞1，劉 霞2，劉 磊1，張小麗1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州 730070)

克隆雞Doppel蛋白(ChDpl)基因(PRND)并初步分析其與正常細胞型朊蛋白(PrPC)的相互關系，為禽源Dpl結構與功能、Dpl與PrPC互作關系機制的研究提供理論依據(jù)與分子基礎；以多物種Dpl氨基酸序列為基礎，通過比對找到Dpl氨基酸序列保守區(qū)，設計簡并引物并依據(jù)雞的密碼子偏好性對引物進行優(yōu)化，以逐步降低其簡并性。用此特異性引物以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增雞PRND基因，并將其克隆到pMD-18-T載體，鑒定后將序列上傳GenBank數(shù)據(jù)庫。結合Dpl與PrPC相關研究初步分析兩者的相互關系；多物種Dpl氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，第11—150位(139個氨基酸殘基)為Dpl氨基酸序列保守區(qū)，以此區(qū)域設計引物并進行PCR擴增，得到約417 bp的目的條帶，GenBank登錄號為KP140962。綜合分析PrPC與Dpl相關研究發(fā)現(xiàn)，盡管Dpl與PrPC具有相似的翻譯后修飾和空間結構，但兩者多表現(xiàn)為拮抗作用，即PrPC能夠拮抗Dpl的神經(jīng)毒作用，尤其是其N-端包含八肽重復區(qū)的第23—88位殘基對于保護Purkinje細胞免受Dpl誘導的神經(jīng)退化作用至關重要。禽源Dpl的成功克隆不僅填補了目前研究的空白，更在分子水平為后續(xù)研究Dpl結構與功能及其與PrPC的拮抗機制奠定了基礎。

雞；Doppel蛋白；PrPC；拮抗

作為PrPC的同系物，Dpl蛋白與PrPC相似，也是一種帶有GPI錨的膜糖蛋白，且均由前體蛋白經(jīng)歷一系列修飾過程形成[1]。其編碼基因PRND位于PRNP下游約16 kb(人位于27 kb)處。雖然Dpl與PrPC氨基酸序列相似性僅約23%[1]，但兩者翻譯后修飾及空間結構卻非常相似，并且均具有相似的C-端結構域，即由3個α-螺旋和2個β-折疊以及2個糖基化位點組成[2]。然而，越來越多的試驗數(shù)據(jù)已證明PrPC與Dpl非但不是協(xié)同作用，而且兩者還表現(xiàn)出拮抗作用。研究發(fā)現(xiàn)，PrPC的N-端八肽重復區(qū)可與Ca2+結合，發(fā)揮抗氧化作用[3]，而Dpl缺失該區(qū)域。有學者通過構建N-端缺失PrPC轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)N-端包含八肽重復區(qū)在內(nèi)的第23—88個氨基酸殘基對于拮抗Dpl的神經(jīng)毒作用至關重要，該區(qū)域的缺失將導致小鼠共濟失調(diào)和Purkinje細胞的退化[4]，因此PrPC的N-端結構域?qū)τ谵卓笵pl的神經(jīng)毒性作用具有重要的意義。另外Dpl由于比PrPC多一個二硫鍵而趨于穩(wěn)定，這也許是Dpl并不能轉(zhuǎn)變成像PrPSc一樣的致病形態(tài)的原因。目前，大多Dpl相關研究均集中在哺乳動物，而對于禽源Dpl的研究目前還處于空白。本研究擬通過生物信息學方法探索多物種Dpl的氨基酸序列保守區(qū)，設計簡并引物并根據(jù)研究對象(雞)的密碼子偏好性優(yōu)化并降低其簡并性，以克隆雞PRND基因為起始，初步掌握禽源Dpl的核苷酸序列，為進一步研究其氨基酸序列、蛋白質(zhì)高級結構及功能區(qū)提供理論依據(jù)，并為將來進行禽源Dpl與PrPC拮抗機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 血樣

無菌采取10只成年健康青腳麻雞新鮮血液，以抗凝劑(100 mL溶液中含檸檬酸0.48 g、檸檬酸三鈉1.32 g、葡萄糖1.47 g)抗凝，抗凝劑與血液體積比為1∶5。采樣地點為甘肅省康樂縣某雞場。

1.2 試劑

全血基因組DNA提取試劑盒購自捷瑞生物工程(上海)有限公司；PremixTaq酶、pMD-18-T、IPTG、氨芐青霉素、DNA Marker DL2000/DL750等購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物為OXOID公司產(chǎn)品；瓊脂粉(AGAR)購自日本公司；DNA片段快速膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 雞全血基因組總DNA的提取

全血DNA提取按捷瑞公司基因組提取試劑盒方法進行。

1.4 多種生物Dpl氨基酸保守序列分析

在NCBI Protein數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中獲得14個物種的Dpl氨基酸序列，包括瘤牛(Bosindicus)AFI78991.1、普通牛(Bostaurus)AFI79095.1、印度水牛(Bubalusbubalis)XP_006047817.1、家犬(Canislupusfamiliaris)XP_005634877.1、山羊(Caprahircus)AAO44923.1、豚鼠(Caviaporcellus)XP_003476454.1、馬(Equuscaballus)NP_001085006.1、貓(Feliscatus)XP_006929990.1、人(Homosapiens)AAQ89344.1、食蟹猴(Macacafascicularis)XP_005568469.1、小鼠(Musmusculus)AAH25140.1、綿羊(Ovisaries)ABD63006.1、蹄兔(Procaviacapensis)AAM94873.1、野豬(Susscrofa)XP_003359928.1。這些氨基酸序列經(jīng)BioEdit、DNAMAN、MEGA 6.0等軟件比對與分析獲得Dpl氨基酸的保守區(qū)序列(圖1)。

圖1 14個物種PRND基因氨基酸保守區(qū)Fig.1 Conserved amino acid region of 14 species PRND gene

1.5 以Gallusgallus(雞)密碼子偏好性反向推導保守區(qū)氨基酸的DNA序列

在獲得Dpl氨基酸保守區(qū)序列后，經(jīng)Vector NTI軟件Back Translation功能，以Gallusgallus密碼子偏好性反向推導保守區(qū)氨基酸的DNA序列(圖2)。

1.6 引物的設計與合成

首先以氨基酸序列經(jīng)Primer Premier 5.0、Primer Select等軟件設計簡并引物(P1)，再以Back Translation推導的DNA序列為模板，根據(jù)雞的密碼子偏好性進行優(yōu)化以降低引物簡并性(P2)(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖2 以Gallus gallus密碼子偏好性反向推導第11-150位氨基酸的DNA序列Fig.2 Reverse deduced DNA sequence of 11-151 amino acids section with Gallus gallus codon preferences

表1 引物信息

Table 1 Information of primers

引物名Primername序列(5′?3′)Sequence(5′?3′)Tm值Tmvalue產(chǎn)物長度/bpProductlengthP1上游Upstream下游DownstreamGCYRWYKTNVHTCCRKMRSWYNARKTCSCANKVCTRNSGKVSHS45．444．5417P2上游Upstream下游DownstreamGCCATCGTGTGCATCCTGCTGTTGAAGTCGCAGTGCTTGGTGCTGC62．862．9417

M=A/C R=A/T W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/C/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T

1.7 目的基因的PCR擴增

首先引物P1以DNA為模板序列進行溫度梯度PCR擴增，得到目的條帶較亮的溫度范圍。再以優(yōu)化后的引物擴增目的條帶。PCR體系(25 μL)：PremixTaq12.5 μL、DNA (50 pmol·L-1)1.0 μL、上下游引物各1.0 μL(10 pmol·L-1)、ddH2O 9.5 μL。反應條件：第一步，94 ℃ 5 min；第二步，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共進行30個循環(huán)；第三步，72 ℃ 10 min。在BIO-RDA MyCyclerTM Thermal Cycler EN-61010 PCR儀上進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 克隆與重組質(zhì)粒的測序

連接體系：Solution I 4.8 μL、pMD-18-T 0.6 μL、目的DNA 5 μL；程序：16 ℃ 2 h、4 ℃ 12 h(過夜)、10 μL體系加50 μL DH5α感受態(tài)細胞、冰浴30 min、42 ℃熱激45 s、冰浴1 min、加890 μL LB培養(yǎng)基(無Amp+)、37 ℃ 220 r·min-1搖床培養(yǎng)1 h、5 000 r·min-1離心5 min，棄上清(留50 μL左右)、吹打(輕)混勻后取30 μL涂布于100 μg·mL-1Amp+的LB平板先正面放置，待吸收后倒置培養(yǎng)，待菌落長好后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基(100 μg·mL-1Amp+)培養(yǎng)12～16 h，菌液PCR鑒定后送于華大基因科技測序。鑒定后向NCBI上傳所得序列。

1.9 測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫序列比對

GenBank數(shù)據(jù)庫下載序列如下：Ailuropodamelanoleuca(XM_002924821.1)、Canislupusfamiliaris(XM_005634820.1)、Caviaporcellus(AY130773.1)、Condyluracristata(XM_004687375.1)、Elephasmaximus(AY130770.1)、Homosapiens(AK313404.1)、Homosapiens(EU009729.1)、Jaculusjaculus(XM_004661445.1)、Nomascusleucogenys(XM_003277983.2)、Oryctolaguscuniculus(XM_008256271.1)、Otolemurgarnettii(XM_003788035.1)、Pteropusalecto(XM_006921622.1)、Sorexaraneus(XM_004610986.1)、Tarsiussyrichta(XM_008068920.1)、Vicugnapacos(XM_006207355.1)。

2 結 果

2.1 最佳退火溫度的摸索與引物的優(yōu)化

首先以引物P1進行溫度梯度PCR(40～65 ℃)獲得最佳退火溫度范圍(55～58 ℃)(圖3)；再以經(jīng)過不同程度優(yōu)化的引物擴增目的條帶，得到特異性引物P2(圖4)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準DL750；1～8.40～65 ℃溫度梯度PCR產(chǎn)物M.DNA marker DL750; 1-8.PCR products in the temperature gradient 40-65 ℃圖3 引物P1以全血DNA為模板溫度梯度擴增目的片段Fig.3 Amplify target fragment with whole blood DNA as template by primer P1

1～6.從P1到P2逐漸降低引物簡并性1-6. Reduce primer’s degeneracy gradually from P1 to P2圖4 以逐漸降低簡并性的引物擴增目的片段Fig.4 Amplify target fragment with primer reduced degeneracy by degree

2.2 目的基因的PCR擴增

以優(yōu)化后的引物P2進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得約417 bp的預期目的產(chǎn)物(圖5)。

2.3 菌液PCR鑒定及序列測定

對克隆菌液進行PCR鑒定，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖6)。將菌液送于華大基因進行測序，測序結果提交GenBank(登錄號為：KP140962)。測序結果顯示，此次克隆所得序列長度為417 bp，可編碼139個氨基酸，在254 bp處存在PstⅠ酶切位點。

1～4. PCR產(chǎn)物；M. DNA相對分子質(zhì)量標準DL20001-4. PCR products; M. DNA marker DL2000圖5 引物P2擴增目的片段Fig.5 Amplify target fragment with primer P2

1、2. PCR產(chǎn)物；M. DNA相對分子質(zhì)量標準DL7501,2. PCR products; M. DNA marker DL750圖6 ChPRND克隆菌液PCR鑒定Fig.6 PCR identification of ChPRND clone bacteria

3 討 論

Doppel蛋白(Dpl)、Shaddo蛋白(Sho)和朊病毒(PrPC)均屬于朊蛋白家族[5]。Dpl與細胞型朊蛋白(PrPC)之間盡管有結構和生化相似性[1,6-8]，但越來越多的證據(jù)表明兩種蛋白間只有較小的功能相似性[5,9-10]。相反地，PrPC與 Dpl間存在一種活躍的拮抗作用[1]。Dpl基因的表達已在脊椎動物中得到廣泛確認，包括魚類、四足動物[11-13]、牛、羊[14]、山羊[15]、小鼠和人[1,16]，且存在高度保守區(qū)域，這表明Dpl是一種保守蛋白質(zhì)。然而，目前仍鮮有人了解Dpl的生理功能。據(jù)報道，PRND過表達，尤其在PrPC敲除(PrPC0/0)小鼠中，會導致小腦小葉中發(fā)生Purkinje細胞損失及進行性共濟失調(diào)[1,17-18]和外周神經(jīng)的脫髓鞘[19]，這表明Dpl在PrPC缺失時，會模擬神經(jīng)退行性疾病樣誘導神經(jīng)致病性損傷。然而，當PrPC存在時，其會拮抗Dpl的神經(jīng)毒作用，尤其是N-端包含八肽重復區(qū)在內(nèi)的第23—88位氨基酸殘基發(fā)揮著重要的作用。以往的研究也進一步表明，Dpl在神經(jīng)元N2a細胞中通過一種線粒體依賴機制誘導細胞凋亡[9]。PRND的誘變研究表明，αB/B′-loop-C區(qū)是Dpl-誘導細胞凋亡的核心因素[20]。

此外，研究結果顯示，Dpl蛋白在多種腫瘤病中發(fā)揮作用。其中包括星形細胞瘤、胃腺癌、間變性腦膜瘤[21]、急性髓細胞性白血病(acute myelocytic leukemia，AML)和骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)[22]。盡管PRND基因在這些癌癥中的參與機制仍有待闡明，但多項研究結果表明PRND基因可能是一種腫瘤標記物或用于治療的潛在新靶標[21]。S.Comincini等[21]研究了原發(fā)和繼發(fā)性星形細胞瘤患者不同病理分級組織中及人工培養(yǎng)星形細胞瘤細胞系中的PRND和Dpl表達，發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)中PRND及相應Dpl蛋白高水平表達，這種表達似乎與GBM的惡性腫瘤相關。進一步研究了6例胃腺癌樣品和6例間變性腦膜瘤樣品中的PRND在表達，也發(fā)現(xiàn)PRND高水平表達[23]。E.Travaglino等[22]也發(fā)現(xiàn)，雖然Dpl蛋白在健康受試者骨髓中幾乎檢測不到或根本不表達，但其在白血病和MDS患者的骨髓樣本中卻被表達。此外，Dpl在正常骨髓標本中的表達僅限于CD34+干細胞，且在干細胞分化中被下調(diào)。這些研究表明，有必要進一步作Dpl在星形細胞瘤、胃腺癌、間變性腦膜瘤、急性髓細胞性白血病和骨髓增生異常綜合征發(fā)生和發(fā)展中的作用研究，Dpl可能成為一種用于診斷和治療的候選靶標。

本研究以前人研究為基礎，通過比對獲得多物種Dpl氨基酸序列保守區(qū)，設計簡并引物并克隆獲得雞Dpl保守區(qū)核苷酸序列，其大小為417 bp，與所得保守區(qū)氨基酸序列長度(139個氨基酸殘基)相吻合，說明Dpl與PrP類似，同樣具有高度保守性。實驗所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)其與鼴鼠、鼩鼱親緣關系最近，與人類處于不同的進化分支(圖7)，這與種源關系相符?？傊?，Dpl自發(fā)現(xiàn)以來已逐漸露出其神秘面紗，無論是研究其與PrPC在氨基酸序列、蛋白質(zhì)結構及亞細胞定位上的相似性及兩者生物學功能上的拮抗作用，都需要全面、深入的了解其基因序列與蛋白結構特征。

圖7 多種生物PRND系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of multi-creatures’ PRND

4 結 論

通過比對查詢多物種Dpl氨基酸保守區(qū)，設計并優(yōu)化引物克隆得到雞PRND基因保守區(qū)序列(417 bp)，并經(jīng)Dpl與PrPC相互關系分析發(fā)現(xiàn)，PrPC具有拮抗Dpl神經(jīng)毒作用，尤其是N-端第23—88位氨基酸殘基。以RACE方法獲取雞PRND全長并對Dpl氨基酸序列、蛋白質(zhì)高級結構特征、功能區(qū)進行分析，禽源Dpl與PrPC拮抗機制的研究將成為后續(xù)工作。

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(編輯 白永平)

Clone of Chicken Prion-likeDoppelGene and the Analysis of Its Interrelation with PrPC

ZHANG Tian-liang1，WU Run1*，YANG Run-xia1，WEI Jiao1，WAN Xue-rui1， LIU Xia2，LIU Lei1，ZHANG Xiao-li1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China； 2.CollegeofLifeScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

This study aimed to clone the chicken Doppel protein (ChDpl) gene (PRND)，preliminary analyze its relationship with the normal cellular prion protein (PrPC)，and to provide a theoretical and molecular basis for the research of avian Dpl structure and function，and the mechanism of the interaction relationship between Dpl and PrPC.Based on the amino acid sequence of multi-species Dpl，the conserved region of Dpl amino acid sequence was found，and the degenerate primers and optimize primers were designed with chicken codon preference to reduce the degeneracy gradually.ChickenPRNDgene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) with the specific primers，and then was inserted into pMD-18-T vector.The sequence was uploaded to the GenBank database after identified.Besides，the relationship between Dpl and PrPCwas analyzed.Through the alignments of multi-species Dpl’s amino acid sequence，we found that the section 11-150 bits (140 amino acid residues) was the conserved region of Dpl’s amino acid sequence，by designing primers with this area and PCR amplification，we obtained about 417 bp target band，its GenBank accession number was KP140962.Through comprehensively analysis of the related researches of Dpl and PrPC，we found that although Dpl and PrPChave a similar post-translational modifications and spatial structure，they mostly show antagonism，namely PrPCcan antagonize the neurotoxicity of Dpl，especially the 23-88 th residues of its N-terminal peptide containing octapeptide repeat region are crucial for the protection of Purkinje cells from Dpl induced neurodegeneration.The successful cloning of avian Dpl not only fills the gaps of current researches，even more at the molecular level laid a foundation for further study of the structure and function of Dpl and its antagonistic mechanism with PrPC.

chicken；Doppel protein；PrPC；antagonize

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.019

2014-11-25

國家自然科學基金資助項目(31160510)；甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1107RJZA198)

張?zhí)炝?1988-)，男，甘肅天水人，碩士生，主要從事雞朊蛋白及朊樣蛋白研究，E-mail：382598970@qq.com

*通信作者：吳 潤，男，教授，博士生導師，E-mail：wurun@gsau.edu.cn

S852.659.7

A

0366-6964(2015)08-1425-07